DNA və RNA-nın metilen mavisi ilə boyanması: gel və membran tətbiqləri

Bir tələbə agaroza gelində elektroforez aparır, onu metilen mavisi ilə boyayır və aydın zolaq gözlədiyi yerdə heç nə görmür. Qonşu iş sahəsində bir postdoktorant eyni mavi məhlulla Northern membranını boyayır və üç dəqiqə ərzində aydın ribosomal zolaqlar əldə edir. Tələbə gel təcrübəsinin uğursuz olduğu qənaətinə gəlir. Gel təcrübəsi uğursuz olmayıb. Bu iki işin məqsədi fərqli idi və eyni boya onlara fərqli həssaslıq, fərqli fon və sonrakı addımlar üçün fərqli qaydalarla cavab verir.

DNA və RNA-nın metilen mavisi ilə boyanması eyni kimyaya əsaslanır, lakin məqsədləri fərqlidir. Geldə boya məsaməli matrisin daxilində nə qədər nuklein turşusu olduğunu göstərir. Membranda isə köçürmənin uğurlu olub-olmadığını və zolaq yollarına bərabər miqdarda nümunə yüklənib-yüklənmədiyini göstərir. Bu fərq aydın olduqda protokollar, aşkarlama hədləri və uyğunluq məhdudiyyətləri də aydınlaşır.

Qısa cavab

Metilen mavisi nuklein turşularına qeyri-kovalent və geri dönən şəkildə bağlanan planar kationik boyadır. Bu bağlanma fosfata elektrostatik cəlbolunma, əsas cütləri arasına interkalasiya və kiçik şırımla qarşılıqlı təsirin birləşməsi ilə baş verir. Əsas xüsusiyyət bu geri dönənlikdir. Zolaqları boyayıb görünən işıqda müşahidə etmək, sənədləşdirmək, sonra isə klonlama, hibridləşdirmə və ya yenidən zondlama üçün boyanı yumaqla çıxarmaq və ya nümunəni təmizləmək olar.

İkizəncirli DNA-nın agaroza gelində metilen mavisi ilə boyanması üçün standart sürətli resept suda 0.02 faiz w/v (hər mL üçün 200 mikroqram) məhluldan, təxminən 15 dəqiqə boyamadan və ardından təxminən 15 dəqiqə su ilə boyasızlaşdırmadan ibarətdir; müşahidə ağ işıq qutusunda aparılır. Membranlar üçün klassik Northern blot resepti pH 5.2-yə yaxın natrium asetat məhlulunda 0.02–0.04 faiz boyadan istifadə edir: köçürmə və immobilizasiyadan sonra bir neçə dəqiqə boyama, ardından su ilə yaxalama və hibridləşdirmədən əvvəl tam boyasızlaşdırma aparılır. Həssaslıq yüksək deyil: yaxşı şəraitdə hər gel zolağı üçün onlarla və ya yüzlərlə nanoqram, ehtiyatlı qiymətləndirmə verən təlimatlarda isə 0.5–1 mikroqram göstərilir. Bu, etidium bromid və SYBR boyalarının aşkarlama hədlərindən bir neçə böyüklük tərtibi yüksəkdir. Membranlarda ayrı-ayrı transkriptlər üçün vahid praktik aşkarlama həddi yoxdur, çünki boya əsasən bol miqdarda olan ribosomal RNA-nı və yüklənmiş ümumi materialı göstərir. Bu reseptlərin heç birində pərakəndə satılan qida əlavəsi məhlulundan əvəzləyici kimi istifadə etməyin. Təsdiqlənmiş üsullar analitik dərəcəli boya, tərkibi dəqiq müəyyən edilmiş buferlər və RNA ilə işləyərkən RNase-siz işləmə şəraiti nəzərdə tutur.

