G6PD laboratoriya testlərində metilen mavisi: boya əslində nə edir

Bir tələbə inkubasiyadan sonra iki sınaq şüşəsini müşahidə edir. Birində gözlənilən rəng yaranıb. Digərində isə yaranmayıb. Tələbə ikinci pasiyentdə qlükoza-6-fosfat dehidrogenaza çatışmazlığı olduğu qənaətinə gəlir. Bu nəticə doğru ola bilər, lakin belə mühakimə testin işləməsini təmin edən əsas anlayışı nəzərdən qaçırır. Sınaq şüşəsində heç nə fermenti birbaşa ölçmür. Sınaq şüşəsi metilen mavisindən vasitəçi kimi istifadə edərək fermentin hasil etdiyi maddəni ölçür.

Bu dolayı mexanizm aydın olduqda prosedur, nəzarət nümunələri və yanlış nəticələrin uzun siyahısı artıq ixtiyari görünmür.

Qısa cavab

G6PD testində metilen mavisi redoks indikatorudur. G6PD fermenti NADPH əmələ gətirir, NADPH-dən asılı sistemlər isə mavi metilen mavisini onun rəngsiz leyko formasına qədər reduksiya edir (və ya ondan elektronları daşımaq üçün istifadə edir). Normal ferment aktivliyi səmərəli reduksiyaya səbəb olur. Çatışmazlıq zamanı reduksiya yavaş və ya natamam olur. Siqnalın bütün mahiyyəti budur.

İki tarixi metod eyni boyadan istifadə edir, lakin son göstəriciləri fərqlidir. Onları bir-birindən ayırdıqda qarışıqlığın böyük hissəsi aradan qalxır.

İki test, bir boya, fərqli son göstəricilər

Birincisi Sass və həmkarlarının təsvir etdiyi, sonradan Gibbs tərəfindən qiymətləndirilmiş birbaşa metilen mavisi reduksiya testidir. Burada son göstərici boyanın özüdür: oksidləşmiş mavi metilen mavisi rəngsiz leykometilen mavisinə qədər reduksiya olunur və bu dəyişmənin sürəti NADPH əmələ gətirmə qabiliyyətini əks etdirir. Skrininqə dair ilkin məqalə PubMed-də Sass və həmmüəlliflər (1966) adı ilə indeksləşdirilib.

İkincisi Brewer methemoqlobin reduksiya testidir. Əvvəlcə natrium nitrit hemoqlobini qəhvəyi methemoqlobinə qədər oksidləşdirir. Sonra metilen mavisi elektron ötürülməsində vasitəçi rolunu oynayır: reduksiya olunmuş metilen mavisi reduksiyaedici ekvivalentləri methemoqlobinə ötürərək onu yenidən qırmızı hemoqlobinə çevirir. Buna görə görünən son göstərici mavi və rəngsiz deyil, qəhvəyi və qırmızı rənglərdir. İlkin metod Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatının Bülletenində (Brewer və həmmüəlliflər, 1960) dərc olunub.

Brewer analizini boyanın rəngsizləşməsi testi adlandırmaq kimyəvi baxımdan dəqiq deyil. Boya dövr edir; rəngini dəyişən hemoqlobindir. Aşağıdakı sxem hər iki yolu göstərir.

Əsas reaksiya

G6PD pentozafosfat yolunun ilk oksidləşmə mərhələsini kataliz edir:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Luzzatto və həmkarlarının Blood jurnalındakı icmalında (2020) göstərildiyi kimi, yetkin eritrositlər NADPH əldə etmək üçün böyük ölçüdə bu yoldan asılıdır. NADPH qlutationu reduksiya olunmuş vəziyyətdə saxlayır və hüceyrəni oksidləşdirici zədələnmədən qoruyur. Metilen mavisi bu sistemə elektron qəbuledicisi kimi qoşulur. Kifayət qədər G6PD kifayət qədər NADPH təmin edir, bu da səmərəli reduksiyaya imkan verir. G6PD səviyyəsinin aşağı olması zənciri elə ilk halqada qırır.

