አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ እና የሬቲኩሎሳይት ማቅለም፦ የተለየ ማቅለሚያ እና የሕያው ሕዋስ ዘዴ

አንድ ተማሪ የሬቲኩሎሳይት ቆጠራ ለማድረግ ይዘጋጃል፣ ሜቲሊን ሰማያዊ ያዛል፣ ከደም ጋር ይቀላቅለዋል፣ ነገር ግን ምንም የሚባል ነገር አያይም። አብሮት የሚማር ሌላ ተማሪ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ የሚል መለያ ያለበትን ጠርሙስ ይጠቀማል፣ በአንዳንድ ቀይ የደም ሕዋሳት ውስጥም ግልጽ ሰማያዊ ክሮችን ያያል። የመጀመሪያው ተማሪ በሁለተኛው ጠርሙስ ያለው ማቅለሚያ አዲስ የተዘጋጀ ወይም የበለጠ የተከማቸ ነው ብሎ ያስባል። ከሁለቱም አይደለም። የተለየ ሞለኪውል ይዟል።

በዚህ ዘርፍ የሚከሰቱ አብዛኛዎቹ ግራ መጋባቶች መነሻ ይህ የጽንሰ ሐሳብ ስህተት ነው። ስሙ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ የተሻሻለ የሜቲሊን ሰማያዊ ምርት እንደሆነ ያስመስላል። ኬሚስትሪው ግን ሌላ ነገር ይናገራል። አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ N የራሱ የColour Index ቁጥር፣ የራሱ የተተኪ ቡድኖች አደረጃጀት እና በሄማቶሎጂ ውስጥ የራሱ መስፈርት የተቀመጠለት ሚና ያለው የተለየ የፊኖታያዚን ማቅለሚያ ነው። ይህ ልዩነት ከተገለጸ በኋላ የቀረው ዘዴ፣ ማለትም ሕዋሳቱ ሲቀለሙ ለምን ሕያው መሆን እንዳለባቸው፣ ምን እንደ ሬቲኩሎሳይት እንደሚቆጠር፣ የሃይንዝ አካላት የት እንደሚካተቱ እና ብሪሊያንት ክሬዚል ሰማያዊ መቼ እንደሚገባ፣ በቀላሉ ይገባል።

አጭሩ መልስ

የሄማቶሎጂ ሪኤጀንት የሆነው አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ N በአጠቃላይ በPubChem የአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ መዝገብ ውስጥ Basic Blue 24 ተብሎ ይለያል፤ C.I. 52030፣ CAS 1934-16-3፣ ቀመሩም C18H22ClN3S ነው። ተራው ሜቲሊን ሰማያዊ በPubChem መዝገቡ ውስጥ ሜቲልታዮኒኒየም ክሎራይድ፣ Basic Blue 9 ነው፤ C.I. 52015፣ CAS 61-73-4፣ ቀመሩም C16H18ClN3S ነው። በመዋቅሩ፣ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ በቀለበቱ ላይ ሁለት የሜቲል ቡድኖችና የኤቲልአሚኖ የጎን ሰንሰለቶች አሉት፤ በተመሳሳይ ቦታዎች ሜቲሊን ሰማያዊ የዳይሜቲልአሚኖ ቡድኖች አሉት። ይህ ልዩነት የማቅለም ባህሪን ይቀይራል። የሄማቶሎጂ መጻሕፍት ተራውን ሜቲሊን ሰማያዊ ሬቲኩሎሳይቶችን ለማቅለም በአንጻራዊነት ደካማ፣ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊን ደግሞ የበለጠ ጥልቅና ወጥ ቀለም የሚሰጥ ብለው ይገልጻሉ፤ ይህ ንጽጽር በScienceDirect የአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ርዕስ ላይ ተጠቃሏል።

አዎ፣ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ የሱፕራቫይታል ማቅለሚያ ነው። በNCBI የሱፕራቫይታል ማቅለም መርሆች ግምገማ እንደተገለጸው፣ ሱፕራቫይታል ማቅለም ማለት ሕያው ሕዋሳትን ከሰውነት ከተወሰዱ በኋላና በፊክሴሽን ከመረጋጋታቸው በፊት ማቅለም ነው። አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊና ብሪሊያንት ክሬዚል ሰማያዊ ሁለቱም በዚህ ምድብ ውስጥ ይገባሉ፣ የCLSI ሬቲኩሎሳይት መስፈርትም አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊን በግልጽ እንደ ሱፕራቫይታል ማቅለሚያ ይሸፍናል። ተማሪዎች አንዳንድ ጊዜ ይህንን በፊክሴሽን የተረጋጉ ስሚሮች ላይ ከሚደረገው የሮማኖቭስኪ ማቅለም ጋር ይመድባሉ። ይህ አስተሳሰብ እዚህ አይሰራም። በመጀመሪያ ፊክሴሽን ከተደረገ፣ ዘዴው መስራቱን ያቆማል።

