DNA আৰু RNA ৰঞ্জনৰ বাবে মিথিলিন ব্লু: জেল আৰু মেমব্ৰেনত প্ৰয়োগ

এজন শিক্ষাৰ্থীয়ে এগাৰোজ জেল চলায়, মিথিলিন ব্লুৰে ৰঞ্জিত কৰে, আৰু উজ্জ্বল বেণ্ড দেখা পোৱাৰ কথা থকা ঠাইত একো নেদেখে। কাষৰ কৰ্মস্থানত এজন পোষ্টডক গৱেষকে একেটা নীলা দ্ৰৱণৰ বটল ব্যৱহাৰ কৰি নৰ্দাৰ্ন মেমব্ৰেন ৰঞ্জিত কৰে আৰু তিনি মিনিটতে স্পষ্ট ৰাইব’ছ’মীয় বেণ্ড পায়। শিক্ষাৰ্থীজনে জেলটো বিফল হোৱা বুলি সিদ্ধান্ত লয়। জেলটো বিফল হোৱা নাছিল। কাম দুটা পৃথক আছিল, আৰু একেটা ৰঞ্জকে সেই দুটাৰ উত্তৰ দিয়ে ভিন্ন সংবেদনশীলতা, ভিন্ন পটভূমি আৰু পৰৱৰ্তী কামৰ বাবে ভিন্ন নিয়মেৰে।

মিথিলিন ব্লুৰে DNA ৰঞ্জন আৰু মিথিলিন ব্লুৰে RNA ৰঞ্জনৰ ৰসায়ন একে, কিন্তু উদ্দেশ্য একে নহয়। জেলত ৰঞ্জকটোৱে ছিদ্ৰযুক্ত মেট্ৰিক্সৰ ভিতৰত কিমান নিউক্লিক এচিড আছে তাক দেখুৱায়। মেমব্ৰেনত ই দেখুৱায় স্থানান্তৰ সফল হৈছে নে নাই আৰু লেনবোৰত সমান পৰিমাণে নমুনা লোড কৰা হৈছে নে নাই। এই পাৰ্থক্য স্পষ্ট হ’লেই প্ৰটোকল, শনাক্তকৰণৰ সীমা আৰু সামঞ্জস্যৰ সীমা বুজিবলৈ সহজ হয়।

চমু উত্তৰ

মিথিলিন ব্লু হৈছে এটা সমতল কেটায়নিক ৰঞ্জক। ফছফেটৰ প্ৰতি স্থিৰবৈদ্যুতিক আকৰ্ষণ, বেছ-যুগলৰ মাজত আন্তঃপ্ৰৱেশ আৰু ক্ষুদ্ৰ খাঁজৰ সৈতে সংযোগৰ সমন্বয়েৰে ই নিউক্লিক এচিডৰ সৈতে অসহযোজী আৰু প্ৰত্যাৱৰ্তনীয়ভাৱে বান্ধ খায়। এই প্ৰত্যাৱৰ্তনীয়তাই মূল কথা। বেণ্ডবোৰ ৰঞ্জিত কৰি দৃশ্যমান পোহৰত চাব আৰু নথিভুক্ত কৰিব পাৰি; তাৰ পিছত ক্ল’নিং, হাইব্ৰিডাইজেচন বা পুনৰ প্ৰ’ব প্ৰয়োগৰ বাবে ৰঞ্জক আঁতৰাব বা পৰিশোধন কৰিব পাৰি।

