Metilen mavisi üçün kalibrləmə əyrisinin qurulması: boş nümunələr, diapazon və xəttilik

İki analitik eyni metilen mavisi ehtiyat məhlulu şüşəsindən istifadə edir və hər biri kalibrləmə əyrisi qurur. Birincisi koordinat başlanğıcından keçən düz xətt əldə edir və qatılığı məlum olmayan nümunələri inamla ölçür. İkincisi isə yuxarı hissədə əyilən xətt, sıfıra yaxınlaşmayan sərbəst hədd və durulaşdırma ilə dəyişən nümunə nəticələri alır. Eyni boya, eyni cihaz, eyni dalğa uzunluğu. Fərq bacarıqda deyil. Fərq planlaşdırmadadır: boş nümunənin tərkibində nə olduğu, hansı qatılıqların seçildiyi və yoxlanılan diapazonun sadə bir modelin hələ də keçərli olduğu sahədə qalıb-qalmadığı.

Kalibrləmə əyrisi cihazın cavab siqnalı ilə qatılıq arasında yalnız qurulduğu şəraitdə keçərli olan bir razılaşmadır. Metilen mavisi üçün bu razılaşmanın məlum zəif nöqtəsi var. Boya suda öz-özünə assosiasiya edir, buna görə də işığı udan kimyəvi forma qatılıqla dəyişir. Bu dəyişikliyi əhatə edən əyri düz olmayacaq və heç bir statistik üsul bunu düzəltməyəcək. Bu məqalə xəttin mənalı olması üçün əyrinin necə planlaşdırılacağını göstərir: düzgün boş nümunəni seçin, diapazonu monomerin üstünlük təşkil etdiyi sahədə saxlayın, təkrarları dürüst şəkildə aparın və əyriliyi küy kimi deyil, məlumat kimi şərh edin.

Standartlardan deyil, boş nümunədən başlayın

Boş nümunə sıfırı müəyyənləşdirir və metilen mavisi üçün boyadan başqa hər şeyi ehtiva etməlidir. Eyni su keyfiyyət dərəcəsi, eyni bufer və pH, eyni duzlar, eyni birgə həlledici payı, eyni temperatur. Kalibrləmə məhlullarını həmin eyni matrisdə hazırlayın. Səbəb bürokratik deyil, kimyəvidir. Duz və həlledici monomer, dimer və daha yüksək aqreqatlar arasındakı tarazlığı dəyişir; bu isə ölçmə dalğa uzunluğundakı spektri dəyişdirir. Yalnız sudan ibarət boş nümunə matrisin kimyəvi formaların paylanmasında yaratdığı dəyişikliyi kompensasiya edə bilməz. Metilen mavisinin suda spektrlərinin qlobal təhlili, açıq girişli qeydindən də əldə edilə bilər; bu tədqiqatda natrium xlorid məhz ion qüvvəsi tarazlığı dəyişdirdiyi üçün 0-dan 0.15 M-ə qədər dəyişdirilmiş və duz artdıqca aqreqasiya güclənmişdir.

Bunun bir praktik nəticəsi var: heç vaxt deionlaşdırılmış suda kalibrləmə aparıb sonra nümunələri fosfat buferində və ya tullantı su filtratında ölçməyin. Analiti ehtiva etməyən matris yoxdursa, nümunənin özünə standart əlavə etmə üsulu uyğunlaşdırılmamış xarici əyridən daha yaxşıdır. Sulu mühitdə analizlərin etibarlılığının qorunmasına dair əlaqəli tövsiyələr matris və maneə yaradan təsirlər haqqında müzakirədə, boyaların kəmiyyət analizinin ümumi prinsipləri isə analiz planlaşdırılmasına ümumi baxışda verilir.