Boyanı mühərrik deyil, yanacaq göstəricisi kimi düşünün. O, NADPH təminatı barədə məlumat verir. Bu təminatı və ya nəticənin oxunmasını dəyişən hər hansı başqa amil gendə heç bir dəyişiklik olmadan göstəricini dəyişə bilər.

Brewer tipli prosedur necə aparılır

Reagentlərin tərkibi onilliklər ərzində dəyişib, buna görə tədris məqsədli təsviri klinik protokol kimi qəbul etmək olmaz. Hər laboratoriya öz validasiya olunmuş standart əməliyyat proseduruna əməl edir. Bu xəbərdarlığı nəzərə alaraq, klassik sınaq şüşəsi üsulu bu dərc olunmuş tətbiq nümunəsində üç sınaq şüşəsi və 3 saatlıq inkubasiya ilə sənədləşdirilmiş formada belə aparılır:

1. Pasiyent nümunəsi olan sınaq şüşəsi: tam qan, qlükoza, natrium nitrit və metilen mavisi. Nitrit methemoqlobin əmələ gətirir, qlükoza eritrositlərin metabolizmini qidalandırır, boya isə NADPH-dən asılı elektron daşınmasını təmin edir.
2. Oksidləşmiş nəzarət nümunəsi: qan, nitrit və qlükoza, lakin metilen mavisi olmadan. Bu nümunə çatışmazlığa uyğun olan qəhvəyi methemoqlobin son göstəricisini göstərir.
3. Hemoqlobin nəzarət nümunəsi: qan və su. Bu nümunə normal vəziyyətə uyğun olan qırmızı hemoqlobin son göstəricisini göstərir.
4. Bütün sınaq şüşələrini yüngülcə qarışdıraraq təxminən 37 C temperaturda, adətən 3 saat inkubasiya edin.
5. Hüceyrələri lizisə uğratmaq və rəng müqayisəsini aydın etmək üçün hər sınaq şüşəsindən kiçik bir alikvotu distillə edilmiş suda durulaşdırın.
6. Pasiyent nümunəsi olan sınaq şüşəsini iki nəzarət nümunəsi ilə müqayisə edin. Rəngin yenidən qırmızıya yaxınlaşması əhəmiyyətli reduksiya qabiliyyətini göstərir. Qəhvəyi rəngin qalması nəzərəçarpan çatışmazlığa işarə edir.

Tarixi tərkib variantlarından birində təxminən 1 mL qanla birlikdə təxminən 180 mM natrium nitrit, 280 mM dekstroza və 0.4 mM metilen mavisi istifadə olunub. Bu rəqəmləri universal spesifikasiya deyil, ədəbiyyatdan bir nümunə kimi qəbul edin.

Nəticənin oxunması

G6PD aşkarlanmasındakı boşluqlar haqqında Malaria Journal icmalında müzakirə edildiyi kimi, keyfiyyət skrininqi normal aktivliyin təxminən 30–40 faizi səviyyəsində ən yaxşı ayırdetmə qabiliyyətinə malikdir. Buna görə normal skrininq nəticəsi analizin ağır çatışmazlıq aşkar etmədiyini bildirir. Bu, aktivliyin tam normal olduğunu təsdiqləmir.

Skrininq niyə yanıltıcı olur

Hemolizdən sonra retikulositoz yanlış normal nəticənin klassik səbəbidir. Gənc eritrositlər və retikulositlər köhnə hüceyrələrə nisbətən daha çox G6PD daşıyır. Kəskin hemolitik epizod zamanı ən köhnə və ən çox çatışmazlığı olan hüceyrələr artıq məhv olmuş ola bilər; geridə aktivliyi testdə normal görünən gənc hüceyrə populyasiyası qalır. Eyni bioloji proses yalnız boya ilə aparılan skrininqləri deyil, kəmiyyət analizlərini də yanıldır.

