EMB aqarında E. coli və digər koloniyaların görünüşünün şərhi

Tələbə naməlum mikroorqanizmi eozin-metilen mavisi aqarına ştrix üsulu ilə əkir, gecə boyu inkubasiya edir və geri qayıdanda kasada yaşıl parıltılı tünd koloniyalar görür. Dəftərdəki qeyd belədir: "E. coli, təsdiqlənib." Bu qeyd kasanın əsaslandıra biləcəyindən daha artıq iddia irəli sürür. Kasa müəyyən şəraitdə böyümə və fermentasiya fenotipini göstərir. Növün kimliyi ayrıca sübut tələb edən ayrıca iddiadır.

Bu bələdçi EMB aqarının nəticələrinə şərh tələb edən bir tapşırıq kimi yanaşır. O, əsas prinsipi izah edir, nəzarət nümunələri ilə birlikdə illüstrativ kasa atlasını nəzərdən keçirir və dərslikdəki görünüşün yanıltıcı olduğu halları göstərir.

Kasanın əsaslandığı prinsip

EMB aqarı həm selektiv, həm də diferensial mühitdir. Eozin Y və metilen mavisi boyaları bir çox Qram-müsbət mikroorqanizmin böyüməsini zəiflədir, buna görə də mühit Qram-mənfi mikroorqanizmlərin böyüməsinə üstünlük verir. Eyni boyalar indikator kimi də fəaliyyət göstərir: mikroorqanizm mövcud şəkəri fermentasiya edib yerli olaraq kifayət qədər turşu əmələ gətirdikdə, koloniya boyanı çox udur və tünd bənövşəyidən göy-qara rəngə qədər dəyişir. Güclü turşu əmələgəlməsi zamanı koloniyanın səthində metallik yaşıl irizasiya görünə bilər. Eozin-metilen mavisi aqarı kasaları üçün ASM protokolu seleksiya və diferensiasiyanın bu birləşməsini təsvir edir və tədris üçün istinad fotoşəkilləri təqdim edir.

Hər hansı nəticəni şərh etməzdən əvvəl bir detal vacibdir: hansı tərkibin istifadə olunduğunu yoxlayın. Daha köhnə Holt Harris Teague tərkibi laktoza ilə yanaşı saxaroza da ehtiva edir, Levine EMB isə yalnız laktoza ehtiva edir. Serratia marcescens-in bir çox izolyatı kimi saxarozanı fermentasiya edən, lakin laktozanı fermentasiya etməyən mikroorqanizm bu iki variantda fərqli görünə bilər. EMB mühitlərinə dair istehsalçı sənədləri bu tərkib fərqini açıq şəkildə göstərir. Nəticə ilə yanaşı istehsalçını və tərkibi də dəftərə qeyd edin.

Hazırlanmış, lakin əkilməmiş EMB aqarı adətən qırmızı-qəhvəyidən qırmızımtıl-bənövşəyiyə qədər rəngdə olur, bəzən yaşılımtıl çalara və ya xırda çöküntüyə malik olur. Bu fon rəngi böyümə deyil. Hər bir nəticəni əkilməmiş kasa və ya sənədləşdirilmiş ilkin görünüşlə müqayisə edin. Tədris protokolunda başqa göstəriş yoxdursa, ilkin kasanı 35 ilə 37 C arasında temperaturda təxminən 18 ilə 24 saatlıq aerob inkubasiyadan sonra qiymətləndirin. Daha uzun inkubasiya fermentasiyanın görünüşünü dəyişə bilər.

Kasaya necə baxmalı

İki növ işıqdan istifadə edin. Əvvəlcə kasanı əks olunan və ya maili işıq altında yoxlayın və əyin: metallik parıltı irizasiyalıdır və baxış bucağından asılı olaraq görünə və ya itə bilər. Sonra koloniyanın rəngini və tünd mərkəzlərini qiymətləndirmək üçün kasanı içindən keçən işıqla nəzərdən keçirin. Bir-birindən yaxşı ayrılmış koloniyaları seçin, çünki sıxlıq və qonşu koloniyalar yerli turşu toplanmasını dəyişdirir və rəngi zəiflədə və ya gücləndirə bilər. ASM şəkillər toplusu bunu birbaşa göstərir: qarışıq kulturada E. coli gözlənilən parıltısını itirə bilər, çünki ətrafdakı mikroorqanizmlər turşu mühitini dəyişdirir.

Tapşırıq imkan verdikdə nəzarət nümunələri daxil edin. EMB mühitləri üçün standart keyfiyyətə nəzarət cədvəllərində göstərildiyi kimi, adi tədris dəstinə göy-qara rəng və metallik parıltı fenotipi üçün E. coli ATCC 25922, rəngsiz fenotip üçün Salmonella Typhimurium ATCC 14028 və ya Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 kimi fermentasiya etməyən mikroorqanizm, inhibisiya nəzarəti üçün isə Enterococcus faecalis və ya Staphylococcus aureus kimi Qram-müsbət mikroorqanizm daxildir. Müsbət nəzarət nümunəsində parıltı yoxdursa, naməlum mikroorqanizmdən şübhələnməzdən əvvəl inkubasiyanı, sıxlığı və ya tərkibi nəzərdən keçirin.

