Metilen mavisi ilə maya testləri: canlı hüceyrələrin sayılması və tənəffüs müddətinin ölçülməsi

Laboratoriya masasında iki sınaq şüşəsi var. Hər ikisi mavidir. Birində mikroskop altında görünən mavi hüceyrələr ölü maya deməkdir. Digərində sınaq şüşəsinin mavidən rəngsizə çevrilməsi mayanın canlı olduğunu və tənəffüs etdiyini göstərir. Eyni boya, əks yozumlar. Bu iki testi qarışdırsanız, bütün nəticələr tərsinə çevrilər.

Bütün məqalə bu fərq üzərində qurulub. Metilen mavisi oksidləşmə-reduksiya boyasıdır: oksidləşmiş halda mavidir, reduksiya olunduqda isə rəngsiz leykometilen mavisinə çevrilir. Canlılıq sayımı bu kimyəvi xüsusiyyətdən qısamüddətli mikroskopik müşahidədə istifadə edir. Tənəffüs təcrübəsi isə ondan bütün məhlulda gedən, müddəti ölçülən reaksiyada istifadə edir. Hər birinə ayrıca protokol, ayrıca nəzarətlər və ayrıca tənqidi yanaşma lazımdır.

Canlılıq sayımı: qısa boyama, dərhal qiymətləndirmə

Pivəçilikdə istifadə olunan protokol ən çox standartlaşdırılmış variantdır. 2% natrium sitratda 0.01% w/v metilen mavisi hazırlayın, maya suspenziyası ilə 1:1 nisbətində qarışdırın və qısa, sabit müddətdən sonra qarışığı yoxlayın. Dərc olunmuş müddətlər Brewing Science Institute təlimat kitabçasında 1–2 dəqiqədən tədqiqat protokollarında təxminən 5 dəqiqəyə qədər dəyişir; OIV-nin şərab mikrobiologiyası metodu isə yoxlamanın 10 dəqiqə ərzində aparılmasını tələb edir. Sayım qarışığında boyanın son qatılığı təxminən 0.005% olur. Təkmilləşdirilmiş Neubauer kamerasını doldurun və təxminən 400x böyütmədə tünd mavi hüceyrələri canlı olmayan, boyanmamış hüceyrələri isə canlı kimi təsnif edin. OIV metodunda açıq mavi hüceyrələr canlı sayılır; bu, artıq aşağıda müzakirə olunan subyektivlik probleminə işarə edir.

Hüceyrə qatılığı kameranın həndəsəsinə əsasən hesablanır. Mərkəzi 1 mm-lik kvadrat bütövlükdə sayıldıqda, mL başına hüceyrə sayı N vurulsun durulaşdırma əmsalı vurulsun 10^4 olur; burada N həmin sahədə sayılan hüceyrələrin sayıdır. Bu hesablama ASBC-nin maya metodlarında göstərilib. Canlılığın hesablanması daha sadədir: boyanmamış hüceyrələrin sayını ümumi hüceyrə sayına bölüb 100-ə vurun. FEMS-in pivəçilik üzrə müqayisəli tədqiqatına və OIV təcrübəsinə uyğun olaraq, canlılığı qiymətləndirmək üçün təxminən 400 hüceyrə sayın. Eyni sərhəd qaydasını ardıcıl tətbiq edin; məsələn, aşağı və sol tor xətlərindəki hüceyrələri daxil edin, yuxarı və sağ xətlərdəkiləri isə daxil etməyin.

Saymağa başlamazdan əvvəl tumurcuqlar üçün qayda müəyyən edilməlidir. Geniş istifadə olunan yanaşmaya görə, tumurcuq ana hüceyrənin ölçüsünün təxminən yarısına çatdıqda ayrıca hüceyrə sayılır; bundan kiçikdirsə, ana hüceyrə ilə birlikdə sayılır. Hansı qaydanı seçirsinizsə, onu hər kvadrata tətbiq edin və sayım vərəqinə yazın ki, növbəti şəxs də eyni qaydanı təkrarlasın.