দ্বিসূত্ৰী DNA-ৰ মিথিলিন ব্লু এগাৰোজ জেল ৰঞ্জনৰ বাবে মানক দ্ৰুত পদ্ধতিটো হ’ল পানীত 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL), প্ৰায় 15 মিনিট ৰঞ্জন আৰু প্ৰায় 15 মিনিট পানীৰে ৰঞ্জক অপসাৰণ, তাৰ পিছত বগা পোহৰৰ বাকচত পৰ্যবেক্ষণ। মেমব্ৰেনৰ বাবে প্ৰচলিত নৰ্দাৰ্ন ব্লট পদ্ধতিটো হ’ল pH 5.2-ৰ ওচৰত ছ’ডিয়াম এচিটেটত 0.02 ৰ পৰা 0.04 percent ৰঞ্জক, স্থানান্তৰ আৰু স্থিৰীকৰণৰ পিছত কেইমিনিটমান ৰঞ্জন, তাৰ পিছত পানীৰে ধোৱা আৰু হাইব্ৰিডাইজেচনৰ আগতে সম্পূৰ্ণ ৰঞ্জক অপসাৰণ। সংবেদনশীলতা সীমিত: ভাল পৰিস্থিতিত প্ৰতিটো জেল বেণ্ডত কেইদহৰ পৰা কেইশ নেন’গ্ৰাম, আৰু সতৰ্কতামূলক নিৰ্দেশিকাত 0.5 ৰ পৰা 1 microgram উল্লেখ কৰা হয়। এই পৰিমাণ ইথিডিয়াম ব্ৰ’মাইড আৰু SYBR ৰঞ্জকৰ তুলনাত একাধিক ক্ৰমে বেছি। মেমব্ৰেনত এটা নিৰ্দিষ্ট ট্ৰান্সক্ৰিপ্টৰ বাবে কোনো উপযোগী একক শনাক্তকৰণ সীমা নাই, কাৰণ ৰঞ্জনটোৱে মূলতঃ প্ৰচুৰ পৰিমাণে থকা ৰাইব’ছ’মীয় RNA আৰু লোড কৰা মুঠ পদাৰ্থ দেখুৱায়। কোনো পদ্ধতিতেই খুচুৰা বিক্ৰী হোৱা পৰিপূৰক দ্ৰৱণ ব্যৱহাৰ নকৰিব। বৈধতা-নিৰূপিত পদ্ধতিসমূহে বিশ্লেষণাত্মক মানৰ ৰঞ্জক, নিৰ্দিষ্ট বাফাৰ আৰু RNA জড়িত থাকিলে RNase-মুক্ত ব্যৱস্থাপনা ধৰি লয়।

বন্ধন কেনেকৈ হয়, আৰু ক’ত ই বিভ্ৰান্ত কৰে

উপযোগী আৰ্হিটোৰ তিনিটা অংশ আছে। প্ৰথমতে, ধনাত্মক আধানযুক্ত বলয়-ব্যৱস্থাটো ঋণাত্মক আধানযুক্ত ফছফেট মেৰুদণ্ডৰ প্ৰতি আকৰ্ষিত হয়। বৰ্ণালীবীক্ষণমূলক গৱেষণাত কম লৱণৰ পৰিস্থিতিত এই স্থিৰবৈদ্যুতিক উপাদানটোৱেই প্ৰধান বুলি পোৱা যায়। আনহাতে, মডেলিং আৰু আণৱিক গতিবিদ্যাই দ্বিসূত্ৰী DNA-ৰ বাবে আন্তঃপ্ৰৱেশ আৰু ক্ষুদ্ৰ খাঁজত বন্ধনক সুস্থিৰ ৰূপ হিচাপে দেখুৱায়, যিদৰে মিথিলিন ব্লু আৰু DNA-ৰ বন্ধনৰ বৰ্ণালীবীক্ষণমূলক অধ্যয়ন-ত সংক্ষেপে বৰ্ণনা কৰা হৈছে। দ্বিতীয়তে, GC-ৰ প্ৰতি কিছু অগ্ৰাধিকাৰ আছে। মডেলিঙে CpG আৰু GpC ধাপৰ প্ৰতি অগ্ৰাধিকাৰ দেখুৱায়, আৰু মিথিলিন ব্লুৰ আন্তঃপ্ৰৱেশৰ অগ্ৰাধিকাৰ সম্পৰ্কীয় গৱেষণাৰ পৰীক্ষাসমূহে GC-সমৃদ্ধ দ্বিসূত্ৰী গঠনৰ সৈতে অধিক সংযোগৰ কথা জনায়; কিন্তু AT দ্বিসূত্ৰী গঠনেও ৰঞ্জক বান্ধে। নিয়মীয়া ৰঞ্জন অনুক্ৰম-নিৰ্দিষ্ট নহয়। তৃতীয়তে, একসূত্ৰী DNA আৰু RNA মূলতঃ স্থিৰবৈদ্যুতিক আকৰ্ষণ আৰু সহজলভ্য বেছ তথা দ্বিসূত্ৰী অঞ্চলৰ সৈতে ষ্টেকিংৰ জৰিয়তে বান্ধ খায়। সেইবাবেই দৈৰ্ঘ্য, অনুক্ৰম আৰু গৌণ গঠনৰ সৈতে ৰঞ্জনৰ তীব্ৰতা সলনি হয়।