İllüstrativ kasa atlası

Aşağıdakı kasalar yaradılmış illüstrasiyalardır, həqiqi kulturların fotoşəkilləri deyil. Onlar hər hansı bir ştammın dəqiq rəng çalarını deyil, axtarılmalı olan görünüş nümunəsini göstərir. Onları ASM istinad fotoşəkilləri və tədris laboratoriyasındakı həqiqi kasalarla müqayisə edin.

Kasa 1: EMB aqarında Escherichia coli, laktozanı güclü fermentasiya edən mikroorqanizm

EMB aqarında E. coli adətən tünd bənövşəyidən göy-qaraya qədər rəngdə olur, çox vaxt tünd mərkəzə və güclü turşu əmələgəlməsindən yaranan metallik yaşıl parıltıya malikdir. Parıltı tələbələrin axtardığı məşhur əlamətdir, lakin onu müəyyənedici xüsusiyyət kimi deyil, dəstəkləyici sübut kimi qəbul edin. Parıltının intensivliyi ştammdan, inkubasiya müddətindən, koloniyaların sıxlığından və baxış bucağından asılı olaraq dəyişir. Parıltının olmaması E. coli-ni istisna etmir, parıltısız tünd koloniya isə bir neçə başqa fermentasiya edən mikroorqanizmə işarə edir. Sonrakı işlər üçün sıx sektora əsaslanmaq əvəzinə, yaxşı ayrılmış bir koloniya seçin.

Kasa 2: EMB aqarında Klebsiella pneumoniae, selikli koloniyalar əmələ gətirən fermentasiyaedici mikroorqanizm

EMB aqarında Klebsiella pneumoniae adətən çəhrayı-bənövşəyidən qəhvəyi-bənövşəyiyə qədər çalarlarda iri, parlaq, selikli koloniyalar əmələ gətirir. Onların çox vaxt tünd mərkəzləri olur, lakin adətən güclü metallik parıltısı olmur. Oxşar morfologiya Enterobacter kimi qohum fermentasiyaedici mikroorqanizmlərdə də müşahidə olunur. Selikli tekstura və koloniyanın ölçüsü şərhin bir hissəsidir: kiçik və yastı çəhrayı koloniyanın şərhdə çəkisi iri, qübbəvari, selikli koloniyadan fərqlidir. E. coli-də olduğu kimi, kasa fermentasiya fenotipinə işarə edir, növ səviyyəsində adlandırma isə aşağıda təsvir olunan biokimyəvi təsdiqləməni tələb edir.

Kasa 3: EMB aqarında Salmonella və digər fermentasiya etməyən mikroorqanizmlər, rəngsiz koloniyalar

EMB aqarında Salmonella və laktozanı fermentasiya etməyən digər oxşar mikroorqanizmlər, o cümlədən Shigella və bir çox Pseudomonas izolyatı, adətən rəngsiz, yarımşəffaf və ya solğun kəhrəba rəngli koloniyalar şəklində böyüyür. Bəzi tərkiblər və şərait zəif çəhrayımtıl çalar yaradır, buna görə də solğun çəhrayı koloniya avtomatik olaraq fermentasiyaedici mikroorqanizm sayılmır. EMB Salmonella-nı Shigella-dan və ya digər fermentasiya etməyən mikroorqanizmlərdən fərqləndirmir; bu fərqləndirmə sonrakı testlərin vəzifəsidir. E. coli-yə bənzər metallik koloniyalar əmələ gətirən laktoza-müsbət Salmonella ştammlarının da sənədləşdirildiyini nəzərə alın. Bu, tək bir kasanın məsələni yekunlaşdıra bilməməsinin daha bir səbəbidir.

Kasa 4: Serratia marcescens və tərkibin yaratdığı yanılma

Serratia marcescens ayrıca bölməyə layiqdir, çünki tələbələr çox vaxt qırmızı koloniyalar gözləyir və sonra kasanı yanlış şərh edirlər. Klinik izolyatların əksəriyyəti laktozanı fermentasiya etmir, buna görə də Levine EMB-də onlar çox vaxt solğun və ya zəif rəngli görünür. Bir çox izolyat saxarozanı fermentasiya etdiyindən, saxaroza ehtiva edən tərkib daha tünd və ya turşu əmələgəlməsi ilə daha çox əlaqəli reaksiya verə bilər. 35 ilə 37 C arasında temperaturda klassik qırmızı prodiqiozin piqmentini də gözləməyin; inkubator temperaturunda piqment əmələgəlməsi etibarlı deyil. Protokolda EMB aqarında Serratia marcescens qeyd edilirsə, həmin ifadənin hansı tərkibə əsaslandığını yoxlayın. Serratia metabolizminə dair icmal bu yanılmanın arxasında duran laktoza-mənfi və saxaroza üzrə dəyişkən xüsusiyyətləri ümumiləşdirir.

