Metilen mavisinin mitoxondrial təsirlərinin ölçülməsi: oksigen, ATP və membran potensialı

Tutaq ki, laboratoriyada tənəffüsü pozulmuş mitoxondrilərə metilen mavisi əlavə edilir və oksigen sərfinin artdığı müşahidə olunur. İlk ağla gələn cümlə boyanın mitoxondrial funksiyanı bərpa etməsidir. Bu cümlə yanlış ola bilər. Oksigen axını, ATP sintezi və membran potensialı üç ayrı anlayışdır. Ehtiyat nüsxələmə, sinxronlaşdırma və paylaşma eyni bulud qovluğundan istifadə etdiyi kimi, bunlar da eyni orqanoiddə baş verir: bir-biri ilə əlaqəlidirlər, lakin fərqli qaydalara tabedirlər. Birini digəri ilə qarışdırsanız, hər bir ölçmə texniki baxımdan düzgün olsa belə, nəticənin şərhi səhv olacaq.

Metilen mavisi bu qarışıqlığı ehtimallı edir, çünki ölçdüyü sistemdə özü də iştirak edir. O, zəncirin əvvəlki mərhələlərində elektronları qəbul edib sonrakı mərhələlərinə ötürən redoks dövriyyəçisidir, enerji ilə yüklənmiş mitoxondrilərdə toplanan lipofil kationdur və geniş istifadə olunan zondlarla eyni spektral zolaqlarda işığı udan və yayan intensiv mavi birləşmədir. Tək bir göstərici bütün bu amilləri əhatə edə bilməz. Budapeştdə aparılmış mitoxondrial tədqiqatlarda göstərilən etibarlı yanaşma oksigen axınını, ATP sintezi sürətini, membran potensialını və hidrogen peroksidin ayrılmasını birlikdə ölçmək, hər mərhələdə isə boyaya xas nəzarət sınaqlarından istifadə etməkdir.

Respirometriya enerji hasilatını deyil, oksigen axınını ölçür

İstər Oroboros Oxygraph, istərsə də Seahorse hüceyrəxarici axın analizatoru ilə aparılan yüksək ayırdetmə qabiliyyətli respirometriya yalnız bir şeyi göstərir: oksigenin nə qədər sürətlə reduksiya olunduğunu. O, hər elektron üçün neçə protonun daşındığını, qradiyentin nə qədər qorunduğunu və ya ATP sintazanın bundan istifadə edib-etmədiyini göstərmir.

Terminologiya vacibdir. İzolə edilmiş mitoxondrilərdə ADP olmadan substratın verilməsi sızma tənəffüsünü, doyurucu miqdarda ADP ilə substratın verilməsi oksidləşdirici fosforlaşma tutumunu, ayırıcı maddənin titrlənməsi isə maksimum elektron ötürmə tutumunu göstərir. Bütöv hüceyrələrdə bunların Seahorse qarşılıqları bazal tənəffüs, oliqomisinə həssas ATP ilə əlaqəli tənəffüs, proton sızması, FCCP ilə müəyyən edilən maksimal tənəffüs və rotenonla antimisinə davamlı qeyri-mitoxondrial oksigen sərfidir. Seahorse nəticələrini Vəziyyət 3 və Vəziyyət 4 adlandırmaq, Agilent Mito Stress Test yanaşmasının aydın göstərdiyi kimi, bu preparatın təmin etmədiyi dəqiqliyi ona aid etməkdir.

Metilen mavisi daha çox oksigenlə daha çox enerji arasındakı intuitiv əlaqəni pozur. İzolə edilmiş beyin mitoxondriləri üzrə tədqiqata görə, izolə edilmiş dəniz donuzu beyin mitoxondrilərində 100 nM ilə 1 uM arasındakı boya konsentrasiyaları qlutamat və malat, suksinat, eləcə də alfa-qliserofosfat substratları ilə sakitlik halında oksigen sərfini artırıb; alfa-qliserofosfatla artım təxminən 64 faiz olub. Bununla belə, sağlam mitoxondrilərdə ADP ilə stimullaşdırılan tənəffüs demək olar ki, dəyişməyib. Sızma artdığı, ADP ilə stimullaşdırılan axın isə dəyişməz qaldığı üçün hesablanan tənəffüsə nəzarət əmsalı azalır. Bu azalma boyanın mitoxondriləri zədələdiyi demək deyil. Bu, boyanın normal tənəffüsə əlavə olaraq oksigen sərf edən redoks dövrəsi yaratdığını göstərir. Yalnız artımı bildirən metilen mavisi ilə oksigen sərfi analizi real kimyəvi prosesi ölçür, lakin enerjinin qorunması haqqında heç nə demir.