Bağlanma necə işləyir və harada yanıldır

Faydalı model üç hissədən ibarətdir. Birincisi, müsbət yüklü halqa sistemi mənfi yüklü fosfat skeletinə cəzb olunur. Spektroskopik tədqiqatlar aşağı duz qatılığında bu elektrostatik komponentin üstünlük təşkil etdiyini göstərir; modelləşdirmə və molekulyar dinamika isə ikizəncirli DNA üçün interkalasiyanı və kiçik şırıma bağlanmanı sabit bağlanma formaları kimi saxlayır. Bu nəticələr metilen mavisinin DNA-ya bağlanmasına dair spektroskopik tədqiqatda ümumiləşdirilib. İkincisi, GC-yə müəyyən üstünlük mövcuddur: modelləşdirmə CpG və GpC addımlarını daha əlverişli göstərir, təcrübələr isə metilen mavisinin interkalasiya üstünlüklərinə dair işdə GC ilə zəngin duplekslərə üstünlüklü bağlanma bildirir. Bununla belə, AT dupleksləri də bağlanır. Adi boyama ardıcıllığa spesifik deyil. Üçüncüsü, təkzəncirli DNA və RNA əsasən elektrostatik qarşılıqlı təsirlər, əlçatan əsaslar və dupleks bölgələrlə stekinq vasitəsilə bağlanır. Buna görə boyanmanın intensivliyi uzunluğa, ardıcıllığa və ikincili quruluşa görə dəyişir.

Bundan iki nəticə çıxır. Bağlanma qeyri-kovalent olduğundan boya yuyulub çıxır. Xüsusi olaraq fiksasiya edilmədikdə poliakrilamid zolaqları sürətlə solur. Adi boyama müvəqqəti olduğu üçün ayrıca daimi fiksasiya variantı mövcuddur; bu, Soto və Draperin PAGE gelləri üçün təsvir etdiyi üsulda izah olunur. Boya fotosensibilizator olduğundan oksigenin mövcudluğunda boyanmış DNA-nın uzun müddət güclü işıqlandırılması quanini oksidləşdirə və nəticədə zəncirlərdə kəsiklər yarada bilər. Bu mexanizm metilen mavisinin sensibilizasiya etdiyi quanin oksidləşməsinə dair işdə ətraflı izah olunur. Ağ işıqda qısa müşahidə klassik etidium bromid iş proseslərinin məlum UV zədələnməsindən yayınmağa imkan verir və preparativ ayırmadan sonra DNA-nın əldə edilməsi üçün bu, real üstünlükdür. Görünən işıq daha yumşaqdır, lakin zərərsiz deyil. DNA klonlanacaqsa, işıqlandırma müddətini qısa saxlayın. Bu ehtiyat tədbirinin arxasındakı daha geniş fotokimya üçün metilen mavisinin fotokimyasında iki yol məqaləsinə baxın. Oksidləşmiş formanın niyə bağlandığını, reduksiya olunmuş formanın isə niyə bağlanmadığını izah edən redoks cütü və yük vəziyyətləri üçün metilen mavisinin quruluş və xassələrinin kimyası məqaləsinə baxın.

Birinci tapşırıq: gellərin daxilində boyama

Gel boyaması bir suala cavab verir: bu zolaqda gözlə görünəcək qədər nuklein turşusu varmı? Agaroza daxilində ikizəncirli DNA ən yaxşı öyrənilmiş haldır. Flores və həmkarlarının ilkin metilen mavisi ilə gel boyama üsulu 1 faiz agarozada 0.02 faizlik sürətli protokolu təsdiqləmiş və sonradan DNA-nın uğurla əldə edilib klonlandığını göstərmişdir. Eyni təchizatçı protokolu IBI Scientific-in metilen mavisi məhsul səhifəsində də verilir; burada 0.04 faizlik membran resepti və sürətli gel variantı yanaşı göstərilir.

Praktik iş prosesi:

1. Geldə elektroforezi adi qaydada aparın. Dəyişdirilmiş üsul üçün köçürmə və ya ayırdetmə qabiliyyəti təsdiqlənməyibsə, boyamanı elektroforez zamanı deyil, ondan sonra aparın.
2. Geli distillə edilmiş suda 0.02 faiz w/v metilen mavisi məhluluna salın və yüngülcə çalxalayaraq təxminən 15 dəqiqə saxlayın.
3. Suyu bir neçə dəfə dəyişərək, matrisin fonu zəifləyib zolaqlar seçilənə qədər, ümumilikdə təxminən 15 dəqiqə boyasızlaşdırın.
4. Ağ işıq işıqlandırıcısında dərhal fotoşəkil çəkin.

