Тлумачэнне шчолачнага і паліхромнага метыленавага сіняга Лёфлера

На стале для афарбоўвання могуць стаяць побач тры бутэлькі, кожная з якіх пазначана як нейкі варыянт метыленавага сіняга. На адной напісана: водны метыленавы сіні 1%. На другой — шчолачны метыленавы сіні Лёфлера. На трэцяй — паліхромны метыленавы сіні. Заняты супрацоўнік бярэ тую, што стаіць найбліжэй. Затым мазок афарбоўваецца занадта слаба, занадта аднастайна ў сіні колер або набывае нечаканыя фіялетавыя адценні, а няўдалы вынік спісваюць на ўзор.

Праблема тут у рэцэптуры, а не ва ўзоры. Гэтыя тры растворы ўтрымліваюць роднасныя фарбавальнікі, але грунтуюцца на розных прынцыпах афарбоўвання. Адзін — звычайны катыённы фарбавальнік пры амаль нейтральным pH. Другі — той самы фарбавальнік, дзеянне якога ўзмоцнена шчолаччу. Трэці ўжо ўвогуле не з'яўляецца адным фарбавальнікам: гэта сумесь, атрыманая мэтанакіраваным акісленнем. Калі ўзяць не той раствор, прынцып афарбоўвання зменіцца проста падчас працы.

Кароткі адказ

Звычайны водны метыленавы сіні — гэта зыходны варыянт: каля 1% фарбавальніка ў вадзе, просты катыённы фарбавальнік для вывучэння марфалогіі бактэрый і агульнай мікраскапіі. У шчолачным метыленавым сінім Лёфлера да спіртавога зыходнага раствору, разведзенага вадой, дадаюць невялікую дакладна адмераную колькасць разведзенай шчолачы. Гэта павышае pH і ўзмацняе звязванне катыённага фарбавальніка з кіслымі структурамі бактэрый. Паліхромны метыленавы сіні — гэта метыленавы сіні, які мэтанакіравана падверглі выспяванню шляхам акіслення ў шчолачным асяроддзі. Таму ў бутэльцы знаходзіцца сумесь дэметыляваных гамолагаў (азур A, azure B, азур C), тыяніну і метыленавага фіялетавага разам з рэшткавым метыленавым сінім, і гэтая сумесь афарбоўвае розныя структуры ў розныя адценні.

Калі запомніць толькі адзін сказ: падшчолачванне змяняе інтэнсіўнасць афарбоўвання, а паліхрамаванне — яго колеры.

Звычайны водны метыленавы сіні: зыходны варыянт

Найпрасцейшая рэцэптура — метыленавы сіні, раствораны ў вадзе, звычайна ў канцэнтрацыі 1% w/v, без шчолачы і без акіслення. Афарбаваная хімічная часціца — катыён метылтыянінію з хларыдным процііёнам, невялікі плоскі фенатыязінавы фарбавальнік, апісаны ў запісе PubChem пра метыленавы сіні як хларыд метылтыянінію. Як катыён ён звязваецца з фасфатнымі ланцугамі нуклеінавых кіслот і кіслымі групамі на клеткавых сценках бактэрый, афарбоўваючы клеткі ў сіні колер на светлым фоне.

Яго перавага — прадказальнасць. Ядры і бактэрыі выглядаюць сінімі. Кантраст умераны. Слаба бачныя мікраарганізмы могуць афарбоўвацца недастаткова інтэнсіўна — менавіта гэтае абмежаванне і імкнуўся пераадолець Лёфлер. Пра больш шырокую групу простых бактэрыяльных фарбавальнікаў, да якой належыць гэты раствор, можна даведацца з агляду простага афарбоўвання бактэрый. Тут таксама важная дакладная ідэнтыфікацыя: метылавы сіні — зусім іншая малекула, як тлумачыцца ў артыкуле пра адрозненні паміж метылавым сінім і метыленавым сінім. Таму пошук у каталогу толькі паводле назвы колеру можа прывесці да выбару фарбавальніка не таго класа.

