Метыленавы сіні і аксід азоту: NOS, cGMP і сасудзістая сігналізацыя

Пытанне гучыць проста: ці інгібіруе метыленавы сіні аксід азоту? У лабараторыі яно распадаецца на чатыры асобныя пытанні, і кожнае патрабуе сваёй эксперыментальнай праверкі. Іх блытаніна — галоўная прычына таго, што тэксты пра метыленавы сіні і аксід азоту гучаць упэўнена, але застаюцца расплывістымі.

Уявіце сігнал аксіду азоту як ланцуг з чатырох звёнаў. Ген транскрыбуецца, каб утварылася сінтаза аксіду азоту. Фермент ператварае аргінін у аксід азоту. Газ дыфундуе да сваёй мішэні, перш чым уступіць у рэакцыю з чымсьці іншым. Растваральная гуанілатцыклаза выяўляе яго і ўтварае цыклічны GMP. Апублікаваныя даследаванні паказваюць эфекты метыленавага сіняга на кожным звяне, але гэтыя даныя атрыманы на розных эксперыментальных мадэлях, пры розных канцэнтрацыях і з рознымі ізаформамі. Вынік на адным звяне не даказвае дзеяння на іншым.

Кананічны ланцуг простымі словамі

У сценцы крывяноснай сасуды стандартная паслядоўнасць выглядае так. Стымул уздзейнічае на эндатэліяльную клетку. Эндатэліяльная сінтаза аксіду азоту, якую называюць eNOS або NOS3, утварае невялікі імпульс аксіду азоту. Газ дыфундуе ў суседнюю гладкамышачную клетку, звязваецца з гемам растваральнай гуанілатцыклазы, які змяшчае адноўленае жалеза, і паскарае ператварэнне GTP у цыклічны GMP. Цыклічны GMP актывуе пратэінкіназу G, рэгуляцыя кальцыю змяняецца, і мышца расслабляецца.

Ёсць і другі ланцуг, які варта разглядаць асобна. Падчас інфекцыі або пад уздзеяннем цытакінаў клеткі транскрыбуюць ген іншага ферменту — індуцыбельнай сінтазы аксіду азоту, або iNOS, якую таксама называюць NOS2. Яна стварае больш інтэнсіўныя і працяглыя патокі аксіду азоту, чым eNOS. Трэцяя ізаформа, нейрональная NOS, або nNOS, адносіцца да яшчэ аднаго кантэксту. Калі ў артыкуле згадваецца сінтаза аксіду азоту без удакладнення ізаформы, спыніцеся і праверце, якую менавіта вымяралі. Агляд таго, як метыленавы сіні пераносіць электроны, падкрэслівае тое самае для акісляльна-аднаўленчых мішэняў у цэлым: пераносчык сам па сабе нічога не робіць, а вынік вызначаюць партнёры на кожным канцы пераносу.

Вымераны цыклічны GMP — таксама інтэграваны паказчык, а не прамы аналіз актыўнасці ферменту. Яго ўзровень адлюстроўвае сінтэз цыклазай за вылікам расшчаплення фасфадыэстэразамі, асабліва PDE5 у гладкіх мышцах сасудаў. Таму падзенне ўзроўню цыклічнага GMP азначае, што да дэтэктара дайшло менш сігналу. Само па сабе яно не паказвае, якое звяно дало збой.

Звяно 1: утвараецца менш ферменту iNOS

У мышыных макрафагах, стымуляваных бактэрыяльным ліпапаліцукрыдам, інтэрферонам гама або абодвума, метыленавы сіні прадухіляў чаканае павелічэнне колькасці бялку iNOS і моцна прыгнятаў матрычную РНК iNOS у эксперыментах па транскрыпцыі ў макрафагах. Асабліва паказальна тое, што не змянілася. Дэградацыя інгібітару I капа B альфа, фасфараляванне NF капа B і STAT1 і перамяшчэнне гэтых фактараў у ядро ў асноўным захоўваліся. Зніжалася іх звязванне з ДНК, што пацвердзіла імунапрэцыпітацыя храматыну: яна паказала меншую занятасць прамотара iNOS гэтымі фактарамі.