Agaroza və poliakrilamid fərqli davranır. Agaroza boyanı matrisdə saxladığından boyasızlaşdırma yavaş mərhələdir. Nazik poliakrilamid gelləri sürətlə boyanır, lakin boyanı da sürətlə itirir; bu, preparativ kəsib çıxarma üçün faydalıdır, arxiv sənədləşdirməsi üçün isə əlverişsizdir. Təsdiqlənmiş Current Protocols tipli PAGE üsullarına uyğun olaraq poliakrilamiddə sintetik oliqonukleotidlərin yerini eyni 0.02 faizlik reseptlə, təkrar su yumaları apararaq 20–30 dəqiqəyə müəyyən etmək olar. Preparativ oliqonukleotidlər üçün durulaşdırılmış TBE-də təxminən 0.0002 faizlik çox duru variantların bir neçə saat ərzində tətbiqi barədə məlumatlar var, lakin sübut bazası daha zəifdir.

DNA ilə RNA arasındakı fərq əhəmiyyətlidir. İkizəncirli DNA ən güclü strukturlaşmış bağlanmanı verir. RNA və təkzəncirli DNA boyanır, lakin daha zəif və nəticəsi daha az proqnozlaşdırılan şəkildə. Formaldehidli agaroza RNA gellərində əksər laboratoriyalar gel daxilində mavi boyamadan imtina edir, əvvəlcə RNA-nı membrana köçürür, sonra orada boyayır. Bu yanaşma zəif gel siqnalını daha aydın membran siqnalı və yükləmənin qeydi ilə əvəz edir.

İkinci tapşırıq: membranlarda boyama

Membran boyaması başqa suala cavab verir: köçürmə uğurlu olubmu və zolaq yollarını müqayisə etmək olarmı? Klassik tətbiq Herrin və Schmidtin geri dönən Northern blot boyamasıdır. İlkin üsulda pH 5.0-da 50 mM natrium asetatda 0.04 faiz boya ilə 2–3 dəqiqə boyama və su ilə yaxalama aparılırdı; boya hibridləşdirmədən əvvəl SSPE-də durulaşdırılmış SDS ilə çıxarıla bilirdi.

Geniş istifadə olunan müasir variant belə aparılır:

1. RNA-nı və ya denaturasiya olunmuş DNA-nı neylon və ya nitrosellülozaya köçürün, sonra boyama zamanı nümunənin itirilməməsi üçün UV ilə çarpaz bağlama və ya qızdırma vasitəsilə immobilizasiya edin.
2. İxtiyari, lakin geniş istifadə olunan addım: membranı təxminən 15 dəqiqə 5 faizlik sirkə turşusunda isladın.
3. pH 5.2-yə yaxın 0.3–0.5 M natrium asetatda 0.02–0.04 faiz metilen mavisi ilə 5–10 dəqiqə boyayın.
4. Suda 5–15 dəqiqə yaxalayın və boyasızlaşdırın, sənədləşdirin, sonra hibridləşdirmədən əvvəl qalıq boyanı çıxarın.

Northern işlərində müsbət yüklü neylon üstünlük təşkil edir. Nitrosellüloza da eyni sirkə turşusu və asetat iş prosesi ilə işləyir. Görüntüdən köçürməni təsdiqləmək, 28S və 18S zolaqlarını (bakterial RNA üçün 23S və 16S) müqayisə etmək, pilləli markerləri və standartları işarələmək, eləcə də ümumi RNA üzrə təxmini normallaşdırma qeydi saxlamaq üçün istifadə olunur. Dərc edilmiş Northern üsullarında yükləməni yoxlamaq üçün boyanmış ribosomal zolaqlar kəmiyyətcə qiymətləndirilir. Buna normallaşdırma üçün metilen mavisi ilə boyanmış ribosomal zolaqlardan istifadə edən süd elmi sahəsindəki iş də daxildir. Southern membranlarını da eyni qaydada vizuallaşdırmaq olar, lakin boya Northern-də yükləmə və köçürmənin yoxlanılması üçün daha geniş qəbul edilib. Southern DNA-sı isə köçürmədən əvvəl denaturasiya olunur, buna görə gel üçün həssaslıq göstəriciləri bu vəziyyətə birbaşa tətbiq edilmir.