Sayım vərəqi (bunu çap edin)

Bu vərəq məqalə üçün hazırlanmış orijinal materialdır. Onu dəftərə köçürün və ya hər nümunə üçün bir nüsxə çap edin.

Canlılıq (%) = 100 x boyanmamış / (boyanmamış + tünd mavi). mL başına ümumi hüceyrə sayı = N x durulaşdırma əmsalı x 10^4; burada N kameranın müəyyən edilmiş sahəsindəki saydır. Boyama müddətini nəticənin yanında qeyd edin, çünki müddəti göstərilməyən canlılıq göstəricisini təkrar əldə etmək mümkün deyil.

Canlılıq göstəriciləri niyə dəyişir

İlk təsiredici amil vaxtdır və onun təsiri iki istiqamətdə olur. Metabolik aktiv hüceyrələr boyanı reduksiya edir; buna görə erkən qiymətləndirmə canlı hüceyrələri reduksiyanı tamamlamamış aşkar edə və onları səhvən ölü kimi təsnif edə bilər. Lakin uzunmüddətli təmasın özü toksikdir və həqiqətən zədələnmiş mavi hüceyrələr yaradır, nəticədə ölümü göstərən boyanma yanlış olaraq artır. Buna görə laboratoriya tədris protokolu qiymətləndirmənin 5 dəqiqə ərzində aparılmasını tələb edir; bu, Wisconsin maya tədris protokolunda sənədləşdirilib. Ehtiyatlı nəticə belədir: metilen mavisi ilə qiymətləndirmə vaxtdan asılıdır, buna görə bir qısa müddət seçin və seriyadakı bütün nümunələr üçün onu sabit saxlayın.

Canlılığı aşağı olan nümunələrdə ikinci bir qərəz yaranır. Standartlaşdırılmış metod xəbərdarlıq edir ki, canlılıq təxminən 80%-dən aşağı olduqda metilen mavisi həqiqi canlılığı olduğundan yüksək göstərə bilər, çünki hələ də boyanı reduksiya edən hüceyrələr çoxalma qabiliyyətini saxlamaya bilər. Pivəçilik ədəbiyyatında da canlılıq əhəmiyyətli dərəcədə zəiflədikdə eyni etibarsızlıq təsvir olunur. Metilen mavisini sürətli, təxmini qiymətləndirmə vasitəsi kimi qəbul edin və aşağı canlılıqla bağlı mühüm qərarları, məsələn, kulturanın yenidən fermentasiyada istifadəsini, qidalı mühitdə koloniya sayımı və ya tamamlayıcı boya ilə təsdiqləyin.

Üçüncü amil nümunə matrisinin təsiridir. OIV metodu təxminən pH 4.6 şəraitində aparılır və güclü buferlənmiş, aşağı pH-lı nümunələrin boyanın düzgün davranmasına mane olduğunu bildirir. Həmçinin şəkər miqdarı 100 g/L-dən yüksək olduqda bu testdən istifadə etməməyi tövsiyə edir, çünki belə şəraitdə hüceyrələr yanıltıcı şəkildə açıq mavi görünür. Boyama zamanı pH-ın eksperimental müqayisəsi yoxlanmış diapazonda həssaslığın əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdiyini göstərib; bu, pH-dan asılı metilen mavisi metodu üzrə tədqiqatla uyğun gəlir. Qalıqlar ayrıca tələdir: çirkli mayşələrdə boyanmış hissəciklər ölü hüceyrələrə bənzəyir və operatorlar arasındakı dəyişkənliyi artırır.