Bərpa təcrübələri eyni fərqi daha böyük miqyasda göstərir. Kompleks I bloklandıqda oksigen axını təxminən üçqat bərpa olunduğu halda, ATP sintezi yalnız təxminən 1.5 dəfə bərpa olunub. Elektroda daha çox oksigen çatıb. Lakin onun daha az hissəsi ATP istehsalına xidmət edib. Oksidləşdirici fosforlaşmanın yaxşılaşması barədə hər hansı iddia ATP tərəfinin də nəzərə alınmasını tələb edir; ideal halda bu, məxrəc üçün qəbul edilmiş hesablama qaydası göstərilməklə oksigen vahidinə düşən ATP nisbəti kimi ifadə olunmalıdır.

ATP analizləri sintez sürətini ölçür; ATP miqdarı bunu əvəz edə bilməz

ATP analizi fərqli bir suala cavab verir: vahid zamanda nə qədər ATP yaranır. İstər dəqiqələr ərzində izlənən işıldaböcək lusiferazasının lüminessensiyası, istərsə də 340 nm-də ölçülən əlaqələndirilmiş heksokinaza və qlükoza-6-fosfat dehidrogenaza analizi olsun, kinetik göstərici sürəti müəyyən edir. Tək bir son nöqtədə ümumi ATP-nin ölçülməsi isə miqdarı göstərir. Bu miqdar sintezlə sərf arasındakı fərqi əks etdirir və təkbaşına oksidləşdirici fosforlaşma haqqında az məlumat verir.

Budapeşt qrupu adenilat kinazanın fəaliyyəti basdırılmaqla əlaqələndirilmiş fermentativ üsuldan istifadə edib və 1 ilə 2 uM konsentrasiyasında metilen mavisinin rotenonla və antimisinlə işlənmiş mitoxondrilərdə ATP istehsalını cüzi, lakin statistik baxımdan əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını müəyyən edib. Bu, həqiqi, lakin qismən bərpadır. TEGDMA toksikliyi üzrə tədqiqat fərqli modeldə eyni xarakterli nəticəyə gəlib: 5 mM diş materialı monomeri TEGDMA Kompleks I ilə əlaqəli tənəffüsü təxminən 286 axın vahidindən 28-ə endirib, 2 uM boya isə onu təxminən 86-ya bərpa edib.

Rəngli redoks birləşməsi ilə işləyərkən iki nəzarət sınağı mütləqdir. Birincisi, ölçülən ATP sintezinin hansı hissəsinin ATP sintazadan asılı olduğunu müəyyən etmək üçün oliqomisinlə sınaq aparın. İkincisi, məlum miqdarda ATP, tam reagent qarışığı və istifadə olunan dəqiq boya konsentrasiyaları ilə hüceyrəsiz əlavəetmə-bərpa sınağı aparın; ən azı 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM və 2 uM konsentrasiyalarını daxil edin. Boya yayılan işığı uda, siqnal yaradan fermenti inhibə edə və ya reagentlərin redoks kimyasını dəyişə bilər. Ümumi lusiferaza analizi üzrə tövsiyələr məhz bu cür müdaxilələr üçün biokimyəvi əks-yoxlama sınaqlarını tövsiyə edir. Söndürülmə adətən daha yüksək konsentrasiyalarda güclü olduğuna görə 1 uM-də artefaktların olmadığını fərz etməyin.

Membran potensialı zondları axını deyil, boyanın paylanmasını ölçür

Safranin O, TMRM və TMRE, rodamin 123 və JC-1 membranı keçə bilən kationlardır. Onlar elektrokimyəvi tarazlığa uyğun olaraq mənfi yüklü matriksdə toplanırlar; buna görə ümumi flüoressensiya potensialı zondun harada yerləşməsi vasitəsilə dolayı şəkildə göstərir. Onların heç biri ATP-ni və ya elektron axınını ölçmür.

Hər zond üçün daha uyğun preparat növü var. Safranin O izolə edilmiş mitoxondrilərə və permeabilizə edilmiş hüceyrələrə uyğundur; adətən təxminən 2 uM konsentrasiyasında, təxminən 495 nm həyəcanlandırma və 585 nm emissiya ilə istifadə olunur. O, udulmanın ümumi flüoressensiyanı dəyişdirdiyi söndürülmə rejimində işləyir. TMRM və TMRE bütöv hüceyrələrdə aşağı nanomolyar yüklənmə ilə, söndürülmənin olmadığı rejimdə uyğundur; bu rejimdə depolyarizasiya boyanın çıxmasına və mitoxondrial flüoressensiyanın azalmasına səbəb olur. Yüksək yüklənmə zamanı öz-özünə söndürülmə siqnalın istiqamətini tərsinə çevirə bilər. JC-1 rahat yaşıl/qırmızı nisbəti verir, lakin yüklənmədən və mitoxondrial kütlədən asılıdır; buna görə kəmiyyət ölçmələri üçün ciddi nəzarət altında istifadə edilən TMRM-dən zəifdir. Bu üstünlük və məhdudiyyətlər geniş istifadə olunan mitoxondrial membran potensialı zondlarının icmalında ümumiləşdirilib.