Aşkarlama hədləri və fon: mavi boyanın geri qaldığı məqamlar

Aşağıdakı müqayisə məqsədli şəkildə təxminidir. Boyanın performansı gelin faizindən, zolağın enindən, optikadan və boyasızlaşdırmanın nə dərəcədə düzgün aparılmasından asılıdır. Hər rəqəmi dəqiq spesifikasiya kimi deyil, böyüklük tərtibi kimi qəbul edin.

Zəif siqnalın istifadəyə yararlı olub-olmamasını fonun idarə edilməsi müəyyənləşdirir. Sərbəst boya intensiv rəngə malikdir, buna görə kontrast bağlı boyanı çıxarmadan bağlanmamış boyanın təmizlənməsi ilə əldə olunur. Daha yüksək qatılıqlı boya nadir hallarda həssaslığı artırır. Əsasən boyasızlaşdırma müddətini uzadır. İstifadə etdiyiniz konkret gel, membran və kamera ilə durulaşdırma sırası sınağı aparın və yalnız inteqral sıxlığın daxil edilən miqdara mütənasib qaldığı diapazondan istifadə edin. Metilen mavisi yükləmənin yarımkəmiyyət normallaşdırılmasına imkan verir. Bu, yüksək dinamik diapazonlu kəmiyyət analizi deyil, çünki membran tutumu, köçürmə səmərəliliyi, doyma və boyasızlaşdırma bir zolaq yolundan digərinə dəyişir.

Uyğunluq məhdudiyyətləri: boyamadan sonra nə yararlı qalır

Mavi boyamadan sonra klonlama nümayiş etdirilib. Flores və həmkarları boyanmış agaroza zolaqlarını kəsib çıxarmış, DNA-nı əldə etmiş, liqasiya və transformasiya aparmış və UV ilə etidium bromid boyamasından sonrakı klonlamaya nisbətən daha yaxşı nəticə bildirmişlər. Ehtimal olunan səbəb boyanın özünün faydası deyil, daha az fot zədələnmədir. Ağ işığa məruz qalmanı qısa saxlayın və əldə edilmiş DNA-nı adi geldən ekstraksiya təmizləməsindən keçirin.

PCR və sekvensləmə üçün sübutlar daha məhduddur. Qalıq boya nuklein turşularına bağlanır, buna görə fermentativ mərhələlərdən əvvəl boyasızlaşdırma və təmizləmə aparın. Mavi boyanmış geldən düzgün təmizlənmiş DNA-nın işləməsi gözlənilir, lakin müxtəlif polimerazaların və sekvensləmə kimyalarının birbaşa daşınan qalıq boyaya dözümlülüyü yaxşı kəmiyyətləşdirilməyib. Bunu fərz etməyin.

Blot hibridləşdirməsi addımların ardıcıllığına ciddi əməl olunduqda uyğundur: köçürmə, immobilizasiya, boyama, sənədləşdirmə, boyasızlaşdırma, hibridləşdirmə. Bu ardıcıllıq Herrin və Schmidtin yanaşmasıdır. Köçürmədən əvvəl boyama və ya boyasızlaşdırmanın buraxılması fərqli üsuldur və ayrıca təsdiqlənməlidir. Boya çıxarıldıqdan sonra standart zondun çıxarılması və yenidən zondlama adi qaydada davam edir. Eyni boya ailəsi ilə hüceyrə səviyyəsində boyama və fiksasiya edilmiş yaxma yanaşmasının niyə canlı hüceyrə üsullarına tətbiq olunmadığı barədə mikroskopik boyama atlasına baxın.