Bu dəyişkənlik sadəcə müşahidə deyil, kəmiyyətcə ölçülüb. FEMS-in maya müqayisəsində bildirilən altı aylıq pivəçilik sınağında metilen mavisi ilə təkrar ölçmələrin standart sapması orta hesabla 6.1%, oksonol ilə axın sitometriyasında isə 0.2% olub; eyni nümunədə iki operatorun nəticələri arasında fərq 13 faiz bəndinə qədər çatıb. Canlılıq metodlarının 2023-cü il kəmiyyət müqayisəsi flüoressensiya mikroskopiyasının və axın sitometriyasının xeyli daha dəqiq olduğunu müəyyən edib, eyni zamanda metodun göstəricilərinin növdən və matrisdən asılı olduğunu göstərib. Painting və Kirsopun klassik metod təsviri (PMID 24430080) əsas istinad olaraq qalır; mayanın canlılıq və fizioloji aktivlik testlərinə dair daha geniş icmal (PMID 25154541) isə metilen mavisini qəti nəticə verən deyil, tamamlayıcı testlər sırasına daxil edir. Tripan mavisi burada avtomatik olaraq daha yaxşı seçim deyil: o, membran bütövlüyünün itirilməsini göstərir, metilen mavisi isə boyanın hüceyrəyə daxil olmasını və reduksiya aktivliyini əks etdirir. Buna görə stresə məruz qalmış hüceyrələr bu iki boya ilə fərqli təsnif oluna bilər.

Tənəffüs təcrübəsi: mavi rəngin itmə müddətini ölçün

İkinci testdə mikroskopdan ümumiyyətlə istifadə olunmur. Maya, qlükoza və durulaşdırılmış metilen mavisi qapalı sınaq şüşəsinə yerləşdirilir, saniyəölçən isə mavi rəngin nə qədər müddətə itdiyini ölçür. Hüceyrələr metabolizm zamanı mavi boyanı rəngsiz formaya çevirən reduksiya ekvivalentləri yaradır, həll olmuş oksigen isə onu yenidən oksidləşdirir. Hüceyrələr oksigeni azaltdıqdan sonra reduksiya üstünlük qazanır və sınaq şüşəsindəki məhlul rəngsizləşir. Beləliklə, son nöqtə tənəffüs, boya qatılığı və oksigenin mövcudluğu arasındakı tarazlığı əks etdirir. Nəticə molekulyar oksigenin birbaşa istehlak sürəti kimi deyil, metilen mavisinin reduksiya və ya rəngsizləşmə müddəti kimi bildirilməlidir.

Müddətin ölçmə üçün əlverişli aralığa düşməsi üçün canlılıq testindən xeyli daha durulaşdırılmış boya istifadə edin. AQA-nın A level üzrə məcburi praktiki işlər kitabçası bunu yaxşı standartlaşdırır: təxminən 30 C-yə qədər isidilmiş 100 mL suya 1 g qlükoza, istifadədən dərhal əvvəl əlavə olunan 5 g quru maya və 1%-lik ehtiyat məhlulun 0.1 mL-ni 100 mL-ə qədər durulaşdırmaqla hazırlanmış, təxminən 0.001%-lik işçi boya məhlulu. 2 mL maya-qlükoza suspenziyasını 2 mL işçi boya məhlulu ilə qarışdırın, sınaq temperaturuna çatmasını gözləyin, bir dəfə 10 saniyə çalxalayın, saniyəölçəni başladın və bir daha çalxalamayın. Çalxalama oksigeni yenidən məhlula daxil edir və sınaq şüşəsində mavi rəngi bərpa edir; bu, prosedurdan qaynaqlanan ən böyük artefaktdır. AQA qeyd edir ki, hazırlanan qarışıq adətən 35 C-də təxminən 5 dəqiqə ərzində rəngsizləşməlidir; sınaqlarda orta müddətlər 20 C-də 275 s, 35 C-də 128 s və 45 C-də 145 s olub. Bunlar bir təcrübə quruluşundan alınmış nümunələrdir, universal meyarlar deyil. Nəzarət olunan şəraitdə reduksiya sürəti ilə metabolik aktiv maya arasındakı kəmiyyət əlaqəsi xüsusi reduksiya tədqiqatları ilə, o cümlədən PMID 25773544 kimi indekslənmiş iş və Yeast (2014) jurnalındakı mexanizm tədqiqatı ilə dəstəklənir.