Metilen mavisi məhz işçi konsentrasiyalarda optik müdaxilə yaradır. Onun təxminən 600 ilə 665 nm arasındakı udulma zolaqları qırmızı zond emissiyası ilə üst-üstə düşür; buna görə daxili filtr təsirləri, söndürülmə və həyəcanlandırıcı işığın udulması real ehtimallardır. Boya həm də paylanması ölçülən potensialdan asılı olaraq dəyişən ikinci lipofil kationdur. Buna qarşı yanaşma bir neçə göstərici və boş nümunə nəzarətidir: tək zond, tək boya, zondla birlikdə hər boya konsentrasiyası, sıfır istinad nöqtəsi kimi FCCP ilə tam depolyarizasiya və ideal halda optik baxımdan fərqli ikinci zond. Kompleks III-dən yan keçmə tədqiqatı antimisin və miksotiazolla inhibisiyadan sonra membran potensialının bərpasını həm safranin O, həm də TMRM ilə təkrar ölçərək eyni keyfiyyət xarakterli bərpanı əldə etməklə bu yanaşmaya nümunə yaradıb. Bir optik indikator ipucudur. İki müstəqil indikator isə dəlildir.

Üç preparat, üç fərqli sual

İzolə edilmiş mitoxondrilər, permeabilizə edilmiş hüceyrələr və bütöv hüceyrələr eyni analizin bir-birini əvəz edə bilən həssaslıq rejimləri deyil. Onlar fərqli iş prinsiplərinə malik fərqli anlayışlardır.

İzolə edilmiş mitoxondrilərdə elektron nəqli zənciri, daxili membran və matriksin molekulyar mexanizmləri qorunur, plazma membranı, sitozol və şəbəkə quruluşu isə aradan götürülür. Məqsəd də məhz budur: substratlar, ADP, inhibitorlar və boya konsentrasiyaları dəqiq müəyyən edilir, beləliklə, prosesin hansı yolla getdiyini təyin etmək olur. Bunun əvəzində təbii substrat təminatı, siqnallaşma və tələbat itirilir.

Permeabilizə edilmiş hüceyrələrdə mitoxondrilər hüceyrə quruluşunun böyük hissəsi daxilində qalır, xaricdən verilən substratlar və ADP isə açılmış plazma membranından keçir. Hüceyrə kontekstində substrat yolundakı qüsuru müəyyən etmək üçün onlar düzgün vasitədir. Həddindən artıq permeabilizasiya xarici membranı zədələyir, sitozolik tənzimləmə isə yuyulub itir.

Bütöv hüceyrələrdə hər şey qorunur: plazma membranı baryeri, sitozolik reduksiyaedicilər, endogen substrat nəqli, mitoxondrial şəbəkə və ATP tələbatı. Onlar fiziologiyaya ən yaxın, mexanizmin aydınlaşdırılmasına isə ən uzaq modeldir, çünki boyanın hüceyrəyə daxil olması, reduksiyası və ayrı bölmələrdə tutulması mitoxondrilərin faktiki boya məruzqalmasını birlikdə formalaşdırır.

TEGDMA tədqiqatında hər üç səviyyədən məqsədyönlü istifadə olunub: boyanın oksidləşməni və potensialı bərpa etməsini öyrənmək üçün izolə edilmiş beyin mitoxondrilərindən, pozuntunun əsasən Kompleks I ilə əlaqəli substrat oksidləşməsində olduğunu müəyyən etmək üçün permeabilizə edilmiş diş pulpası kök hüceyrələrindən, 2 uM boyanın basdırılmış oksigen sərfinə ümumi fizioloji təsirini qiymətləndirmək üçün isə bütöv kök hüceyrələrdən. Müxtəlif preparatlardakı mitoxondrial göstəriciləri müqayisə edən oxucular üçün metilen mavisinin elektronları tənəffüs zənciri boyunca necə ötürdüyünə dair əlavə izah yazısı bu yolların əsaslarını verir, metilen mavisi ilə tənəffüs tədqiqatlarını şərh etməyə dair bələdçi isə doza və inhibitor seçiminin məntiqini əhatə edir.