Daimi fiksasiya variantından istifadə edilmədikdə, zolağın kəsib çıxarılması preparativ agaroza və mavi boya ilə yeri müəyyən edilmiş PAGE oliqonukleotidləri üçün yararlıdır. Boyasızlaşdırmadan sonra elektroelyusiya geri dönən bağlayıcı üçün kimyəvi baxımdan mümkündür, lakin metilen mavisinə xas, nəzarətli çıxım məlumatları azdır. Elyusiyadan sonra duzları çıxarın və ya çökdürmə aparın.

Təkrarlanan uğursuzluqlar

Solğun gel zolaqları adətən kolorimetrik boya üçün kütlənin çox az olduğunu göstərir, xüsusən də qısa təkzəncirli və ya RNA hədəflərində. Daha çox nümunə yükləyin, təzə boya istifadə edin, qatılığı artırmazdan əvvəl boyama müddətini uzadın və boyasızlaşdırmanı daha erkən dayandırın. Kontrastsız, tam mavi gel adətən həddindən artıq boyama və ya suyun kifayət qədər dəyişdirilməməsi deməkdir. PAGE zolaqlarının solması uğursuz boyama deyil, gözlənilən kimyəvi davranışdır. Tez fotoşəkil çəkin. Membran fonunun qeyri-bərabərliyi qatlanmalara, qabarcıqlara, barmaq izlərinə, qeyri-bərabər çalxalamaya və ya ləkəvari köçürməyə işarə edir. Hibridləşdirmə nəzarəti olmadan bunu qeyri-bərabər yükləmə kimi şərh etməyin. Yayılmış, zəif ribosomal zolaq görünüşü parçalanma demək ola bilər, lakin natamam köçürmə, çox az ümumi RNA (tipik zolaq yollarına bir neçə mikroqramdan onlarla mikroqrama qədər yüklənir) və ya həddindən artıq boyasızlaşdırma da səbəb ola bilər. Boya bol miqdarda olan ribosomal RNA-nı göstərir. Konkret transkripti göstərmir. Bu işi zond yerinə yetirir.

Şişirdilmiş iddialar olmadan təhlükəsizlik və işləmə qaydaları

Metilen mavisi ilə işləmək etidium bromidlə işləməkdən daha sadədir, lakin o, zərərsiz deyil. MilliporeSigma-nın aktual təhlükəsizlik məlumat vərəqi boyanı kəskin oral toksiklik üzrə Kateqoriya 4 kimi, udulduqda zərərli olaraq təsnif edir və Sigma-Aldrich metilen mavisi SDS sənədinə uyğun təsdiqlənmiş tullantı utilizasiyası yolu ilə kənarlaşdırılmasını tələb edir. Etidium bromid üçün daha güclü genotoksiklik xəbərdarlıqları mövcuddur; onun Sigma-Aldrich etidium bromid SDS sənədində cinsi hüceyrələrə şübhəli təsirlər də qeyd olunur. Thermo Fisher nuklein turşusu boyaları təlimatında göstərildiyi kimi, onun gelləri və məhlulları adətən təhlükəli kimyəvi tullantı kimi ayrıca toplanır. Hər ikisi üçün SDS sənədinə və müəssisə qaydalarına əməl edin. Quru boyanı kip bağlı və quru saxlayın, işçi boya məhlulundan yalnız protokolun icazə verdiyi qaydada təkrar istifadə edin, boyanmış membranları filtr kağızları arasında quru saxlayın və zolaqlar diffuziya ilə yayılmamış gellərin fotoşəklini çəkin.

Laboratoriya masasındakı əsas qaydanı xatırlayın. Gellər yüksək yükləmədə ağ işıq altında görünməni yoxlayır. Membranlar isə zond həssas işi görməzdən əvvəl köçürməni və yükləməni yoxlayır. Bir boya hər ikisinə xidmət edir: məhdud həssaslıq, geri dönən bağlanma və əməliyyatların ciddi ardıcıllığı ilə.