Гэта ўплыў на рэгуляцыю генаў, які папярэднічае змяненню колькасці ферменту, а не неадкладная блакада ўжо наяўнага ферменту. Ён адносіцца да запаленчай сігналізацыі, дзе фактары транскрыпцыі павінны звязацца з прамотарам да з'яўлення бялку. Гэты вынік нічога непасрэдна не кажа пра канстытутыўную eNOS у сасудзе ў стане спакою, і апісваць яго трэба менавіта ў такіх межах.

Звяно 2: наяўны фермент NOS працуе павольней

Даследаванне на пацуках правярала іншы ўзровень. Самцам пацукоў у свядомасці ўводзілі ліпапаліцукрыд нутравенна, а праз тры гадзіны — фізіялагічны раствор або метыленавы сіні ў дозе 3 мг на кг нутравенна. Актыўнасць сінтазы аксіду азоту ў медыяльна-базальным гіпаталамусе вымяралі па ператварэнні мечанага аргініну ў цытрулін у даследаванні актыўнасці NOS у гіпаталамусе. Самі па сабе стрэс і фізіялагічны раствор выклікалі пэўную кальцый-незалежную актыўнасць, а ліпапаліцукрыд павышаў яе прыкладна да дзесяціразовага кантрольнага ўзроўню. Метыленавы сіні ліквідаваў абодва індукаваныя кампаненты. Кальцый-залежная канстытутыўная актыўнасць у гэтай тканцы пры гэтай дозе і ў гэты момант часу не змянялася.

Чытайце гэты вынік дакладна так, як ён сфармуляваны: пры гэтых умовах вымераная актыўнасць тыпу iNOS была прыгнечана. Гэта не вымярэнне экспрэсіі генаў і не доказ нязменнай селектыўнасці да iNOS у параўнанні з eNOS або nNOS. Даследаванні вычышчаных ферментаў яшчэ выразней паказваюць неабходнасць асцярожнасці. У прамых аналізах вычышчанай сінтазы аксіду азоту метыленавы сіні цалкам блакаваў утварэнне цытруліну пры 30 мікрамоль/л. Канцэнтрацыя паўмаксімальнага інгібіравання складала каля 5.3 мікрамоль/л без супераксіддысмутазы і 9.2 мікрамоль/л з ёй, як паведамляецца ў параўнанні вычышчаных NOS і гуанілатцыклазы. Асобнае даследаванне вычышчанай nNOS паказала на ўдзел акіслення гему, звязанага з ферментам. Практычная выснова такая: прамое інгібіраванне NOS сапраўды існуе ў ізаляваных сістэмах, але вынік для гіпаталамуса нельга пашыраць да агульнага сцвярджэння, што метыленавы сіні паўсюль пакідае ўсе канстытутыўныя NOS непашкоджанымі.

Звяно 3: аксід азоту губляецца, перш чым дасягне мішэні

Найбольш нагляднае сведчанне таго, што зніжэнне цыклічнага GMP можа тлумачыцца не толькі блакадай ферменту, атрымана на культываваных гладкамышачных клетках лёгачнай артэрыі труса. Схема эксперыменту цалкам абыходзіла эндагенную NOS: донары аксіду азоту дадавалі непасрэдна, а затым правяралі, ці працягвае метыленавы сіні прыгнятаць адказ цыклічнага GMP у даследаванні супераксіду ў гладкіх мышцах сасудаў.

