Zebra balığı tədqiqatlarında metilen mavisi: qulluq əlavəsi və eksperimental qarışdırıcı amil

Zebra balığı yumurtalarının saxlandığı su çox vaxt açıq mavi olur və bunun səbəbini demək olar ki, heç kim qeyd etmir. Boya göbələklərə qarşı əlavə edilən metilen mavisidir və protokolların əksəriyyəti onu fon amili kimi qəbul edir. Burada fon anlayışı uyğun deyil. Daha düzgün anlayış qeydə alınmamış eksperimental amildir: təsirə məruz qoyulan qablarda olan, nəzarət qablarında isə olmayan, istifadə edilən konsentrasiyalarda farmakoloji cəhətdən aktiv olan və təcrübənin ölçdüyü göstəricilərin özünü dəyişə bilən bir maddə.

Aşağıdakı bütün müzakirənin əsasını bu fərq təşkil edir. Adi göbələkəleyhinə qulluq bir məsələdir. Əlavənin sizin analiziniz baxımından neytral olub-olmaması isə başqa məsələdir. Zebra balığına dair son elmi ədəbiyyat birinci suala arxayınlaşdırıcı, ikinci suala isə narahatlıq doğuran cavab verir.

Təlimatlar əslində nəyi nəzərdə tutur

Vahid standart yoxdur və problemin bir hissəsi də budur. Kanada Heyvanlara Qulluq Şurasının təlimatı göbələk inkişafını azaltmaq üçün yumurta və sürfələrin daşınma məhlulunda 0.5 mg/L, yaxud 0.00005% istifadəsinə icazə verir. Avropanın laboratoriya heyvanlarına dair təlimatında embrionların çox vaxt eyni 0.00005% konsentrasiyanı ehtiva edən mühitdə saxlandığı təsvir olunur. Cold Spring Harbor E3 resepti isə tərkib hissəsi kimi bunun ikiqatını, 1 mg/L və ya 0.0001% göstərir. Bunun qarşısında diqqətçəkən bir boşluq var: OECD-nin balıq embrionu toksiklik sınağı təlimatı tərkibi yenidən hazırlanmış durulaşdırma suyu və sınaqdan keçirilən kimyəvi maddəni göstərir, lakin nə 2013 versiyasında, nə də sonrakı yenilənməsində metilen mavisi tövsiyə olunur. Beləliklə, bir laboratoriya zebra balığı embrionlarını həyatın ilk saatlarından metilen mavisi olan mavi suda yetişdirir, digəri normativ embrion sınağını rəngsiz suda aparır və hər ikisi öz mühitini normal adlandırır. Laboratoriyalar arasında nəticələri müqayisə edən və ya əvvəlki nəzarət məlumatlarını birləşdirən hər kəs bu uyğunsuzluğu da qəbul etmiş olur.

Konsentrasiyaları anlamaq üçün qeyd edək ki, 0.00005% təxminən 1.56 mikromolyar, 0.0001% isə təxminən 3.13 mikromolyardır. Bunlar kiçik rəqəmlərdir və onları təsir göstərmək üçün həddindən artıq aşağı hesab etmək asandır. Aşağıdakı tədqiqatlar məhz bu fərziyyəni, məhz həmin konsentrasiyalarda yoxlayır.

Laboratoriya deyil, akvariumçuluq sahəsindən gələn oxucular eyni molekulla başqa şəraitdə qarşılaşırlar; bu şərait metilen mavisinə dair akvarium bələdçisində izah olunur. Kimyəvi xüsusiyyətlər eynidir; boyanın hüceyrələr daxilində elektronları necə daşıdığına dair müzakirə redoks-aktiv birləşmənin metabolizm haqqında məqalələrdə niyə daim ortaya çıxdığını izah edir. Aşağıdakılar konkret olaraq metilen mavisi olan zebra balığı yumurta suyuna aiddir.

Metabolizm: təsirin istiqaməti mərhələdən asılı olaraq dəyişir

Ən çox məlumat verən tədqiqatda normal inkişaf edən zebra balıqları həyatlarının ilk günündən mayalanmadan sonrakı 5-ci günədək təsirə məruz qoyulub və hər mərhələdə oksidləşmə metabolizmi ölçülüb. Bu, embrion metabolizmi təcrübələrinə dair dərc edilmiş hesabatda təsvir olunur. Müşahidə olunan qanunauyğunluğu diqqətlə ifadə etmək lazımdır, çünki onun istiqaməti dəyişir.

Mayalanmadan 1 gün sonra qulluqda istifadə olunan hər iki konsentrasiyaya məruz qalmış embrionlarda bazal oksigen sərfi artıb. 2-ci gündə 0.00005%, 0.0001% və 0.0003% konsentrasiyaların hamısında sürfələrin səth qatında mitoxondrial membran potensialı yüksəlib. 4–5-ci günlərə, yumurtadan çıxmadan sonraya gəldikdə təsirin istiqaməti dəyişib: təsirin mayalanmadan bəri fasiləsiz davam etməsindən və ya yalnız 3-cü gündən 4-cü günədək qısamüddətli olmasından asılı olmayaraq, oksidləşmə yolu ilə enerji sərfiyyatı azalıb. Paralel olaraq, həm 1-ci, həm də 4-cü gündə mitoxondrial tənəffüs komplekslərinin alt vahidlərinə aid transkriptlər, eləcə də steroidogenez və qlükoneogenezlə əlaqəli transkriptlər azalıb.