Шчолачны метыленавы сіні Лёфлера: той самы фарбавальнік з узмоцненым дзеяннем

Класічная рэцэптура Лёфлера спалучае спіртавы зыходны раствор метыленавага сіняга з разведзенай шчолаччу ў вадзе. У падручнікавых варыянтах выкарыстоўваюць 0.3 g фарбавальніка ў 30 mL 95% этанолу плюс 100 mL 0.01% воднага раствору гідраксіду калію (або эквівалентна 30 mL насычанага спіртавога раствору метыленавага сіняга, 100 mL дыстыляванай вады і 1 mL 1% KOH). У выніку атрымліваецца працоўны раствор з канцэнтрацыяй фарбавальніка каля 0.3% і выразна шчолачным pH. Камерцыйныя варыянты грунтуюцца на тым самым прынцыпе, а ў каталогу мікрабіялагічных фарбавальнікаў Thermo Fisher шчолачны метыленавы сіні Лёфлера, паліхромны і водны варыянты прадстаўлены як асобныя каталожныя пазіцыі з розным прызначэннем.

Ключавы прынцып — дзеянне шчолачы. Павышэнне pH дэпратануе карбаксільныя і фасфатныя групы ва ўзоры, павялічваючы шчыльнасць адмоўна зараджаных участкаў. Пры гэтым спіртавы зыходны раствор падтрымлівае фарбавальнік цалкам раствораным, таму ён дасягае гэтых участкаў у манамернай форме. У выніку бактэрыі афарбоўваюцца хутчэй і больш інтэнсіўна, чым пры выкарыстанні нейтральнага воднага фарбавальніка, і ў звычайным бактэрыялагічным мазку з'яўляюцца знаёмыя насычана-сінія палачкі і кокі. Час афарбоўвання звычайна складае ад адной да трох хвілін, пасля чаго прэпарат прамываюць вадой.

Класічнае прымяненне — Corynebacterium diphtheriae, вырашчаная на сыроватачным асяроддзі Лёфлера: тонкія, часта булавападобныя палачкі з інтэнсіўна афарбаванымі метахраматычнымі грануламі Бабеша—Эрнста, якія ўтрымліваюць назапашаны поліфасфат. Спалучэнне асяроддзя і фарбавальніка мае гістарычныя карані: абодва звязаны з імем аднаго бактэрыёлага, а кантраст гранул і дае дыягнастычную перавагу. Акрамя працы з дыфтэрыяй, гэты фарбавальнік выкарыстоўваюць для агульнага бактэрыялагічнага афарбоўвання мазкоў з культур, вывучэння марфалогіі Neisseria ў клінічных мазках і ўсюды, дзе афарбоўванне паводле Грама не патрэбнае, але звычайны водны сіні дае занадта слабы вынік. Гэта манахромны фарбавальнік. Усе кіслыя структуры набываюць той ці іншы адценне сіняга. Калі пратакол патрабуе дыферэнцыяльнага афарбоўвання ў розныя колеры, адной шчолачы недастаткова.

Адна практычная засцярога: шчолачныя растворы фарбавальнікаў псуюцца і ўтвараюць асадак пры захоўванні і паглынанні вуглякіслага газу. Лабараторыі альбо рыхтуюць невялікія аб'ёмы, альбо купляюць гатовы каталожны раствор і выконваюць яго тэрмін прыдатнасці, замест таго каб захоўваць старую бутэльку, з якой асадак ужо трапляе на кожнае прадметнае шкло.

Паліхромны метыленавы сіні: адна назва, некалькі фарбавальнікаў

Паліхромны метыленавы сіні атрымліваюць з таго самага фарбавальніка, падвяргаючы яго кантраляванаму акісленню ў шчолачным асяроддзі, якое гістарычна называлі выспяваннем або паліхрамаваннем. Вытрымліванне ў шчолачным асяроддзі, награванне з карбанатам або акісленне такімі рэагентамі, як дыхрамат, паступова выдаляе метыльныя групы з дымінаметылавых аміназамяшчальнікаў. Прадукт уяўляе сабой сумесь: рэшткавы метыленавы сіні плюс azure B (страчана адна метыльная група), азур A і азур C (далейшае дэметыляванне), тыянін (цалкам дэметыляваны) і пабочныя прадукты акіслення з групы метыленавага фіялетавага. Кожны кампанент мае ўласнае адценне і сроднасць да тканак, таму сумесь афарбоўвае метахраматычна: ядры, гранулы, муцыны і храсток набываюць розныя адценні — ад сіняга да чырвона-фіялетавага.