Тры донары выпрабоўвалі пры канцэнтрацыях ад 1 да 100 мікрамоль/л: S-нітраза-L-цыстэін, нітрапрусід натрыю і стабільны дэзамінаваны аналаг пад назвай MPANO. Усе яны павышалі ўзровень цыклічнага GMP прыкладна ў 1.5–12 разоў. Метыленавы сіні пры 10 мікрамоль/л інгібіраваў адказ на першыя два на 51–100 працэнтаў, але пакідаў адказ на MPANO нязменным. Калі б метыленавы сіні проста блакаваў каталітычны цэнтр цыклазы, такую селектыўнасць адносна донараў было б цяжка растлумачыць, бо ўсе тры дзейнічаюць праз адзін і той жа фермент далей па сігнальным ланцугу.

Затым тры кантрольныя праверкі звязалі механізм з супераксідам. Па-першае, утварэнне пазаклетачнага супераксіду з дапамогай ксанціну і ксанцінаксідазы ўзнаўляла тую самую карціну: адказ на CYSNO і нітрапрусід блакаваўся, а на MPANO захоўваўся. Па-другое, метыленавы сіні выклікаў залежнае ад дозы і часу ўтварэнне супераксіду гладкамышачнымі клеткамі, якое вымяралі па аднаўленні цытахрому c. Па-трэцяе, супераксіддысмутаза цалкам прадухіляла інгібіраванне, а каталаза — не. Гэта паказвае на супераксід, а не пераксід вадароду як непасрэдна адказную хімічную часціцу ў гэтай эксперыментальнай мадэлі.

Варыянт эксперыменту з сумеснай культурай варта апісаць, бо ён паказвае, дзе менавіта ўзнікае эфект. Эндатэліяльныя клеткі на покрыўных шкельцах ненадоўга культывавалі разам з гладкамышачнымі клеткамі, і эндатэліяльны фактар, які выдзяляўся ў базальных умовах, павышаў цыклічны GMP у гладкіх мышцах у тры–восем разоў. Папярэдняя апрацоўка любога з двух клетачных кампанентаў метыленавым сінім аслабляла гэты сігнал, а супераксіддысмутаза часткова кампенсавала эфект папярэдняй апрацоўкі эндатэлію. Іншымі словамі, метыленаваму сіняму зусім не абавязкова дзейнічаць унутры гладкамышачнай клеткі-дэтэктара. Ён можа аслабляць сігнал, выдаляючы сігнальную малекулу падчас яе перамяшчэння. Дапаможнік па чытанні даследаванняў метыленавага сіняга разглядае гэта як агульнае правіла: перш чым называць малекулярную мішэнь, укажыце кампартмент, у якім адбылося ўздзеянне.

Называць гэта інгібіраваннем NOS было б няправільна. Для дзеяння донараў этап з удзелам сінтазы не патрабаваўся, але сігнал усё роўна аслабляўся.

Звяно 4: сам дэтэктар рэагуе слабей

Прамыя эфекты на растваральную гуанілатцыклазу існуюць, але канцэнтрацыі маюць значэнне. У згаданым вышэй параўнанні вычышчаных ферментаў для паўмаксімальнага інгібіравання цыклазы, стымуляванай аксідам азоту, патрабавалася каля 60 мікрамоль/л метыленавага сіняга, тады як для NOS — каля 5–9 мікрамоль/л. Нават 1 мілімоль/л выклікаў толькі частковую максімальную блакаду. Гэта прыкладна шасці–адзінаццаціразовая розніца. Таму клетачны эксперымент з нізкімі мікрамалярнымі канцэнтрацыямі, у якім зніжаецца цыклічны GMP, нельга называць селектыўным інгібіраваннем цыклазы толькі на падставе значэння цыклічнага GMP.

Пазнейшае даследаванне акісляльна-аднаўленчых працэсаў дадало яшчэ адну падставу для асцярожнасці: метыленавы сіні дэактываваў цыклазу, актываваную аксідам азоту, праз механізм, адрозны ад простага акіслення жалеза гему паветрам. Такім чынам, праца дэтэктара можа парушацца, але хімічны механізм яшчэ не высветлены канчаткова. Розніца ў канцэнтрацыях азначае, што пры ўздзеянні нізкіх мікрамалярных канцэнтрацый спачатку варта выключыць эфекты супераксіду і NOS. Тут жа неабходны кантроль ролі фасфадыэстэраз. Калі расшчапленне не вымяралі або не блакавалі, меншае назапашванне цыклічнага GMP можа адпавядаць меншаму сінтэзу, хутчэйшай дэградацыі або абодвум працэсам.

