Афарбоўванне клетак шчакі метыленавым сінім: што назіраць

Вучаніца змяшчае кроплю суспензіі клетак шчакі на прадметнае шкло, глядзіць у мікраскоп і амаль нічога не бачыць. На светлым фоне праплываюць некалькі бледных ценяў. Яна спрабуе навесці рэзкасць, потым дадае святла і нарэшце робіць выснову, што шкло пустое. Але яно не пустое. Клеткі на ім ёсць. Яны амаль празрыстыя, і менавіта празрыстасць — тая праблема, якую павінна вырашыць гэтае афарбоўванне.

Гэтае разыходжанне паміж чаканнямі і выявай варта абмеркаваць яшчэ да пачатку працы па пратаколе. Пачаткоўцы чакаюць, што мікраскоп пакажа дэталі гэтак жа, як набліжэнне камеры дазваляе прачытаць далёкую шыльду. Мікраскоп светлага поля робіць нешта больш абмежаванае: паказвае адрозненні ў паглынанні святла. Неафарбаваная клетка шчакі амаль не паглынае святла, таму амаль не стварае такіх адрозненняў. Метыленавы сіні дадае іх. Ён нераўнамерна звязваецца ўнутры клеткі і ператварае структуру ў кантраст. Калі вучні разумеюць гэты прынцып, кожны наступны крок успрымаецца як яго вынік, а не як пункт рэцэпта.

Тут дапамогуць агульныя звесткі пра тое, як простае афарбоўванне павышае кантраст у школьнай лабараторыі, а паўтарэнне наладжвання мікраскопа светлага поля перад афарбоўваннем дазволіць пазбегнуць паловы няўдалых прэпаратаў. Хімія колеру разглядаецца ва ўводзінах у выкарыстанне метыленавага сіняга ў мікраскапіі, дзе тлумачыцца, чаму менавіта гэты фарбавальнік так часта выкарыстоўваюць у лабараторыі.

Навучальны пратакол

Апісаны ніжэй вільготны прэпарат — прасцейшы стандартны варыянт для звычайных заняткаў. Ён не патрабуе ні полымя, ні этапу фіксацыі. Варыянт з фіксаваным мазком, які выкарыстоўваецца ў некаторых дапаможніках для каледжаў, прадугледжвае высушванне на паветры і кароткую цеплавую фіксацыю, як у практычнай працы з мазком са шчакі ад North Central Texas College, апублікаванай праз Biology LibreTexts. Аднак цеплавая фіксацыя — звыклы прыём у мікрабіялогіі, а не абавязковая ўмова для назірання эпітэліяльных клетак.

Што спатрэбіцца: чыстыя прадметныя і покрыўныя шкельцы, стэрыльныя аднаразовыя тампоны (пераважна) або новыя плоскія зубачысткі, флакон-кропельніца з водным растворам метыленавага сіняга канцэнтрацыяй ад 0.5 да 1 працэнта, дыстыляваная або дэіянізаваная вада, прамакальная папера, пальчаткі і складаны светлавы мікраскоп з агульным павелічэннем 100x і 400x.

1. Прапалашчыце рот звычайнай вадой. Гэта выдаляе часцінкі ежы, якія пазней інтэнсіўна афарбоўваюцца і адцягваюць увагу ад клетак.
2. Кожны вучань бярэ ўзор толькі са сваёй шчакі. Асцярожна патрыце ўнутраны бок шчакі новым стэрыльным тампонам. Прыціскайце, а не саскрабайце. Спыніцеся задоўга да з'яўлення дыскамфорту або крывацёку.
3. Пракаціце тампон па цэнтры чыстага прадметнага шкла, пакідаючы тонкі слой. Тонкі слой — галоўная ўмова атрымання прэпарата, які можна добра разгледзець. Тоўсты белы налёт пасля афарбоўвання ператворыцца ў сінюю масу, у якой нічога не разабраць.
4. Дадайце на мазок адну кроплю метыленавага сіняга. Пакіньце на 1–3 хвіліны. У многіх пратаколах для каледжаў дастаткова адной хвіліны; у дапаможніку NCERT па лабараторных работах па прыродазнаўстве для IX класа для часовага прэпарата прадугледжана каля 3 хвілін. Даўжэй не значыць лепш, а празмернае афарбоўванне — самая частая памылка ў выбары часу.
5. Асцярожна прамыйце дыстыляванай вадой або адвядзіце лішак фарбавальніка прамакальнай паперай, прытрымліваючыся мясцовага пратакола. Фон павінен стаць бледна-блакітным, а не насычана цёмна-сінім.
6. Апускайце покрыўнае шкельца пад вуглом, каб спачатку дакрануўся адзін край, а потым павольна апусціце яго цалкам. Гэта прадухіляе з'яўленне бурбалак паветра.
7. Пачніце з малога павелічэння, каб знайсці клеткі, праверце рэзкасць і размяшчэнне ў цэнтры, затым перайдзіце да 100x і нарэшце да 400x. Пры 400x карыстайцеся толькі дакладнай факусоўкай.