Kasa 5: nəzarət nümunələri və böyüməsi inhibə olunan mikroorqanizmlər

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus və Bacillus kimi Qram-müsbət mikroorqanizmlərin böyüməsi EMB aqarında ümumiyyətlə inhibə olunur və ya nəzərəçarpacaq dərəcədə zəifləyir, baxmayaraq ki, inhibisiya hər ştamm üçün tam deyil. Nəzarət nümunələri dəsti şərhin əsaslı olmasını təmin edir: E. coli nəzarət nümunəsi göy-qara rəng və parıltı ilə yaxşı böyümə göstərməli, fermentasiya etməyən nəzarət nümunəsi rəngsiz böyümə göstərməli, inhibisiya nəzarəti isə zəif böyümə göstərməli və ya heç böyüməməlidir. İnhibisiya nəzarəti yaxşı böyüyürsə, selektiv mərhələ uğursuz olub və həmin partiyadakı bütün digər nəticələr şübhəlidir. Boyama üsulları kultura mühitlərindən fərqli bir suala cavab verir; laboratoriyada predmet şüşəsinin boyanması ilə bağlı məlumat üçün metilen mavisi ilə boyama atlasına baxın.

Məhdud çərçivəli müqayisə

Yanıltıcı görünüşləri üç cümlə ümumiləşdirir. Tünd rəng E. coli demək deyil, çünki Klebsiella, Enterobacter və digər fermentasiyaedici mikroorqanizmlər parıltısız tünd mərkəzlər əmələ gətirir. Çəhrayı rəng Klebsiella demək deyil, çünki orta sürətlə və ya yavaş fermentasiya edən mikroorqanizmlər və fermentasiya etməyən kimi təsnif olunan bəzi mikroorqanizmlər çəhrayı və ya açıq bənövşəyi görünür. Parıltı qəti şəkildə E. coli demək deyil, çünki digər güclü fermentasiyaedici mikroorqanizmlər də onu yarada bilər. Tədris protokolu və onun qarışıq kultura şəkilləri bu yanlış yanaşmaların hər birini göstərir.

Təsdiqləmənin məhdudiyyətləri

EMB aqarı növü deyil, fenotipi göstərir. Fərqli mikroorqanizmlər eyni koloniya görünüşünə malik ola bilər, bir mikroorqanizm isə ştamm, yaş, sıxlıq, tərkib və inkubasiyadan asılı olaraq dərslikdəki görünüşündən fərqlənə bilər. Buna görə tədris və klinik iş proseslərində EMB morfologiyası ilkin ehtimal kimi qəbul edilir.

Tələbə üçün əsaslandırıla bilən iş ardıcıllığı belədir: ayrılmış koloniyanı təsvir edin (ölçü, rəng, mərkəz, maili işıqda parıltı, selikli xüsusiyyət), tərkibi, inkubasiya müddətini və temperaturunu, eləcə də nəzarət nümunələrini qeyd edin; sonra hər hansı təsdiqləyici testdən əvvəl yaxşı ayrılmış koloniyanı yenidən əkərək saf kultura əldə edin. Adi sonrakı yoxlamalara E. coli və koliformların ehtimala əsaslanan identifikasiyası üçün Qram boyaması və IMViC reaksiyaları, bağırsaq mikroorqanizmləri üçün TSI və ya KIA və mikroorqanizmə xas biokimyəvi test dəstləri daxildir. Tapşırıq tələb etdikdə seroloji, MALDI TOF və ya digər validasiya olunmuş identifikasiya üsullarından istifadə olunur. EMB-nin selektiv və diferensial bağırsaq kultura mühitləri arasında yerini anlamaq üçün bağırsaq kultura mühitlərinə giriş materiallarına və Qram boyaması ilə sonrakı yoxlamaya baxın. Predmet şüşəsində mavi boya ilə boyamanın nəyi sübut edə biləcəyi və nəyi sübut edə bilməyəcəyi ilə bağlı sual üçün metilen mavisi ilə boyama atlası eyni yanaşma ilə müşahidəni nəticədən ayrı saxlayır.

Nəticədən əvvəl müşahidəni yazın. "Levine EMB-də 24 saatdan sonra baxış bucağından asılı yaşıl parıltılı tünd göy-qara koloniyalar; güclü laktoza fermentasiyası ilə uyğundur" ifadəsi əsaslandırıla bilər. "E. coli, təsdiqlənib" ifadəsi isə kasanın təkbaşına təmin edə bilmədiyi təsdiqləmə mərhələsini tələb edir.