ইয়াৰ দুটা পৰিণাম আছে। বন্ধন অসহযোজী হোৱা বাবে ধুলে ৰঞ্জক ওলাই যায়। ইচ্ছাকৃতভাৱে স্থিৰীকৰণ নকৰিলে পলিএক্ৰিলামাইডৰ বেণ্ড দ্ৰুতগতিত ম্লান হয়। সাধাৰণ ৰঞ্জন অস্থায়ী হোৱা বাবেই বিশেষ স্থায়ী স্থিৰীকৰণ পদ্ধতি আছে, যিদৰে PAGE জেলৰ বাবে ছ’ট’ আৰু ড্ৰেপাৰে বৰ্ণনা কৰিছে। ৰঞ্জকটো আলোকসংবেদক হোৱা বাবে অক্সিজেনৰ উপস্থিতিত ৰঞ্জিত DNA-ত দীৰ্ঘ সময় উজ্জ্বল পোহৰ পৰিলে গুয়ানিন জাৰিত হ’ব পাৰে আৰু শেষত সূত্ৰত খণ্ডন ঘটিব পাৰে। এই প্ৰক্ৰিয়া মিথিলিন ব্লুৰ আলোকসংবেদনত গুয়ানিনৰ জাৰণ সম্পৰ্কীয় গৱেষণাত বিশদভাৱে বৰ্ণনা কৰা হৈছে। বগা পোহৰত চমু সময়ৰ পৰ্যবেক্ষণে প্ৰচলিত ইথিডিয়াম ব্ৰ’মাইড কৰ্মপদ্ধতিৰ সুপৰিচিত UV ক্ষতি এৰায়, আৰু পৰৱৰ্তী ব্যৱহাৰৰ বাবে নমুনা উদ্ধাৰৰ ক্ষেত্ৰত এই সুবিধা বাস্তৱ। দৃশ্যমান পোহৰ তুলনামূলকভাৱে মৃদু, কিন্তু ক্ষতিহীন নহয়। DNA ক্ল’ন কৰা হ’ব যদি, পোহৰত ৰখাৰ সময় চমু ৰাখিব। এই সতৰ্কতাৰ আঁৰৰ বিস্তৃত আলোকৰসায়নৰ বাবে মিথিলিন ব্লুৰ আলোকৰসায়নৰ দুটা পথ চাওক। জাৰিত ৰূপে কিয় বান্ধ খায় আৰু বিজাৰিত ৰূপে কিয় নাখায় তাক বুজোৱা ৰেডক্স যোৰ আৰু আধানৰ অৱস্থাসমূহৰ বাবে মিথিলিন ব্লুৰ গঠন আৰু ধৰ্মৰ ৰসায়ন চাওক।

প্ৰথম কাম: জেলৰ ভিতৰত ৰঞ্জন

জেল ৰঞ্জনে এটা প্ৰশ্নৰ উত্তৰ দিয়ে: এই বেণ্ডত চকুৰে দেখা পাব পৰাকৈ যথেষ্ট নিউক্লিক এচিড আছেনে। এগাৰোজত দ্বিসূত্ৰী DNA-ৰ ক্ষেত্ৰটোৱেই আটাইতকৈ ভালদৰে অধ্যয়ন কৰা হৈছে। ফ্ল’ৰেছ আৰু সহকৰ্মীসকলৰ মূল মিথিলিন ব্লু জেল পদ্ধতি-য়ে 1 percent এগাৰোজত 0.02 percent দ্ৰুত প্ৰটোকলৰ বৈধতা নিৰূপণ কৰিছিল আৰু তাৰ পিছত সফল উদ্ধাৰ আৰু ক্ল’নিং দেখুৱাইছিল। একেটা যোগানকাৰীৰ প্ৰটোকল IBI Scientific-ৰ মিথিলিন ব্লু পণ্যৰ পৃষ্ঠা-তো আছে, য’ত 0.04 percent মেমব্ৰেন পদ্ধতি আৰু দ্ৰুত জেল পদ্ধতি কাষে কাষে দিয়া হৈছে।

ব্যৱহাৰিক কৰ্মপদ্ধতি:

1. জেল সাধাৰণভাৱে চলাওক। ইলেক্ট্ৰ’ফ’ৰেছিছৰ পিছত ৰঞ্জন কৰক, চলি থাকোঁতে নহয়; অৱশ্যে পৰিৱৰ্তিত পদ্ধতিৰ বাবে স্থানান্তৰ বা পৃথকীকৰণ ক্ষমতাৰ বৈধতা নিৰূপণ কৰা থাকিলে ব্যতিক্ৰম হ’ব পাৰে।
2. পাতিত পানীত 0.02 percent w/v মিথিলিন ব্লুত প্ৰায় 15 মিনিট ডুবাই ৰাখক আৰু মৃদুভাৱে লৰাই থাকক।
3. কেইবাবাৰো পানী সলাই মুঠ প্ৰায় 15 মিনিট ৰঞ্জক আঁতৰাওক, যেতিয়ালৈকে মেট্ৰিক্সৰ পটভূমিৰ ৰং কমি বেণ্ডবোৰ স্পষ্ট নহয়।
4. বগা পোহৰৰ আলোকযন্ত্ৰত তৎক্ষণাৎ ফটো লওক।

এগাৰোজ আৰু পলিএক্ৰিলামাইডৰ আচৰণ পৃথক। এগাৰোজে মেট্ৰিক্সত ৰঞ্জক ধৰি ৰাখে, গতিকে ৰঞ্জক অপসাৰণেই ধীৰ ধাপ। পাতল পলিএক্ৰিলামাইড জেল দ্ৰুত ৰঞ্জিত হয়, কিন্তু দ্ৰুত ৰঞ্জক হেৰুৱায়ো। ইয়াৰ ফলত পৰৱৰ্তী ব্যৱহাৰৰ বাবে বেণ্ড কাটি উলিওৱা সহজ হয়, কিন্তু দীৰ্ঘম্যাদী নথি সংৰক্ষণত অসুবিধা হয়। প্ৰতিষ্ঠিত Current Protocols-ধৰণৰ PAGE পদ্ধতি অনুসৰি, বাৰে বাৰে পানীৰে ধুই একেটা 0.02 percent পদ্ধতিৰে 20 ৰ পৰা 30 মিনিটত পলিএক্ৰিলামাইডত সংশ্লেষিত অলিগ’নিউক্লিঅ’টাইডৰ অৱস্থান নিৰ্ণয় কৰিব পাৰি। পৰৱৰ্তী ব্যৱহাৰৰ অলিগ’ৰ বাবে পাতল TBE-ত প্ৰায় 0.0002 percent-ৰ অতি পাতল পদ্ধতি কেইবা ঘণ্টা ধৰি ব্যৱহাৰ কৰাৰ তথ্য আছে, কিন্তু ইয়াৰ প্ৰমাণৰ ভিত্তি তুলনামূলকভাৱে দুৰ্বল।

DNA আৰু RNA-ৰ পাৰ্থক্য গুৰুত্বপূৰ্ণ। দ্বিসূত্ৰী DNA-এ আটাইতকৈ শক্তিশালী গঠনভিত্তিক বন্ধন দিয়ে। RNA আৰু একসূত্ৰী DNA ৰঞ্জিত হয়, কিন্তু দুৰ্বলভাৱে আৰু কম অনুমানযোগ্যভাৱে। ফৰ্মেলডিহাইড এগাৰোজ RNA জেলৰ ক্ষেত্ৰত বেছিভাগ পৰীক্ষাগাৰে জেলৰ ভিতৰত নীলা ৰঞ্জন এৰি প্ৰথমে RNA মেমব্ৰেনলৈ স্থানান্তৰ কৰে, তাৰ পিছত তাত ৰঞ্জন কৰে। ইয়াৰ ফলত দুৰ্বল জেল সংকেতৰ সলনি অধিক স্পষ্ট মেমব্ৰেন সংকেত আৰু লোডিঙৰ নথি পোৱা যায়।