Канцэнтрацыя фарбавальніка заслугоўвае аднаго ўдакладнення. У школьных пратаколах звычайна выкарыстоўваюць водны раствор метыленавага сіняга канцэнтрацыяй каля 1 працэнта. Больш канцэнтраваны зыходны раствор або працяглая вытрымка робяць фон цямнейшым хутчэй, чым ядро, і гэта змяняе кантраст на супрацьлеглы таму, на якім грунтуецца практычная праца.

Бяспечнае абыходжанне з матэрыялам са шчакі

Узоры са шчакі ўтрымліваюць сліну і нармальныя мікраарганізмы ротавай поласці, таму з кожным свежым мазком трэба абыходзіцца як з патэнцыйна інфекцыйным матэрыялам, нават калі донары — здаровыя аднакласнікі. У рэкамендацыях Амерыканскага таварыства мікрабіялогіі па біябяспецы ў навучальных лабараторыях выкладзены агульныя прынцыпы: ацаніць рызыку перад заняткамі, надзець пальчаткі, абараніць вочы там, дзе магчымыя пырскі, пасля працы вымыць рукі, прадэзінфікаваць працоўныя паверхні і ўтылізаваць забруджаныя аднаразовыя матэрыялы паводле зацверджанага парадку абыходжання з біялагічнымі адходамі.

Чатыры правілы для заняткаў ахопліваюць большасць рызык. Адзін донар на адзін тампон і адно прадметнае шкло; імі ніколі не дзеляцца. Кожны бярэ ўзор толькі ў сябе, ніколі не ў суседа. Аднаразовыя тампоны і зубачысткі адразу адпраўляюцца ў прызначаны кантэйнер для адходаў, а не назад на працоўную паверхню. Сам метыленавы сіні афарбоўвае скуру і адзенне і раздражняе вочы, таму патрэбныя пальчаткі і звычайныя меры гігіены пры працы з фарбавальнікамі. Не пашырайце гэтую практычную працу да вырошчвання чаго-небудзь з мазка і не імправізуйце з цеплавой фіксацыяй свежага чалавечага матэрыялу па-за школьнай працэдурай бяспекі.

Што назіраць і чаму гэта выглядае менавіта так

Пры 100x шукайце шырокія плоскія клеткі бледна-блакітнага колеру з няправільнымі авальнымі або шматвугольнымі абрысамі. Яны ляжаць паасобку або няшчыльнымі пластамі, якія перакрываюцца. У кожнай клетцы звычайна ёсць адна цямнейшая сіняя пляма. Гэта ядро. Звярніце ўвагу і на размяшчэнне: клеткі плоскага эпітэлію падобныя да тонкіх плітак, а не да сфер, таму іх краі нагадваюць парэпаную глазуру, а не круглыя паветраныя шары.

Пры 400x выразна адрозніваюцца тры асаблівасці. Мяжа клеткі выглядае як тонкая цямнейшая лінія, якая акрэслівае клетку. Цытаплазма запаўняе ўнутраную прастору раўнамерным светла-блакітным колерам. Ядро цямнейшае і больш кампактнае, часта авальнае, звычайна размешчана паблізу цэнтра, але не заўсёды. Папрасіце вучняў адзначыць усе тры асаблівасці, а таксама форму і павелічэнне, бо менавіта гэта патрабуецца ў працоўным аркушы.

Тут важная адна дэталь, у якой многія працоўныя аркушы дапускаюць памылку. Бачная мяжа адпавядае вобласці плазматычнай мембраны, але сама мембрана — ліпідны біслой таўшчынёй прыкладна ад 7 да 10 нанаметраў — значна меншая за мяжу адрознівальнай здольнасці школьнага мікраскопа. Вучні бачаць аптычны край клеткі разам з фарбавальнікам, які там назапасіўся. Тая ж засцярога датычыцца арганэл. Мітахондрыі, эндаплазматычная сетка, комплекс Гольджы і рыбасомы ў гэтым прэпараце не бачныя. У добрых умовах звычайны светлавы мікраскоп дазваляе адрозніваць дэталі памерам прыблізна да 0.2 мікраметра, як тлумачыцца ў даведачным матэрыяле NCBI па клетачнай біялогіі пра сродкі мікраскапіі, а большасць элементаў ультраструктуры знаходзіцца ніжэй гэтай мяжы або побач з ёй. Большае пустое павелічэнне робіць выяву буйнейшай, не дадаючы дэталяў.