Bir kimyəvi formanın üstünlük təşkil etdiyi diapazonu seçin

664 nm yaxınlığındakı uzun dalğa zolağında kəmiyyət təyini boyanın böyük hissəsinin monomer formasında olduğunu fərz edir. Adi suda bu fərziyyə yalnız məhlullar duru qaldıqda, təxminən aşağı mikromolyar sahədə keçərlidir. Dərc edilmiş empirik meyl əmsalları bu sərhədi göstərir: 1 cm küvetlərdə təxminən 7 mikromolyardan aşağı saxlanılan kalibrləmələr 82,000 M-1 cm-1 yaxınlığında meyl əmsalı verir, təxminən 37 mikromolyara qədər genişləndirilən kalibrləmədə isə bu göstərici təxminən 67,100-ə düşür, çünki ən yüksək qatılıqlı standartlarda artıq nəzərəçarpan miqdarda dimer var. Burada göstərilən hər bir əmsal metilen mavisi üçün spektral məlumat mənbəyində müvafiq şəraitlə birlikdə təqdim olunur; rəqəmləri müqayisə etmək üçün doğru mənbə odur. Bu məqalədə həmin əmsallardan yalnız diapazonu müəyyənləşdirmək üçün istifadə edilir.

Planlaşdırma qaydaları birbaşa bundan irəli gəlir:

1. Ən yüksək qatılıqlı standartı kifayət qədər duru saxlayın ki, spektrin forması sabit qalsın. Metodun hazırlanması zamanı tək bir dalğa uzunluğunda ölçmək əvəzinə, hər səviyyə üçün bütün görünən diapazonu (təxminən 550–750 nm) skan edin. Normallaşdırılmış spektrlərin forması qatılıqla dəyişirsə, kimyəvi vəziyyət dəyişir və diapazon həddindən artıq genişdir.
2. Səviyyələr üzrə 610 nm yaxınlığındakı absorbansın 665 nm yaxınlığındakı absorbansa nisbətini izləyin. Qatılıqla artan nisbət dimer çiyninin böyüdüyünü və monomer modelinin artıq işləmədiyini göstərir. Bu diaqnostik göstərici aqreqasiya və qatılıq təsirləri üzrə təlimatda daha ətraflı izah olunur.
3. Aşağı mikromolyar qatılıqlarda işləmək üçün 1 cm küvetdən istifadə edin. Meyl əmsalı təxminən 82,000 olduqda, 5 mikromolyar təxminən 0.41, 10 mikromolyar isə təxminən 0.82 absorbans verir; hər iki göstərici əksər cihazlar üçün münasibdir.
4. Qatı ehtiyat məhlulları üçün 1-dən xeyli yüksək absorbansı qəbul etmək əvəzinə optik yolu qısaldın, lakin unutmayın ki, qısa yol fotometriyanı düzəldir, kimyəvi vəziyyəti yox. Aqreqasiya optik yol uzunluğundan deyil, qatılıqdan asılıdır; buna görə də qatı ehtiyat məhluluna duru monomer əyrisini tətbiq etmək əvəzinə, onun kimyəvi formalarının paylanmasını nəzərə alan ayrıca yanaşma lazımdır.

Bu mənzərənin böyük hissəsinin əsasını təşkil edən qlobal uyğunlaşdırma 1.1 mikromolyardan 3.4 millimolyara qədər 224 spektri əhatə etmiş və tetramer siqnalının artıq 34 mikromolyardan aşağı qatılıqlarda aşkar edilə bildiyini göstərmişdir. Bu nəticə yanaşmanı müəyyənləşdirir: xətti sahə intuisiyanın düşündürdüyündən daha dardır, ona görə də onu fərz etmək əvəzinə yoxlayın.

Səviyyələr, təkrarlar və ardıcıllıq

Üç nöqtəli əyri heç nəyi sübut etmir. ICH Q2(R2) validasiya təlimatı xəttiliyin qiymətləndirilməsi üçün ən azı beş qatılıq tələb edir; altı-səkkiz sıfırdan fərqli səviyyə isə, xüsusilə aqreqasiyanın başladığı yuxarı hissəyə yaxın, daha inandırıcı işçi əyri verir. Səviyyələri rahatlıq üçün seçilmiş həndəsi silsilə şəklində deyil, nəzərdə tutulan nümunə diapazonunu əhatə edəcək və əyriliyin ən çox ehtimal olunduğu sahədə daha sıx yerləşəcək şəkildə seçin.