Daha iki müşahidə mənzərəni dəqiqləşdirir. Qulluqda istifadə olunan daha yüksək konsentrasiyada yumurtadan çıxma bir qədər tez baş verib: təsirə məruz qalan embrionlar 2-ci gündə irəlidə olub, nəzarət qrupu isə 3-cü günədək onlara çatıb. Stress oxunun özü isə normal fəaliyyət göstərirmiş kimi görünüb: 5 günlük sürfələr fırlanan su ilə yaradılan stressə məruz qoyulduqda hər iki qrupda bütün bədən üzrə kortizol səviyyəsi normal şəkildə yüksəlib. Deməli, bu miqdarlarda boya inkişafı ümumi şəkildə zəhərləyən maddə deyil və bütün fizioloji reaksiyaları zəiflətmir. O, enerji metabolizmini mərhələdən asılı olaraq dəyişir: yumurtadan çıxmadan əvvəl artırır, sonra isə azaldır.

Davranış: iki tədqiqat niyə fərqli nəticələr verir və niyə hər ikisi doğru ola bilər

Təsirə məruz qoyma sxemləri yanaşı müqayisə edilənədək davranışa dair elmi ədəbiyyat ziddiyyətli görünür. Bir inkişaf və davranış təhlükəsizliyi tədqiqatında embrionlar mayalanmadan təxminən 6 saat sonra 10 mikromolyara qədər konsentrasiyalara məruz qoyulub, məhlullar 4-cü günədək hər gün yenilənib, sonra sürfələr 5-ci və 6-cı günlər üçün boyasız mühitə köçürülüb və 6-cı gündə işıq-qaranlıq sınağında hərəkət fəallığı yoxlanılıb. Nəticə: ölüm, yumurtadan çıxma və ya morfologiyaya əhəmiyyətli təsir olmayıb, hərəkət fəallığına da tətbiq edilən maddənin təsiri aşkarlanmayıb. Müəlliflər öz şəraitlərində 10 mikromolyarı əsaslı şəkildə yuxarı hədd kimi tövsiyə ediblər.

Müəlliflərinin bir qismi metabolizm tədqiqatının müəllifləri ilə eyni olan ikinci qrup təsirə məruz qoymanı qulluqda faktiki tətbiq edildiyi kimi aparıb: boya mayalanmadan 2–3 saat sonra mühitdə olub, mühit hər gün qismən yenilənib və davranış təsir davam edərkən və ya ondan az sonra ölçülüb. Eyni adi konsentrasiyalarda sürfələr 24 saatlıq sınaqda azalmış hərəkət fəallığı göstərib; nəticə müxtəlif ştammlarda və laboratoriyalarda təkrarlanıb. Davranışa qarışdırıcı təsirin tədqiqi bu təsirin serotonergik tonusla əlaqəsinə işarə edib ki, bu da boyanın məlum monoamin oksidaza inhibisiyası ilə uyğun gəlir. Ən mühüm müşahidə odur ki, metilen mavisi olan embrion mühiti SSRI fluoksetinə gözlənilən hərəkət reaksiyasını maskalayıb. Buna görə mavi suda aparılan skrininq sınağı rəngsiz suyun üzə çıxaracağı dərman təsirini aşkar etməyə bilər.

Əslində ziddiyyət yoxdur. Bir birləşmə bir sınaqda mühitdən çıxarılmasından iki gün sonra aşkarlana bilən qalıq təsir buraxmaya, başqa sınaqda isə mühitdə olduğu müddətdə aktiv qala bilər. Praktik nəticə budur: təsirin aşkarlanmadığı nəticə neytrallıq iddiasını deyil, yuxarı konsentrasiya həddini əsaslandırır. Təsirin aşkarlandığı nəticə isə əhəmiyyətli riski təsvir edir: laboratoriyaların çoxunun istifadə etdiyi məhz həmin sxemdə, ölçmə müddətində aktiv təsirə məruz qalma.

Redoks sınağının daxilində redoks boyası

Daha bir tələ ayrıca abzas tələb edir, çünki o, heyvana deyil, ölçmə vasitəsinə təsir edir. Alamar Blue enerji sərfiyyatı sınağının özü redoks kimyasına əsaslanır: rezazurin flüoressent rezorufinə reduksiya olunur. Metilen mavisi də redoks kimyasında iştirak edir. Hüceyrəsiz nəzarət nümunələrində qulluqda istifadə olunan hər iki konsentrasiya 24 saatdan sonra Alamar Blue flüoressensiyasını cüzi, lakin statistik əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb. Heyvan təcrübələrində təsirə məruz qalmış embrionlar sınaqdan əvvəl boyasız mühitdə ən azı üç dəfə yuyulub və yumurtadan çıxmış sürfələrdəki bioloji təsir hüceyrəsiz mühitdəki müdaxilədən daha böyük olub. Buna görə hər iki fikir doğrudur: yuyulmuş heyvanlarda həqiqi metabolik təsir qalır, yuyulmamış boya isə buna birbaşa kimyəvi artefakt əlavə edir. Nəzarət nümunələri bu ikisini ayırmalıdır, əks halda göstəricilərin heç biri məna daşımır. Boya əsaslı analiz nəticələrinin şərhinə dair ümumi tövsiyələr burada xüsusilə böyük əhəmiyyət daşıyır.