Zamana görə dəyişmənin nümayişi (orijinal material)

Aşağıdakı cədvəl yuxarıda təsvir edilən AQA tipli quruluşdan istifadə edilərək bu məqalə üçün hazırlanmış orijinal nümayişdir: 2 mL maya-qlükoza qarışığı və təxminən 0.001%-lik 2 mL işçi boya məhlulu, bir dəfə 10 saniyəlik çalxalama, sonra hərəkətsiz inkubasiya. Cədvəldəki göstəricilər tələbə qrupunun qeyd etməli olduğu formatda verilmiş nümunə nəticələrdir; sürət indeksi 1-in saniyə ilə ifadə olunan rəngsizləşmə müddətinə bölünməsi kimi müəyyən edilir. Eyni sınaq şüşələri ilə təcrübəni aparın və bu qeydləri ölçülmüş qiymətlərlə əvəz edin.

A, B və C sınaq şüşələri üçün sürət indeksinin temperaturdan asılılıq qrafikini çəkin. Əyri əvvəlcə yüksəlir, sonra yastılaşır və ya enir; bu, düz xətt deyil, fermentlərin fəaliyyəti ilə bağlı gözlənilən formadır. D, E və F sınaq şüşələri həmin əyrinin məlumat nöqtələri deyil. Onlar əyrinin şərhini mümkün edən nəzarətlərdir.

Hər testin mənalı nəticə verməsini təmin edən nəzarətlər

Hər tənəffüs sınağına üç əlavə nümunə lazımdır. Qaynadılmış və ya öldürülmüş maya, qlükoza və boya qarışığı mavi qalmalıdır; bu, sürətli reduksiyanın canlı metabolizmdən asılı olduğunu göstərir. Əlavə qlükoza olmadan canlı maya və boya substrat nəzarətidir, lakin maya hüceyrədaxili ehtiyatlarını sərf etdiyindən yenə də yavaş rəngsizləşmə gözləyin. Mayasız qlükoza və boya qarışığı kimyəvi boş nümunədir və vacibdir, çünki qələvi şəraitdə qlükoza heç bir hüceyrə olmadan metilen mavisini reduksiya edə bilər.

Canlılıq sayımına başqa növ nəzarət lazımdır: prosedurun dəyişməzliyi. Eyni boya ehtiyat məhlulu, eyni qarışdırma nisbəti, eyni boyama müddəti, eyni kamera sahəsi, eyni tumurcuq və sərhəd qaydaları; mümkün olduqda sayım nümunənin kimliyini bilmədən aparılmalıdır. İki operatorun nəticələri on faiz bəndi fərqləndikdə, sayım vərəqi adətən səbəbi üzə çıxarır: fərqli müddət, mavi rəng üçün fərqli hədd və ya fərqli tumurcuq qaydaları. Boyanmış hüceyrələrin hazırlanması və müşahidəsi üsulları bakteriyaların sadə boyanması metodları ilə əlaqəlidir; boyanın müxtəlif nümunələrdə nəyi işarələdiyinə dair daha geniş icmal isə mikroskopik boyama atlasında verilib. Mavi rəngin istənilən intensivliyinin kəmiyyətcə qiymətləndirilməsinin fiziki əsasları üçün şəraiti qeyd olunmuş udulma üzrə istinad materialı hər bir əmsalın niyə həlledici, pH və qatılıq şəraiti ilə birlikdə verilməli olduğunu izah edir.

Testi suala uyğun seçin. Hazırda neçə hüceyrənin canlı olması sayım sualıdır və mikroskopla, sayım vərəqindən istifadə etməklə cavablandırılır. Bu kulturanın nə qədər aktiv tənəffüs etməsi isə kinetik sualdır və saniyəölçənlə, nəzarət olunan sınaq şüşələri ilə cavablandırılır. Metilen mavisi hər ikisinə xidmət edir, lakin heç vaxt eyni sınaq şüşəsində eyni anda yox.