দ্বিতীয় কাম: মেমব্ৰেনত ৰঞ্জন

মেমব্ৰেন ৰঞ্জনে আন এটা প্ৰশ্নৰ উত্তৰ দিয়ে: স্থানান্তৰ সফল হৈছিলনে, আৰু লেনবোৰ তুলনাযোগ্যনে। ইয়াৰ প্ৰচলিত প্ৰয়োগ হ’ল হেৰিন আৰু শ্মিটৰ প্ৰত্যাৱৰ্তনীয় নৰ্দাৰ্ন ব্লট ৰঞ্জন। মূল পদ্ধতিত pH 5.0-ত 50 mM ছ’ডিয়াম এচিটেটত 0.04 percent ৰঞ্জক ব্যৱহাৰ কৰি 2 ৰ পৰা 3 মিনিট ৰঞ্জন কৰা হৈছিল, তাৰ পিছত পানীৰে ধোৱা হৈছিল। হাইব্ৰিডাইজেচনৰ আগতে SSPE-ত পাতল SDS ব্যৱহাৰ কৰি ৰঞ্জক আঁতৰাব পৰা গৈছিল।

বহুলভাৱে ব্যৱহৃত আধুনিক পদ্ধতিটো এনেধৰণৰ:

1. RNA বা বিকৃতগঠনৰ DNA নাইলন বা নাইট্ৰ’চেলুল’জলৈ স্থানান্তৰ কৰক, তাৰ পিছত UV ক্ৰছলিংকিং বা তাপত বেকিং কৰি স্থিৰ কৰক, যাতে ৰঞ্জনৰ সময়ত নমুনা হেৰাই নাযায়।
2. ঐচ্ছিক, কিন্তু সাধাৰণতে কৰা হয়: মেমব্ৰেনটো 5 percent এচিটিক এচিডত প্ৰায় 15 মিনিট তিয়াওক।
3. pH 5.2-ৰ ওচৰত 0.3 ৰ পৰা 0.5 M ছ’ডিয়াম এচিটেটত 0.02 ৰ পৰা 0.04 percent মিথিলিন ব্লুৰে 5 ৰ পৰা 10 মিনিট ৰঞ্জন কৰক।
4. পানীৰে ধুই 5 ৰ পৰা 15 মিনিট ৰঞ্জক আঁতৰাওক, নথিভুক্ত কৰক, তাৰ পিছত হাইব্ৰিডাইজেচনৰ আগতে অৱশিষ্ট ৰঞ্জক আঁতৰাওক।

নৰ্দাৰ্নৰ কামত ধনাত্মক আধানযুক্ত নাইলনৰ ব্যৱহাৰেই প্ৰধান। একেটা এচিটিক এচিড আৰু এচিটেটৰ কৰ্মপদ্ধতি নাইট্ৰ’চেলুল’জতো কাম কৰে। ছবিখন স্থানান্তৰ নিশ্চিত কৰিবলৈ, 28S আৰু 18S বেণ্ড তুলনা কৰিবলৈ (বা বেক্টেৰিয়াৰ RNA-ৰ বাবে 23S আৰু 16S), লেডাৰ আৰু মানক চিহ্নিত কৰিবলৈ আৰু মুঠ RNA-ৰ আনুমানিক স্বাভাৱিকীকৰণৰ নথি ৰাখিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। প্ৰকাশিত নৰ্দাৰ্ন পদ্ধতিসমূহে লোডিং পৰীক্ষাৰ বাবে ৰঞ্জিত ৰাইব’ছ’মীয় বেণ্ডৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰে। ইয়াৰ ভিতৰত স্বাভাৱিকীকৰণৰ বাবে মিথিলিন ব্লু ৰঞ্জিত ৰাইব’ছ’মীয় বেণ্ড ব্যৱহাৰ কৰা দুগ্ধবিজ্ঞানৰ গৱেষণাও আছে। ছাউদাৰ্ন মেমব্ৰেনো একেদৰে দৃশ্যমান কৰিব পাৰি, কিন্তু নৰ্দাৰ্নৰ লোডিং আৰু স্থানান্তৰ পৰীক্ষাৰ বাবে এই ৰঞ্জকৰ ব্যৱহাৰ বহুগুণে অধিক প্ৰতিষ্ঠিত। লগতে, স্থানান্তৰৰ আগতে ছাউদাৰ্ন DNA-ৰ গঠন বিকৃত কৰা হয়, সেয়ে জেলৰ সংবেদনশীলতাৰ পৰিসংখ্যা ইয়াত প্ৰযোজ্য নহয়।