Yaxın zamanda qan köçürülməsi çatışmazlığı gizlədir, çünki donor eritrositləri nümunəyə öz fermentlərini əlavə edir. Mayo Clinic Laboratories qan köçürülməsini retikulositoz və leykositlərin müdaxiləsi ilə yanaşı, ferment nəticələrinin etibarsız olmasının səbəbləri arasında göstərir.

Heteroziqot qadınlar ən çətin haldır. X xromosomunun təsadüfi inaktivləşməsi normal və çatışmazlığı olan eritrositlərin qarışığını yaradır; ümumi aktivlik isə ağır çatışmazlıqdan zahirən normal səviyyəyə qədər istənilən nöqtədə ola bilər. Keyfiyyət skrininqləri aralıq fenotipləri çox vaxt aşkar etmir. ÜST-nin G6PD testlərinə dair sənədi bu məhdudiyyəti ətraflı müzakirə edir.

Nümunənin götürülməsindən keçən vaxt, saxlanma temperaturu, son göstəricinin vizual qiymətləndirilməsində subyektivlik, hematokrit və reagentlərin keyfiyyəti bu bioloji təsirlərə əlavə analitik dəyişkənlik gətirir.

Skrininq diaqnoz deyil

Çatışmazlıq göstərən, aralıq və ya klinik mənzərə ilə uyğun gəlməyən skrininq nəticəsi G6PD fermentinin kəmiyyət analizini tələb edir. ÜST temperatur nəzarəti altında aparılan kəmiyyət spektrofotometriyasını istinad üsulu hesab edir. Bu analizdə eritrosit hemolizatına qlükoza-6-fosfat və NADP+ əlavə edilir, əmələ gələn NADPH isə 340 nm-də absorbansın artması ilə izlənir. Dəyişmə sürəti ferment aktivliyi ilə mütənasibdir və adətən hemoqlobinə görə normallaşdırılaraq qram başına vahidlərlə ifadə olunur. Müasir klinik laboratoriya təcrübəsi Mayo test kataloqunun G6PD aktivliyinə dair bölməsində ümumiləşdirilib.

Nəticələrin şərhi laboratoriyanın validasiya olunmuş istinad intervalına əsaslanır; bu interval çox vaxt populyasiyanın normal aktivliyinə nisbətən müəyyənləşdirilir. Çatışmazlıq adətən 30 faiz həddi ətrafında, aralıq aktivlik isə bu həddən yuxarı səviyyələrdə müzakirə olunur. ÜST-nin G6PD testləri üçün hədəf məhsul profilləri (2022) bu diaqnostik çərçivəni təqdim edir. Yaxın zamanda baş vermiş hemoliz və ya qan köçürülməsi fenotipləşdirməni etibarsız edirsə, eritrosit populyasiyası yenidən tarazlaşdıqdan sonra testi təkrarlayın; molekulyar testlər isə ferment ölçməsini əvəz etmədən əlavə məlumat verə bilər.

Qorunmalı bir sərhəd

Bu analizlərdə metilen mavisi ex vivo laboratoriya reagentidir. Bu fakt pasiyentə metilen mavisi verilməsinin təhlükəsizliyindən ayrı bir mövzudur; həmin məsələ metilen mavisinin əks-göstərişlərinə dair təlimatda izah olunur. Biokimya bu iki mövzunu əlaqələndirir, çünki dərman da NADPH-dən asılı reduksiyaya əsaslanır. Lakin sınaq şüşəsindəki boya qan dövranındakı doza deyil. Boyanın başqa şəraitdə boyayıcı kimi necə davrandığını anlamaq üçün metilen mavisi ilə boyamanın prinsiplərinə baxın; onun aid olduğu kimyəvi ailə barədə isə laboratoriyada redoks boyaları mövzusuna baxın.

Skrininq reduksiya qabiliyyətinin qorunmuş görünüb-görünmədiyini soruşur. Təsdiqləyici test isə əslində nə qədər ferment olduğunu soruşur. Heç kim boyadan ikinci suala cavab verməsini gözləmədiyi müddətdə o, birinci suala yaxşı cavab verir.