İnkişaf mərhələləri üzrə zaman cədvəli

Bu məqalə üçün hazırlanmış orijinal material. Başqa cür qeyd edilmədikdə konsentrasiyalar qulluqda istifadə olunan iki standart dəyərdir: 0.00005% və 0.0001%.

Yadda saxlanmalı qanunauyğunluq metabolik göstəricilərin əvvəl artıb, sonra azalmasıdır; davranış təsirləri maddəyə məruz qalma zamanı mövcuddur, maddənin uzaqlaşdırılmasını yoxlayan yeganə sınaqda isə təmizlənmədən sonra aşkarlanmır.

Nəzarət sxeminin qurulması üçün yoxlama siyahısı

İkinci orijinal material. Zebra balığı üçün metilen mavisi protokolları təcrübə ilə kəsişdikdə ondan istifadə edin.

1. Boyanı su kimi deyil, reagent kimi qeyd edin. Konsentrasiyanı həm faiz, həm də mikromolyarla, təsirin başlanmasını və bitməsini mayalanmadan sonrakı saat və ya günlərlə, yenilənmə cədvəlini və hər ölçmədən əvvəl boyasız mühitdə saxlanma müddətini göstərin.
2. Nəzarət qruplarını tədqiqat sualına uyğunlaşdırın. Sınaqdan keçirilən kimyəvi maddənin tədqiqi üçün boyasız nəzarət qrupları lazımdır; qulluq tədqiqatı üçün isə göbələkəleyhinə nəticələrin qeydə alındığı boyasız və boyalı qruplar lazımdır, çünki istinad edilən tədqiqatların heç biri göbələkəleyhinə effektivliyi ölçməyib.
3. Redoks sınaqlarından əvvəl yuyun, sonra yoxlayın. Boyasız mühitdə ən azı üç dəfə yaxalayın və paralel olaraq hüceyrəsiz boya və reagent nəzarət nümunəsi ilə sınaq aparın, çünki boya Alamar Blue siqnalını birbaşa azaldır.
4. Davranış və monoamin göstəricilərini yüksək riskli hesab edin. Hərəkət fəallığı, diksinmə, narahatlığa bənzər davranış, antidepressant və MAO inhibitoru tədqiqatlarında ölçmə zamanı boyadan istifadə edilməməli və ya konkret göstərici üzrə neytrallıq nümayiş etdirilməlidir; boyasız mühitdə bir-iki gün saxlanma bir hərəkət təsirini aradan qaldırıb, lakin bu, digər sınaq sxemləri üçün sübut edilməyib.
5. Metabolik və mitoxondrial göstəriciləri hər mərhələdə yüksək riskli hesab edin. Oksigen sərfi, enerji sərfiyyatı, membran potensialı və tənəffüs zəncirinin transkriptləri qulluqda istifadə olunan konsentrasiyalarda dəyişir; yumurtadan çıxmadan əvvəl və sonra bu dəyişikliklər əks istiqamətdə gedir.
6. Bir sxemdəki neytrallığı digərinə şamil etməyin. Boyasız mühitdə saxlanmadan sonra təsirin aşkarlanmaması davam edən təsirə məruz qalmanı əhatə etmir; morfoloji təsirin aşkarlanmaması metabolizmə və ya dərman qarşılıqlı təsirinə aid deyil; bir ştammda, temperaturda və ya sınaq müddətində alınmış nəticə digərlərinə şamil edilmir.
7. Əməl etdiyiniz təlimatı və onun alternativini göstərin. CCAC, Avropa və ya Cold Spring Harbor konsentrasiyalarını açıq şəkildə qeyd edin və OECD embrion sınağında boyanın nəzərdə tutulmadığını bildirin ki, oxucu heyvanlarınızın hansı şəraitdə saxlandığını anlaya bilsin.

Bunların heç biri yumurtaları sağ saxlamaq üçün boyadan istifadəyə qarşı arqument deyil. Bunlar qulluq seçiminin yoxlanmadan məlumatlara təsir etməsinə qarşı arqumentdir. Qabdakı mavi rəng farmakoloji xüsusiyyətləri olan bir molekuldur və təhrif olunma ehtimalı ən yüksək olan təcrübələr məhz hazırda gənc zebra balıqlarına üstünlük verilən yüksək məhsuldarlıqlı metabolik və neyrodavranış skrininqləridir. Onu qeyd edin, nəzarətdə saxlayın, ölçmədən əvvəl yuyub uzaqlaşdırın və səssizcə iştirak edə biləcəyi sınağı yoxlayın.