Metilen mavisi və iltihabi siqnallaşma: inflammasomlar, IL-6 və STAT3

Tutaq ki, üç laboratoriya eyni mavi birləşmənin iltihabəleyhinə təsir göstərdiyini bildirir. Biri makrofaqlardan daha az IL-1beta ifraz olunduğunu göstərir. Digəri eyni hüceyrə tipində iNOS fermentinin miqdarının azaldığını göstərir. Üçüncüsü qanda IL-6 səviyyəsinin və beyində STAT3 aktivliyinin azaldığını göstərir. Bu üç nəticəni vahid iddiada birləşdirmək istəyi yarana bilər. Lakin belə bir birləşdirmə tapıntının mahiyyətini gizlədir.

Hər nəticə öz tətikləyicisi, yığılma mərhələsi və ölçülən göstəricisi olan fərqli siqnallaşma mexanizminə aiddir. Metilen mavisi bu mexanizmlərin hər birinə fərqli nöqtədə təsir edir. Bunlardan hər hansı birinin sağlamlıq nəticələrini yaxşılaşdırıb-yaxşılaşdırmadığı ayrıca sualdır və metilen mavisi və iltihab haqqında icmalımızda müzakirə olunur. Bu səhifə isə siqnal yollarına diqqət yetirir.

Siqnal yolu 1: inflammasomun yığılması və caspase-1

İnflammasom mieloid hüceyrənin daxilində ehtiyac yarandıqda qurulan zülal karkasıdır. Onun hissələri sensor, ASC adlanan adaptor və caspase-1 adlanan effektor fermentdir. Kompleks yığıldıqdan sonra caspase-1 pro-IL-1beta və pro-IL-18-i parçalayaraq onların ifraz olunan formalarını yaradır və hüceyrə ölümünün iltihabi forması olan piroptozu tətikləyə bilər. İnflammasomun tipini sensor müəyyən edir: NLRP3 kristallara və nigerisin kimi məsamə yaradan toksinlərə, həmçinin ATP-yə cavab verir, NLRC4 bakterial flagellinə, AIM2 sitozoldakı iki zəncirli DNA-ya, qeyri-kanonik yol isə hüceyrədaxili lipopolisaxaridə cavab verir.

Aktivləşmə üçün iki siqnal lazımdır. Birinci siqnal hazırlıqdır: Toll-bənzər reseptor liqandı NLRP3 və pro-IL-1beta-nın NF-kB-dən asılı transkripsiyasını işə salır ki, lazımi hissələr mövcud olsun. İkinci siqnal yığılmadır: ikinci tətikləyici ASC-nin oliqomerləşərək nöqtəvari yığıntılar əmələ gətirməsinə, caspase-1-in parçalanaraq p20 fraqmentinin yaranmasına və yetkin IL-1beta p17-nin ifrazına səbəb olur. Mitoxondrial reaktiv oksigen növlərinin və kristalların hüceyrəyə daxil olmasının NLRP3 üçün ikinci siqnala töhfə verdiyi məlumdur.

İnflammasomların geniş spektrli inhibisiyasına dair 2017-ci il makrofaq tədqiqatında metilen mavisi hər iki siqnal mərhələsində yoxlanılmışdı. Lipopolisaxaridlə hazırlıq mərhələsindən keçirilmiş siçan sümük iliyi makrofaqlarında nigerisin, ATP və mononatrium urat kristallarının hər biri IL-1beta və caspase-1 ifrazını, eləcə də ASC-nin nöqtəvari yığıntılarının yaranmasını induksiya etmişdi. 20 ilə 200 mikromolyar arasında konsentrasiyalarda metilen mavisi hüceyrələri öldürmədən bu üç göstəricinin hamısını dozadan asılı şəkildə azaltmışdı. NLRC4 üçün flagellin və Salmonella, AIM2 üçün iki zəncirli DNA və Listeria, qeyri-kanonik yol üçün isə transfeksiya ilə hüceyrəyə daxil edilmiş lipopolisaxarid və ya canlı E. coli eyni mənzərəni göstərmişdi. Birləşmə təkbaşına ifrazı tətikləməmiş, nəzarət lövhələrində isə antibakterial təsir müşahidə olunmamışdı. Buna görə nəticə sahib orqanizmin cavabı ilə əlaqələndirilir.