Гэта тая самая хімія, на якой грунтуюцца знакамітыя фарбавальнікі для крыві. Першыя даследчыкі выявілі, што падшчолачаны метыленавы сіні афарбоўвае ядры малярыйных паразітаў у фіялетавыя адценні, але іх водныя растворы пасля выспявання былі нестабільнымі і ўтваралі асадак за некалькі дзён. Агляд гісторыі вынаходства пурпурнага фарбавальніка для крыві прасочвае, як Малахоўскі і Раманоўскі незалежна адзін ад аднаго выкарысталі гэты эфект у 1891 годзе, як быў уведзены метанол для стабілізацыі асадку фарбавальніка і фіксацыі мазкоў без награвання і як пазней Гімза стандартызаваў сумесь на аснове адмераных колькасцяў azure B і эазіну са стабілізацыяй гліцэрынам. Сучасныя фарбавальнікі тыпу Гімзы непасрэдна паходзяць ад спалучэння паліхромнага метыленавага сіняга з эазінам, якое стварае эфект Раманоўскага. Падрабязней пра спалучэнне з эазінам і кампанент azure B глядзіце ў артыкуле пра фарбавальнікі тыпу Раманоўскага і ўзаемадзеянне azure B з эазінам.

Паколькі паліхромны метыленавы сіні з'яўляецца сумессю, па сваёй прыродзе ён найменш стандартызаваны з гэтых трох варыянтаў. Дакладны баланс яго адценняў залежыць ад спосабу і ступені акіслення. Таму пастаўшчыкі рэагентаў для гісталогіі прадаюць яго як асобны прадукт з уласнай праверкай якасці афарбоўвання, а не як вытрыманы раствор Лёфлера. Тыповыя прымяненні ўключаюць метахраматычнае выяўленне гранул тучных клетак, муцынаў і храстка, дэталяў плазматычных клетак, а таксама Helicobacter pylori ў тканкавых зрэзах паліхромнымі метадамі тыпу Гудпасчэра. Гэта правільны выбар, калі патрэбнае адрозненне паводле колеру, і няправільны, калі пратакол прадугледжвае выразны манахромны сілуэт бактэрый.

Параўнанне рэцэптур і прызначэння

Успрымайце табліцу як алгарытм выбару. Калі ўзор афарбоўваецца занадта слаба, зменіце падыход да pH і вазьміце раствор Лёфлера. Калі афарбоўваецца ўсё, але нішто не вылучаецца, зменіце падыход да складу фарбавальніка і вазьміце паліхромны варыянт. Калі ў мазку, афарбаваным паводле Лёфлера, гранулы бачныя цудоўна, але кіраўнік пытаецца, чаму ядры і цытаплазма аднолькава сінія, адказ такі: ніводны шчолачны манахромны фарбавальнік не можа выканаць гэтую задачу. Гэта ўжо сфера паліхромных фарбавальнікаў і іх вытворных для афарбоўвання крыві.

Як пазбегнуць звычайнай блытаніны

Большасць блытаніны ўзнікае праз дзве памылкі. Першая — лічыць раствор Лёфлера ўзаемазаменным са звычайным метыленавым сінім, таму што абодва ў бутэльцы выглядаюць сінімі. Яны адрозніваюцца pH і інтэнсіўнасцю афарбоўвання, і замена раствору Лёфлера нейтральным фарбавальнікам пазбаўляе менавіта таго кантрасту гранул, на якім грунтуецца пратакол. Другая — лічыць любы стары або выпадкова вытрыманы шчолачны сіні паліхромным. Некантраляванае выспяванне дае невядомую сумесь з невядомай канцэнтрацыяй, тады як сапраўдныя паліхромныя растворы рыхтуюць вызначанымі спосабамі акіслення, а ў групе фарбавальнікаў для крыві — спалучаюць з дакладна адмеранай колькасцю эазіну. Гісторыя тут павучальная: нестабільныя водныя растворы пасля выспявання, якія выкарыстоўвалі ў 1890-х гадах, саступілі месца стабілізаваным метанольным рэцэптурам менавіта таму, што некантраляваныя сумесі немагчыма было ўзнавіць. Гэты ўрок варта згадаць, перш чым афарбоўваць дыягнастычны прэпарат растворам з бутэлькі невядомага ўзросту.

Дакладнасць назваў завяршае праверку. Пацвердзіце па этыкетцы каталожную пазіцыю (водны, Лёфлера або паліхромны), утрыманне фарбавальніка і прызначэнне, замест таго каб рабіць высновы паводле колеру. У гэтых трох рэцэптур агульны храмафорны продак. Але прызначэнне ў іх рознае.