Чаму ядро афарбоўваецца найцямней? Метыленавы сіні — катыённы фарбавальнік, станоўча зараджаны ў растворы, які звязваецца з адмоўна зараджаным матэрыялам у клетцы, найперш з нуклеінавымі кіслотамі. Храматын канцэнтруе ДНК у ядры, таму ядро назапашвае найбольш фарбавальніка. Цытаплазма ўтрымлівае РНК і іншыя зараджаныя малекулы, таму таксама афарбоўваецца, але больш рассеяна і святлей. Важнае ўдакладненне: метыленавы сіні не з'яўляецца фарбавальнікам, спецыфічным для ДНК. Праца пра размеркаванне метыленавага сіняга пры візуалізацыі ядраў апісвае звязванне катыёна з абласцямі, багатымі на нуклеінавыя кіслоты, а ранейшае колькаснае даследаванне звязвання метыленавага сіняга ў клетачных прэпаратах выявіла, што большая частка звязанага фарбавальніка была звязаная з нуклеінавымі кіслотамі. Таму цёмнае ядро і светлая цытаплазма — гэта карціна кантрасту, а не малекулярны аналіз.

Памылкі вучняў і як іх распазнаваць

Амаль кожны няўдалы прэпарат адпавядае аднаму з пяці тыповых выпадкаў. Навучыце вучняў вызначаць праблему прэпарата, а не паўтараць працу ўсляпую.

Празмернае афарбоўванне робіць клеткі і фон аднолькава цёмнымі, таму ядро зліваецца з полем зроку. Выпраўце гэта, скараціўшы час афарбоўвання або больш старанна прамыўшы прэпарат. Недастатковае афарбоўванне пакідае бледныя цені, якія знікаюць пры ўзмацненні асвятлення; павялічвайце час крокамі па трыццаць секунд. Тоўстыя мазкі ўтвараюць шчыльныя масы клетак, якія перакрываюцца, і асобныя абрысы немагчыма прасачыць; выпраўленне тут механічнае: наступным разам размяркуйце матэрыял танчэй, бо ніякае прамыванне не ўратуе нагрувашчванне клетак. Бурбалкі паветра выглядаюць як ідэальныя кругі з выразнымі цёмнымі краямі і адцягваюць увагу пачаткоўцаў, якія прымаюць іх за структуры; пакладзіце покрыўнае шкельца нанова, павольна і пад вуглом. Дробныя цёмныя кропкі, рассеяныя на клетках або вакол іх, звычайна з'яўляюцца нармальнымі бактэрыямі ротавай поласці, як адзначаецца ў школьных пратаколах, напрыклад у працэдуры даследавання клетак шчакі ад Ingrid Science. Яны пацвярджаюць, што ў роце ёсць мікраарганізмы, і гэта можа запомніцца вучням, але ў гэтай практычнай працы нельга вызначыць іх відавую прыналежнасць і не варта маляваць іх як часткі клеткі. Рэшткі ежы і ніткі слізі афарбоўваюцца нераўнамерна і інтэнсіўна; папярэдняе паласканне патрэбнае, каб паменшыць іх колькасць.

Чаго гэтая практычная праца не можа паказаць

Гэта навучальнае назіранне, а не дыягнастычны тэст. Ніякія асаблівасці выгляду клетак пры навучальным афарбоўванні не дазваляюць дыягнаставаць інфекцыю, рак або любое захворванне, і артыкул не варта ўспрымаць як сцвярджэнне адваротнага. Прэпарат паказвае форму, мяжу, цытаплазму і ядро пры двух павелічэннях. Ён не паказвае ультраструктуру мембраны, дэталі арганэл або малекулярную ідэнтычнасць. Выразнае абазначэнне гэтага абмежавання абараняе і навуковую дакладнасць, і вучняў: добры вынік — гэта правільна падпісаны малюнак з пазначанымі павелічэннем і фарбавальнікам, а не выснова пра здароўе.

Працоўны аркуш для вучняў і мікрафатаграфіі з подпісамі

Два падрыхтаваныя матэрыялы для гэтай старонкі — мікрафатаграфія з подпісамі вышэй і працоўны аркуш ніжэй. Раздрукуйце па адным аркушы на вучня або пакажыце яго на экране і папрасіце вучняў перанесці палі ў сшыткі.

Як выкарыстаць яго на занятках працягласцю 45 хвілін: дзесяць хвілін на інструктаж па бяспецы і ўзяцце ўзораў, дзесяць хвілін на афарбоўванне і падрыхтоўку прэпарата, пятнаццаць хвілін на назіранне і замалёўкі пры абодвух павелічэннях, дзесяць хвілін на кантрольны спіс і параўнанне з мікрафатаграфіяй з подпісамі. Пункты кантрольнага спіса наўмысна простыя і канкрэтныя. Тонкі мазок, правільны час афарбоўвання, ядро цямнейшае за цытаплазму, павелічэнне запісанае. Вучань, які можа адзначыць усе чатыры пункты, зразумеў прынцып, дзеля якога і праводзіцца занятак: мікраскопы паказваюць адрозненні, а фарбавальнікі ствараюць адрозненні, якія варта паказваць.