Siqnal yolunun daha əvvəlki mərhələlərində üç müdaxilə təsiri ölçülmüşdü. Metilen mavisi rotenonun induksiya etdiyi mitoxondrial superoksidi azaltmış, bununla yanaşı rotenonun yaratdığı IL-1beta ifrazı da azalmışdı. Flüoresan kürəciklərin hüceyrəyə daxil olması azalmışdı; bu, kristalların tanınmasından əvvəl faqositozun azalması ilə uyğun gəlirdi. İki NF-kB sahəsi olan NLRP3 promotorunun idarə etdiyi reporter metilen mavisinin təsiri altında daha aşağı aktivlik göstərmiş, həmin sahələri olmayan qısaldılmış promotor isə cavab verməmişdi. Hüceyrəsiz sınaq borusunda metilen mavisi rekombinant insan caspase-1-inin aktivliyini də birbaşa azaltmışdı. Birləşmənin yalnız hazırlıq və ya yalnız aktivləşmə mərhələsində əlavə edilməsi də IL-1beta, IL-18 və caspase-1 ifrazını azaltmışdı; deməli, hər iki mərhələ bu təsirdə iştirak edir.

Siçan sınaqları bu seçiciliklə uyğun gəlirdi. Lipopolisaxaridin ölümcül dozası nəzarət qrupundakı siçanları bir neçə saat ərzində öldürmüş, metilen mavisi isə sağqalmanı yaxşılaşdırmışdı; peritoneal mayedə IL-1beta azalmış, lakin eyni mayedə IL-6 azalmamışdı. Listeria ilə yaradılmış peritonit modelində peritoneal IL-1beta azalmış, ümumi hüceyrə sayı isə dəyişməmişdi. İnsan THP-1 monositləri inflammasomun dörd tipinin hamısında siçan makrofaqları kimi davranmışdı. İnflammasoma aid nəticə bütün sitokinləri deyil, IL-1beta və IL-18-in yetişməsini izah edir. Buna görə də mikroqliya və astrosit təcrübələrində beynin immun hüceyrələrinin forması karkasın yığılmasından fərqli suala cavab verir.

Siqnal yolu 2: NF-kB və STAT1-in bağlanması vasitəsilə iNOS transkripsiyası

İnduksiya olunan azot monoksid sintazası, yəni iNOS, sakit vəziyyətdə demək olar ki, mövcud olmur və ehtiyac yarandıqda transkripsiya olunur. Lipopolisaxarid bunu əsasən IkB-alpha-nın parçalanması və ardınca NF-kB-nin fosforlaşaraq nüvəyə daxil olması vasitəsilə işə salır. İnterferon-qamma isə bunu əsasən Janus kinazanın STAT1-i fosforlaşdırması və ardınca STAT1-in nüvəyə daxil olması vasitəsilə işə salır. Daha sonra hər faktor iNOS promotorundakı öz sahəsinə bağlanır. Ferment aktivliyi və genin induksiyası ayrı nəzarət nöqtələridir; dərman bunlardan birinə və ya hər ikisinə təsir edə bilər.

Makrofaqlarda və endotoksemiyalı siçanlarda iNOS induksiyasına dair 2015-ci il tədqiqatı təsirin xəbərçi RNA səviyyəsində olduğunu göstərmişdi. RAW 264.7 hüceyrələrində və ilkin siçan makrofaqlarında lipopolisaxariddən, interferon-qammadan və ya hər ikisindən 30 dəqiqə əvvəl verilən 1 mikromolyar metilen mavisi 8 ilə 24 saat arasında iNOS zülalını və mRNA-sını azaltmışdı. Mühitdə nitrit miqdarı daha aşağı olmuş, hüceyrələrin həyat qabiliyyəti isə azalmamışdı. Hər kg üçün 25 mg lipopolisaxarid verilmiş siçanlarda bir saat əvvəl verilən, hər kg üçün 5 mg olan birdəfəlik doza ağciyər, qaraciyər və ürəkdə iNOS zülalını və mRNA-sını azaltmışdı.

Burada fərqləndirici məqam nələrin dəyişməməsidir. IkB-alpha-nın parçalanması, NF-kB-nin fosforlaşması, STAT1-in fosforlaşması və hər iki faktorun nüvədə toplanması dəyişməz qalmışdı. Pozulma bir mərhələ sonra baş vermişdi: nüvə ekstraktlarında lipopolisaxariddən sonra NF-kB-nin öz DNA elementinə bağlanmasının, interferon-qammadan sonra isə STAT1-in bağlanmasının azaldığı göstərilmişdi. Xromatin immunopresipitasiyası da hüceyrələrin daxilində iNOS promotoruna hər iki faktorun daha az bağlandığını təsdiqləmişdi. Promotoru həmçinin NF-kB-dən istifadə edən şiş nekrozu faktoru alfa da azalmışdı. Faktorlar aktivləşmiş və nüvəyə çatmışdı, lakin hədəf DNA ilə zəif qarşılıqlı əlaqəyə girmişdi.

Siqnal yolu 1 ilə fərqə diqqət yetirin. Bu mexanizm faktorun DNA ilə qarşılıqlı əlaqəsinə aiddir, STAT3 deyil, STAT1-dən istifadə edir və ASC-nin nöqtəvari yığıntıları ilə caspase-1 fraqmentləri əvəzinə mRNA, zülal və nitrit göstəricilərinə əsaslanır. Hüceyrə modellərində metilen mavisinin hədəfləri xəritəmiz bu transkripsiya səviyyəsini birbaşa ferment və mitoxondri ölçmələrindən ayrı saxlayır.