শনাক্তকৰণৰ সীমা আৰু পটভূমি: য’ত নীলা ৰঞ্জক পিছ পৰে

তলৰ তুলনাটো ইচ্ছাকৃতভাৱে আনুমানিক। ৰঞ্জকৰ কাৰ্যক্ষমতা জেলৰ শতাংশ, বেণ্ডৰ প্ৰস্থ, আলোকীয় ব্যৱস্থা আৰু ৰঞ্জক অপসাৰণৰ নিয়মানুৱৰ্তিতাৰ ওপৰত নিৰ্ভৰ কৰে। প্ৰতিটো সংখ্যাক নিৰ্দিষ্ট মান হিচাপে নহয়, পৰিমাণৰ ক্ৰমৰ সূচক হিচাপে লওক।

সীমিত সংকেতটো ব্যৱহাৰযোগ্য হ’ব নে নহয়, সেয়া পটভূমি নিয়ন্ত্ৰণে নিৰ্ধাৰণ কৰে। মুক্ত ৰঞ্জক তীব্ৰ ৰঙীন, সেয়ে বন্ধিত ৰঞ্জক নাআঁতৰোৱাকৈ অবন্ধিত ৰঞ্জক আঁতৰালেহে বৈপৰীত্য পোৱা যায়। অধিক ঘন ৰঞ্জকে খুব কম ক্ষেত্ৰতে সংবেদনশীলতা বঢ়ায়। ই মূলতঃ ৰঞ্জক অপসাৰণৰ সময় বঢ়ায়। ব্যৱহাৰ কৰিবলগীয়া একেই জেল, মেমব্ৰেন আৰু কেমেৰাৰে ক্ৰমে পাতল কৰা নমুনাৰ শ্ৰেণী পৰীক্ষা কৰক, আৰু কেৱল সেই পৰিসৰ ব্যৱহাৰ কৰক য’ত সমন্বিত ঘনত্ব যোগ কৰা পৰিমাণৰ সমানুপাতিক থাকে। মিথিলিন ব্লু অৰ্ধ-পৰিমাণগত লোডিং স্বাভাৱিকীকৰণৰ বাবে উপযোগী। ই বিস্তৃত গতিশীল পৰিসৰৰ পৰিমাণগত পৰীক্ষা নহয়, কাৰণ মেমব্ৰেনৰ ধাৰণক্ষমতা, স্থানান্তৰৰ দক্ষতা, সম্পৃক্ততা আৰু ৰঞ্জক অপসাৰণ লেনভেদে সলনি হয়।

সামঞ্জস্যৰ সীমা: ৰঞ্জনৰ পিছত কি অক্ষত থাকে

নীলা ৰঞ্জনৰ পিছত ক্ল’নিং সম্ভৱ বুলি দেখুওৱা হৈছে। ফ্ল’ৰেছ আৰু সহকৰ্মীসকলে ৰঞ্জিত এগাৰোজ বেণ্ড কাটি উলিয়াই DNA উদ্ধাৰ কৰিছিল, তাৰ পিছত লাইগেচন আৰু ট্ৰেন্সফৰ্মেচন কৰিছিল। তেওঁলোকে UV-ৰ সৈতে ইথিডিয়াম ব্ৰ’মাইড ব্যৱহাৰৰ পিছৰ তুলনাত উন্নত ক্ল’নিংৰ কথা জনাইছিল। সম্ভাব্য কাৰণটো কম আলোকক্ষতি, ৰঞ্জকটোৰ নিজস্ব কোনো উপকাৰ নহয়। বগা পোহৰত ৰখাৰ সময় চমু ৰাখক আৰু উদ্ধাৰ কৰা DNA সাধাৰণ জেল নিষ্কাশন-পৰিশোধন প্ৰক্ৰিয়াৰে পৰিশোধন কৰক।

PCR আৰু ছিকুৱেন্সিংৰ বাবে প্ৰমাণ তুলনামূলকভাৱে কম। অৱশিষ্ট ৰঞ্জক নিউক্লিক এচিডৰ সৈতে বান্ধ খায়, সেয়ে এনজাইম-নিৰ্ভৰ ধাপৰ আগতে ৰঞ্জক আঁতৰাই পৰিশোধন কৰক। নীলা ৰঞ্জিত জেলৰ পৰা যথাযথভাৱে বিশুদ্ধ কৰা DNA-এ কাম কৰিব বুলি আশা কৰা হয়, কিন্তু বিভিন্ন পলিমাৰেজ আৰু ছিকুৱেন্সিং ৰসায়নে পোনপটীয়াকৈ বহন হৈ অহা ৰঞ্জক কিমান সহ্য কৰে, তাৰ ভাল পৰিমাণগত নিৰূপণ হোৱা নাই। সহ্য কৰিব বুলি ধৰি নল’ব।