Hər səviyyəni bir kolbadan üç dəfə ölçmək əvəzinə, müstəqil hazırlanmış iki və ya üç təkrarda ölçün. Müstəqil təkrarlar hazırlama xətasını üzə çıxarır; bir kolbadan təkrar ölçmələr isə yalnız cihaz küyünü göstərir. 2020-ci ilin qlobal tədqiqatında hər məhlul üç dəfə ölçülmüşdür və bu, hələ də əsaslandırılmış ilkin seçimdir. Ölçmə ardıcıllığını təsadüfiləşdirin ki, siqnal sürüşməsi, şüşəyə adsorbsiya və ya temperatur dəyişikliyi əyrilik kimi görünməsin. Kvars küvetlərlə aparılmış bir tədqiqatda 34 mikromolyar məhluldakı boyanın təxminən 3 faizinin 10 dəqiqə ərzində adsorbsiya olunduğu müəyyən edilmişdir; buna görə də bütün ölçmə seriyası boyunca təmas müddətini, küveti, təmizləmə qaydasını və ardıcıllığı sabit saxlayın.

İzahlı hesablama nümunəsi (ölçülmüş məlumatlar deyil)

Aşağıdakı rəqəmlər hesablamanı göstərmək üçün uydurulub. Bunlar laboratoriya ölçmələri deyil və metilen mavisi məlumatları kimi istinad edilməməlidir. Əhəmiyyətli olan onların ətrafında qurulan yoxlamaların ardıcıllığıdır.

Fərz edək ki, uyğunlaşdırılmış buferdə altı standart 1 cm optik yolda, uyğunlaşdırılmış boş nümunəyə qarşı 665 nm-də ölçülür:

Orta absorbansın qatılıqdan asılılığının düz xəttlə uyğunlaşdırılması hər mikromolyara təxminən 0.0805 absorbans vahidi olan meyl əmsalı və sıfırdan yalnız bir neçə milliabsorbans vahidi fərqlənən sərbəst hədd verir. Meyl əmsalını optik yol uzunluğuna bölmək onu görünən udma əmsalına çevirir: hər mikromolyara 0.0805 təxminən 80,500 M-1 cm-1-ə bərabərdir və bu, suda monomerin üstünlük təşkil etdiyi intervala uyğundur. Əhəmiyyətli yoxlama R kvadratı deyil; o, hər iki halda əla görünəcək. Əhəmiyyətli olan sıfıra yaxın sərbəst hədd, S2-dən S5-ə qədər sabit A610/A665 nisbəti və heç bir meyl göstərmədən səpələnən qalıqlardır. S6-da nisbətin artması həmin səviyyəni ya çıxarmaq, ya da 7 mikromolyarı bu matris və cihaz kombinasiyası üçün müvəqqəti yuxarı hədd kimi qeyd etmək üçün dürüst siqnaldır.

Eyni şəraitdə 0.245 göstəricisi verən, qatılığı məlum olmayan nümunə birbaşa hesablanır: 0.245-i hər mikromolyara 0.0805-ə bölmək, nümunənin hər hansı durulaşdırma əmsalı tətbiq edilməzdən əvvəl, təxminən 3.0 mikromolyar verir. Nəticəni müvafiq şəraitlə birlikdə təqdim edin: dalğa uzunluğu, optik yol, boş nümunənin matrisi, kalibrləmə intervalı və tarix.

Doldurula bilən kalibrləmə iş vərəqi

Hər yeni matris üçün bu şablonu laboratoriya qeydlərinə köçürün. Bir matris, bir vərəq, bir əyri.

Reagentin forması üçün ayrılmış sətir səbəbsiz deyil. Satışda olan metilen mavisi susuz duz və ya trihidrat kimi bir hidrat ola bilər; yanlış molyar kütlə isə hər nominal qatılıqda nəzərə çarpmadan sistematik xəta yaradır. Başlanğıc materialının saflıq və spesifikasiya yoxlamaları keyfiyyət və dərəcə təlimatında izah olunur.