Siqnal yolu 3: serum IL-6 və toxumalarda STAT3 aktivləşməsi

IL-6 gp130 reseptor ailəsi vasitəsilə Janus kinazadan STAT3-ə uzanan kaskada siqnal ötürür. Fosforlaşmış STAT3 dimerləşir, nüvəyə daxil olur və iltihabi proqramları işə salır. IL-6 özü isə NF-kB-nin hədəfidir; beləliklə, onlar çox vaxt IL-6–STAT3 oxu adlandırılan əks-əlaqə dövrəsi yaradır. Standart ölçülən göstəricilər siqnal yolunun əvvəlində serum IL-6, fosforlaşmış STAT3-ün ümumi STAT3-ə nisbəti və sonrakı mərhələlərdə iNOS və COX2 kimi effektor fermentlərdir.

Lipopolisaxariddən sonra IL-6 və STAT3-ə dair 2023-cü il siçan tədqiqatında bu ox müxtəlif bölmələrdə ölçülmüşdü. Erkək C57BL/6 siçanlarına üç gün ərzində hər gün hər kg üçün 1 mg lipopolisaxarid, hər dozadan 30 dəqiqə sonra isə hər kg üçün 5 və ya 10 mg metilen mavisi verilmişdi. Üçüncü gün metilen mavisi verilən hər iki qrupda serum IL-6 səviyyəsi yalnız lipopolisaxarid verilən qrupla müqayisədə daha aşağı idi, paneldəki digər sitokinlərin əksəriyyəti isə müdaxilə ilə dəyişməmişdi. Beyin qabığında, hipokampda və qulaq dərisində fosforlaşmış STAT3-ün ümumi STAT3-ə nisbəti daha aşağı olmuşdu. Bununla yanaşı mikroqliyanın Iba-1 boyanması, iNOS və COX2 səviyyələri azalmış, çəki itkisi isə qismən zəifləmişdi.

Burada iki ehtiyat məqamı var. Serum IL-6 səviyyəsinin və toxumalarda STAT3 fosforlaşmasının azalması oxun modulyasiyasına uyğun gəlir, lakin əsas təsir nöqtəsini təcrid etmir. Çünki siqnal yolunun əvvəlində sitokinin azalması, reseptor siqnallaşmasının zəifləməsi və ya fosfataza aktivliyinin dəyişməsi eyni nisbəti yarada bilər. Həmçinin kəskin təsirin üç günü ərzində çəki bütöv heyvan səviyyəsində ölçülən göstəricidir, simptom və ya remissiya balı deyil. Bu, siqnallaşma nəticəsini müalicə iddiasına çevirmədən blot nəticəsindən əlavə kontekst verir. Mitoxondrial redoks proseslərinin ayrıca kimyası bu sitokin izahına paralel gedir və onunla birləşdirilməməlidir.

Siqnal yollarının müqayisəsi: müdaxilə nöqtələri və ölçülən göstəricilər

Cədvəl nəticələrin üç əsassız köçürülməsinin qarşısını alır. ASC-nin nöqtəvari yığıntılarına aid nəticə STAT3-ə aid nəticəni sübut etmir. Hər iki zülal STAT ailəsinin üzvü olsa da, STAT1-in iNOS promotoruna bağlanmasına aid nəticə STAT3-ə aid nəticəni sübut etmir. Serum IL-6 ilə bağlı nəticə inflammasom yığılmasının azaldığını sübut etmir: peritoneal təcrübədə IL-1beta azalmış, IL-6 isə azalmamışdı. Hər sətir üçün öz tətikləyicisi və ölçülən göstəricisi lazımdır. Buna görə metilen mavisinə dair hüceyrə, heyvan və klinik tədqiqatları oxuyarkən hər iddianı onun ölçüldüyü səviyyə ilə uyğunlaşdırmaq vacibdir.

Bunların heç biri insanlarda dozanı, təhlükəsizliyi və ya faydanı müəyyən etmir. Lipopolisaxarid modelləri xroniki xəstəliyin surətləri deyil, mexanizmi yoxlamaq üçün nəzarət olunan tətikləyicilərdir. Tətikləyici ilə yanaşı maddənin verilməsi artıq formalaşmış xəstəliyin geri çevrilməsini deyil, induksiya edilmiş dəyişikliyin qarşısının alınmasını yoxlayır. Mexanizmlərə dair bu izahı pasiyent nəticələrindən ayrı saxlayın və sağlamlıqla bağlı hər iddianı onun əsaslandığı pasiyent tədqiqatına görə qiymətləndirin.