ক্ৰম কঠোৰভাৱে মানিলে ব্লট হাইব্ৰিডাইজেচন সামঞ্জস্যপূৰ্ণ: স্থানান্তৰ, স্থিৰীকৰণ, ৰঞ্জন, নথিভুক্তকৰণ, ৰঞ্জক অপসাৰণ, হাইব্ৰিডাইজেচন। এইটোৱেই হেৰিন আৰু শ্মিটৰ পদ্ধতিৰ ক্ৰম। স্থানান্তৰৰ আগতে ৰঞ্জন কৰা বা ৰঞ্জক অপসাৰণ বাদ দিয়া পৃথক পদ্ধতি, আৰু ইয়াৰ নিজস্ব বৈধতা নিৰূপণৰ প্ৰয়োজন। ৰঞ্জক আঁতৰোৱাৰ পিছত মানক প্ৰ’ব অপসাৰণ আৰু পুনৰ প্ৰ’ব প্ৰয়োগ সাধাৰণভাৱে কৰিব পাৰি। একেটা ৰঞ্জক-পৰিয়ালেৰে কোষ-স্তৰৰ ৰঞ্জন আৰু স্থিৰীকৃত ফিল্মৰ যুক্তি জীৱন্ত কোষৰ পদ্ধতিত কিয় প্ৰযোজ্য নহয়, সেই বিষয়ে অণুবীক্ষণ ৰঞ্জনৰ এটলাছ চাওক।

পৰৱৰ্তী ব্যৱহাৰৰ এগাৰোজ আৰু নীলা ৰঞ্জকেৰে অৱস্থান নিৰ্ণয় কৰা PAGE অলিগ’ৰ বাবে বেণ্ড কাটি উলিওৱা কাৰ্যকৰী, যদিহে স্থায়ী স্থিৰীকৰণ পদ্ধতি এৰাই চলা হয়। প্ৰত্যাৱৰ্তনীয়ভাৱে বান্ধ খোৱা ৰঞ্জকৰ ক্ষেত্ৰত ৰঞ্জক অপসাৰণৰ পিছত ইলেক্ট্ৰ’ইলিউচন ৰাসায়নিকভাৱে যুক্তিসংগত, কিন্তু মিথিলিন ব্লুৰ বাবে নিৰ্দিষ্ট নিয়ন্ত্ৰিত উদ্ধাৰ-পৰিমাণৰ তথ্য কম। ইলিউচনৰ পিছত লৱণ আঁতৰাওক বা অধঃক্ষেপণ কৰক।

বাৰে বাৰে হোৱা বিফলতা

ম্লান জেল বেণ্ডে সাধাৰণতে ৰংভিত্তিক ৰঞ্জনৰ বাবে পদাৰ্থৰ পৰিমাণ অতি কম হোৱা বুজায়, বিশেষকৈ চুটি একসূত্ৰী বা RNA লক্ষ্যৰ ক্ষেত্ৰত। অধিক নমুনা লোড কৰক, সতেজ ৰঞ্জক ব্যৱহাৰ কৰক, ঘনত্ব বঢ়োৱাৰ আগতে ৰঞ্জনৰ সময় বঢ়াওক আৰু ৰঞ্জক অপসাৰণ আগতেই বন্ধ কৰক। বৈপৰীত্য নথকা সম্পূৰ্ণ নীলা জেল সাধাৰণতে অতিমাত্ৰা ৰঞ্জন বা কমবাৰ পানী সলোৱাৰ ফল। PAGE বেণ্ড ম্লান হোৱাটো প্ৰত্যাশিত ৰাসায়নিক আচৰণ, ৰঞ্জনৰ বিফলতা নহয়। সোনকালে ফটো লওক। মেমব্ৰেনৰ অসমান পটভূমিয়ে ভাঁজ, বুদবুদ, আঙুলিৰ ছাপ, অসমান লৰোৱা বা ঠায়ে ঠায়ে হোৱা স্থানান্তৰৰ ইংগিত দিয়ে। হাইব্ৰিডাইজেচন নিয়ন্ত্ৰণ নোহোৱাকৈ ইয়াক অসমান লোডিং বুলি নধৰিব। বিয়পি যোৱা দুৰ্বল ৰাইব’ছ’মীয় আৰ্হিয়ে অৱক্ষয় বুজাব পাৰে, কিন্তু অসম্পূৰ্ণ স্থানান্তৰ, অতি কম মুঠ RNA (সাধাৰণ লেনত কেইটামানৰ পৰা কেইদহ মাইক্ৰ’গ্ৰাম থাকে) বা অত্যধিক ৰঞ্জক অপসাৰণো ইয়াৰ কাৰণ হ’ব পাৰে। ৰঞ্জকটোৱে প্ৰচুৰ পৰিমাণে থকা ৰাইব’ছ’মীয় RNA দেখুৱায়। ই কোনো নিৰ্দিষ্ট ট্ৰান্সক্ৰিপ্ট দেখুৱাব নোৱাৰে। সেই কাম প্ৰ’বৰ।