Müstəqil yoxlama standartı ilə təsdiqləyin

Kalibrləmə əyrisi heç vaxt özünü qiymətləndirməməlidir. Uyğunlaşdırmadan sonra ayrıca çəkilmiş materialdan hazırlanmış ehtiyat məhlulundan, qəbul edilmiş intervalın ortasına yaxın qatılıqda bir yoxlama standartı hazırlayın və onu qatılığı məlum olmayan nümunə kimi ölçün. Bir neçə faiz daxilində uyğunluq hazırlama zəncirini təsdiqləyir; uyğunsuzluq isə cihazdan çox ehtiyat məhluluna və ya durulaşdırmalara işarə edir. Hər nümunə partiyası ilə yoxlama standartını yenidən ölçün. Əyri dəyişmədiyi halda onun nəticəsi sürüşürsə, nümunələrdən əvvəl işçi məhlullardan və ya küvetdən şübhələnin. Təkcə bu vərdiş nəzərə çarpmayan xətaların əksəriyyətini üzə çıxarır: susuz reagent şüşəsi üçün hidratın molyar kütləsinin tətbiqi, kalibrlənməsi pozulmuş mikropipet, yanlış ion qüvvəsində hazırlanmış bufer. Yoxlama standartının bərpa faizini iş vərəqində meyl əmsalının yanında qeyd edin ki, sonradan oxuyan şəxs xəttin sadəcə çəkilmədiyini, yoxlanıldığını görə bilsin.

Qeyri-xəttiliyin diaqnostik şərhi

Əyri əyildikdə, pozulmanın forması səbəbi müəyyənləşdirir. Spektrin forması dəyişmədən yüksək absorbansda aşağıya doğru əyrilik cihazı göstərir; çox vaxt səpələnmiş işıq yüksək absorbans göstəricilərini olduğundan aşağı göstərir. 610 nm çiyninin böyüməsi ilə müşayiət olunan əyrilik kimyəvi vəziyyətə işarə edir: dimer və daha yüksək aqreqatlar işığı monomerdən fərqli şəkildə udur. Sıfırlanmayan boş nümunə və ya göstəriciləri zamanla azalan standartlar qaba işarə edir: şüşəyə və ya küvetlərə adsorbsiya, xüsusilə ölçmə seriyası boyunca təmas müddətləri fərqli olubsa. Nöqtələrdən keçən səliqəli xəttə baxmayaraq nümunə nəticələrinin yanlış olması isə matrisi göstərir: nümunələr kalibrləmə məhlullarından fərqlənir, buna görə də əyrini nümunə matrisində yenidən qurun və ya standart əlavə etmə üsuluna keçin. Hər halda qalıqların qatılıqdan asılılıq qrafikini qurun. Təsadüfi səpələnmə düz xətt modelini dəstəkləyir; təbəssüm və ya qaşqabaq formasındakı paylanma isə onu istənilən R kvadratı həddindən daha etibarlı şəkildə təkzib edir. Validasiya təlimatı bu məqamı açıq şəkildə təsdiqləyir.

Metilen mavisi ilə bu intizam öz bəhrəsini verir. Onun monomer zolağı güclüdür, kimyəvi davranışı yaxşı öyrənilib və nəticələri pozan amillər rəqəmləri təhrif etməzdən əvvəl spektrdə özlərini göstərir. Əyrini dar diapazonda qurun, boş nümunəni düzgün seçin, təkrarları müstəqil hazırlayın və diapazonun seçimini spektrlərin formasına əsaslandırın. Alınan xətt qısadır, lakin üzərindəki hər nöqtə etibarlıdır.

Bu məqalədəki izahlı hesablamalarda metodu nümayiş etdirmək üçün uydurma rəqəmlərdən istifadə olunur. Tam ölçmə şəraiti ilə birlikdə ölçülmüş istinad əmsalları keçid verilmiş spektral məlumat mənbəyində təqdim edilir; əsas aqreqasiya tədqiqatı isə PMID 33251415 altında indeksləşdirilib.