Чаму гэта не зводзіцца да аднаго сцвярджэння пра артэрыяльны ціск

Кожнае звяно было ўстаноўлена ў іншай сістэме. Транскрыпцыя ў макрафагах — не тое самае, што актыўнасць ферменту ў гіпаталамусе. Актыўнасць у гіпаталамусе пасля ліпапаліцукрыду — не тое самае, што тонус эндатэлію ў стане спакою. Эндатэліяльны фактар, які выдзяляецца ў базальных умовах у сумеснай культуры, — не тое самае, што вазадылатацыя, стымуляваная аганістам. Культываваныя клеткі лёгачнай артэрыі пры 10 мікрамоль/л метыленавага сіняга — не сістэма кровазвароту чалавека. Зводзячы іх да сцвярджэння кшталту «метыленавы сіні павышае артэрыяльны ціск, блакуючы аксід азоту», мы адкідаем менавіта тыя адрозненні, для захавання якіх і былі распрацаваны кантрольныя праверкі.

Тры праверкі дапамагаюць захаваць карэктнасць тлумачэння. Па-першае, называйце ізаформу: eNOS для сасудзістага тонусу ў стане спакою, iNOS для індукаванага запаленнем патоку, nNOS для нейрональных сістэм і некаторых даследаванняў вычышчаных ферментаў. Па-другое, указвайце, як паступае сігнал аксіду азоту: праз эндагенны сінтэз, базальнае выдзяленне эндатэліем або канкрэтны донар, такі як CYSNO, нітрапрусід ці MPANO, бо стабільны донар быў устойлівы да метыленавага сіняга, а лабільныя — не. Па-трэцяе, указвайце канцэнтрацыю і тое, што аднаўляла адказ: аднаўленне з дапамогай супераксіддысмутазы паказвае на ўдзел супераксіду; неэфектыўнасць каталазы сведчыць супраць ролі пераксіду вадароду ў гэтай мадэлі; узнаўленне эфекту ксанцінаксідазай паказвае яго дастатковасць; а аналізы вычышчаных ферментаў аддзяляюць прамыя эфекты на каталіз ад страты сігналу падчас перамяшчэння.

Кароткае абагульненне такое. Метыленавы сіні лепш разглядаць як рэчыва, якое парушае сігналізацыю ад аксіду азоту да цыклічнага GMP на некалькіх участках, а не як селектыўны блакатар цыклазы. У залежнасці ад эксперыментальнай мадэлі і канцэнтрацыі ён можа змяншаць звязванне фактараў транскрыпцыі iNOS, непасрэдна інгібіраваць ферменты NOS, зніжаць даступнасць аксіду азоту праз утварэнне супераксіду і парушаць працу цыклазы, актываванай аксідам азоту. Матэрыялы пра ролю сігналізацыі цыклічнага GMP у сасудзістых даследаваннях і параўнанне донараў аксіду азоту, якія выкарыстоўваюцца ў клетачных аналізах больш падрабязна разглядаюць асобныя галіны гэтага працэсу, а матэрыял пра метады аддзялення акісляльна-аднаўленчых эфектаў ад эфектаў на ферменты тлумачыць, чаму спалучэнне супераксіддысмутазы, каталазы і кантрольнага стабільнага донара так часта сустракаецца ў гэтай літаратуры.

Нізкае значэнне цыклічнага GMP пасля ўздзеяння метыленавага сіняга паказвае, што ланцуг разарваны. Толькі кантрольныя праверкі паказваюць, якое звяно разарвалася.