অতিৰঞ্জিত দাবী নকৰাকৈ সুৰক্ষা আৰু ব্যৱস্থাপনা

ইথিডিয়াম ব্ৰ’মাইডৰ তুলনাত মিথিলিন ব্লু ব্যৱস্থাপনা কৰাটো সহজ, কিন্তু ই নিৰাপদ পদাৰ্থ নহয়। বৰ্তমানৰ MilliporeSigma সুৰক্ষা তথ্যপত্ৰই ৰঞ্জকটোক মুখেৰে গ্ৰহণৰ তীব্ৰ বিষাক্ততাৰ শ্ৰেণী 4 হিচাপে চিহ্নিত কৰে; গিলিলে ই ক্ষতিকাৰক। Sigma-Aldrich-ৰ মিথিলিন ব্লু SDS অনুসৰি ইয়াক অনুমোদিত বৰ্জ্য-নিষ্পত্তি পথেৰে আঁতৰাব লাগে। ইথিডিয়াম ব্ৰ’মাইডৰ বাবে অধিক কঠোৰ জিনগত বিষাক্ততাৰ সতৰ্কবাণী আছে, যাৰ ভিতৰত ইয়াৰ Sigma-Aldrich-ৰ ইথিডিয়াম ব্ৰ’মাইড SDS-ত জননকোষৰ ওপৰত সন্দেহজনক প্ৰভাৱো অন্তৰ্ভুক্ত। Thermo Fisher-ৰ নিউক্লিক এচিড ৰঞ্জক নিৰ্দেশিকা-ত উল্লেখ কৰাৰ দৰে, ইয়াৰ জেল আৰু দ্ৰৱণ সাধাৰণতে বিপজ্জনক ৰাসায়নিক বৰ্জ্য হিচাপে পৃথককৈ ৰখা হয়। দুয়োটাৰ বাবে SDS আৰু প্ৰতিষ্ঠানৰ নিয়ম মানি চলক। শুকান ৰঞ্জক টানকৈ বন্ধ কৰি শুকান অৱস্থাত ৰাখক, প্ৰটোকলে অনুমতি দিয়া পৰিমাণেহে ব্যৱহাৰযোগ্য ৰঞ্জক পুনৰ ব্যৱহাৰ কৰক, ৰঞ্জিত মেমব্ৰেন ফিল্টাৰ কাগজৰ মাজত শুকানকৈ সংৰক্ষণ কৰক আৰু বেণ্ডবোৰ ব্যাপন হৈ হেৰোৱাৰ আগতে জেলৰ ফটো লওক।

পৰীক্ষাগাৰৰ মূল কথাটো মনত ৰাখক। জেলে বগা পোহৰত অধিক পৰিমাণে লোড কৰা নমুনাৰ দৃশ্যমানতা পৰীক্ষা কৰে। প্ৰ’বে সংবেদনশীল কামটো কৰাৰ আগতে মেমব্ৰেনে স্থানান্তৰ আৰু লোডিং পৰীক্ষা কৰে। সীমিত সংবেদনশীলতা, প্ৰত্যাৱৰ্তনীয় বন্ধন আৰু কামৰ কঠোৰ ক্ৰমেৰে একেটা ৰঞ্জকে দুয়োটা উদ্দেশ্য পূৰণ কৰে।