Redoks-aktiv boyanın tələb etdiyi nəzarət sınaqları

Redoks dövriyyəçisi adi inhibitordan daha geniş nəzarət siyahısı tələb edir, çünki yalnız boyanın iştirak etdiyi kimyəvi proseslər bioloji prosesləri təqlid edə bilər.

Respirometriya üçün göstərici sürüşməsini qiymətləndirmək məqsədilə yalnız bufer olan kamera, bioloji material olmadan bufer və boya olan kamera, analizdə mövcud olan hər hansı hüceyrəxarici reduksiyaedici ilə birlikdə boya sınağı və bütöv hüceyrələrdə qeyri-mitoxondrial oksigen sərfini müəyyən etmək üçün son mərhələdə rotenonla antimisin sınağı aparın. Nəzərə alın ki, reduksiya olunmuş boya elektronları oksigenə ötürərək yenidən oksidləşir və hidrogen peroksid əmələ gətirir. Buna görə elektron donoru olmayan, yalnız boya ehtiva edən boş nəzarət nümunəsi NADH və ya NADPH mövcud olduqda yaranan hüceyrəsiz oksigen sərfini olduğundan az göstərir.

Hidrogen peroksid üçün qeyri-selektiv DCFDA boyaları əvəzinə kalibrə edilmiş Amplex UltraRed və qıtıqotu peroksidazasına üstünlük verin, katalaza ilə yoxlayın və işıqlandırmadan asılılığı sınaqdan keçirin, çünki boya fotosensibilizatordur. Beyin mitoxondriləri üzrə tədqiqat cəmi 100 nM boya konsentrasiyasında peroksid yükünün dörd dəfədən çox artdığını, onun aradan qaldırılmasının isə yavaşladığını müəyyən edib; peroksid aralıq superoksid mərhələsi olmadan birbaşa reduksiya olunmuş boya tərəfindən əmələ gəlib. Zond seçimi və işıqlandırma nəzarətləri barədə təfərrüatlar boya təcrübələrində reaktiv oksigen növlərinin ölçülməsi haqqında əlavə yazıda verilir. Peroksidin nə vaxt siqnal, nə vaxt isə yük kimi çıxış etməsi barədə daha geniş sual hüceyrə redoks tarazlığı və antioksidant iddiaları ilə birlikdə müzakirə olunur.

Elektron ötürmə yollarına dair iddialar üçün Kompleks III inhibitorlarının hər iki bağlanma sahəsini sınaqdan keçirin: Qi sahəsində antimisin A və Qo sahəsində miksotiazol; bunlara sianidlə Kompleks IV üzrə son mərhələ yoxlamasını da əlavə edin. Əvvəlki siçan beyni tədqiqatı boyanın rotenonla bloklanmış tənəffüsü bərpa etdiyini, antimisinlə bloklanmış tənəffüsü isə bərpa etmədiyini bildirib. Sonrakı, üç növ üzərində aparılan tədqiqat isə hər iki inhibitorla qismən bərpa və sitoxrom c-nin birbaşa reduksiyasına dair dəlil aşkar edib. Yan keçmə mexanizmini qəti sübut olunmuş deyil, daha yeni məlumatlarla uyğun gələn izah kimi qəbul edin, çünki boya konsentrasiyası, inhibitorun bağlanma sahəsi, substrat vəziyyəti və boyanın paylanması müşahidə olunan yolu dəyişdirir.

Analiz seçimi matrisi

Bu cədvəldən sualı ölçməyə uyğunlaşdırmaq üçün deyil, suala uyğun ölçməni seçmək üçün istifadə edin.

İddianın inandırıcı olması üçün minimum tələb eyni boya konsentrasiyalarını — 100 nM, 300 nM, 1 uM və 2 uM — sızma, ADP, oliqomisin və ayırıcı maddə şəraitlərində oksigen axını ölçmələrində, ATP sintezi sürətinin ölçülməsində, üstünlük verilən halda iki zondla membran potensialının ölçülməsində, eləcə də katalaza və hüceyrəsiz nəzarət sınaqları ilə kalibrə edilmiş peroksid ayrılması ölçmələrində istifadə etməkdir. Bir-biri ilə əlaqəli göstəricilər toplusunu təqdim edin: oksigen axını, ATP sintezi sürəti, oksigen vahidinə düşən ATP, potensial və peroksid. Bu rəqəmlərdən hər hansı biri təkbaşına mənası hələ müəyyənləşdirilməmiş ölçmədir.