ተቀራራቢ የማቅለሚያ ስሞችን ለሚከታተሉ አንባቢዎች፣ ሜቲል ሰማያዊ ከሜቲሊን ሰማያዊ ጋር ያለው ልዩነት በአኒዮኒክ ትራይአሪልሜቴን ማቅለሚያ እና በካታዮኒክ ፊኖታያዚን ቤተሰብ መካከል ያለውን የተለየና የበለጠ ሰፊ ግራ መጋባት ይሸፍናል። የላቦራቶሪ ማቅለም አጠቃላይ መግለጫ የሱፕራቫይታል ሥራን በፊክሴሽን ከተረጋጉ ስሚሮች ዘዴዎች ጋር በአንድ አውድ ያስቀምጣል፣ የደም ሕዋሳት ቅርጽ መመሪያውም የሬቲኩሎሳይት ግምገማ በሰፊው የደም ሕዋሳት ልዩነት ግምገማ ውስጥ የት እንደሚገባ ያሳያል።

አንድ የካታሎግ ጥንቃቄ፦ የአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ የተለየ የዚንክ ክሎራይድ ድርብ ጨው ቅርጽ በCAS 6586-05-6 ሥር አለ። ስለዚህ የዘዴዎች ክፍል የተለመደውን ስም ብቻ ሳይሆን የጨው ቅርጹንና አቅራቢውን መጥቀስ አለበት።

ሱፕራቫይታል ማቅለም በእርግጥ ምን ያደርጋል?

ሬቲኩሎሳይት ኒውክሊየሱን ያጣ፣ ነገር ግን የቀረ ራይቦሶማል RNA የያዘ ወጣት ቀይ የደም ሕዋስ ነው። ባልተቀለመ እርጥብ ዝግጅት ውስጥ ይህ RNA አይታይም። የሱፕራቫይታል ማቅለሚያ ወደ ሕያው ሕዋሱ ይገባል፣ ያንንም RNA በማዝቀጥ ወይም በማሰባሰብ ወደ ሰማያዊ ቅንጣቶችና ክሮች ይለውጠዋል፤ ይህም በዘይት መጥለቅ ምልከታ የሚታየው መረብና ክር የሚመስል ቁስ ነው። ስለዚህ መረቡ የማቅለም ውጤት እንጂ ቀለም የሚጠብቅ ቀድሞ የተሠራ አጽም አይደለም። ለዚህ ነው የፕሮቶኮል ተለዋዋጮች፣ ማለትም የማቅለሚያ ክምችት፣ ባፈር፣ የደም ከማቅለሚያ ጋር ያለው ሬሾ፣ ሙቀትና ጊዜ፣ እንደ ማቅለሚያው ስም ሁሉ አስፈላጊ የሚሆኑት።

በተግባር ይህ ጥብቅ የሥራ ቅደም ተከተልን ይጠይቃል፦ መጀመሪያ መርጋት መከላከያ የተጨመረበትን ደም ከማቅለሚያ ጋር ይቀላቅሉ፣ ለተወሰነ ጊዜ ያቆዩ፣ ከዚያ ስሚሮችን አዘጋጅተው ፊክሴሽን ሳይደረግባቸውና ተጨማሪ ማቅለሚያ ሳይጠቀሙ ይመርምሯቸው። ከማቅለም በፊት ፊክሴሽን ማድረግ፣ ወይም ደብዛዛ ክሮችን የሚሸፍን ተጨማሪ ማቅለሚያ መጠቀም፣ ቆጠራው የሚመረኮዝበትን መረጃ ያጠፋል።

በአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ የሚሰራ የሬቲኩሎሳይት ፕሮቶኮል

በሁሉም ቦታ የሚያገለግል አንድ አቀነባበር የለም፣ ስለዚህ የተጠቀሙበትን ይግለጹ። በሰነድ የተመዘገቡ ሦስት የዘዴው ልዩ ቅርጾች ያለውን ልዩነት ያሳያሉ።

የተለመደው የብሬከር ዓይነት አሠራር ከፖታሲየም ኦክሳሌት ጋር በግምት 0.5 በመቶ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ይጠቀማል፤ ከበደንብ ከተቀላቀለ የEDTA ደም ጋር በእኩል የይዘት መጠን ተቀላቅሎ፣ በክፍል ሙቀት ለ10 እስከ 15 ደቂቃዎች ይቆያል። በቀስታ እንደገና ከተቀላቀለ በኋላ፣ ቀጭን ሽብልቅ ቅርጽ ያላቸው ስሚሮች ይዘጋጃሉ፣ በአየር ይደርቃሉ፣ ፊክሴሽን ሳይደረግባቸውም በ100x የዘይት ኦብጀክቲቭ ሌንስ ይመረመራሉ። የNCBI ሬቲኩሎሳይት ቆጠራ አሠራር ይህን የሥራ ፍሰትና ከእሱ ጋር የሚጠቀሙበትን የቆጠራ ክፈፍ ይገልጻል።

የዳሲ እና ሉዊስ የዘዴው ቅርጽ በሲትሬት የጨው መፍትሔ ውስጥ 1.0 በመቶ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ይጠቀማል፤ ከ2 እስከ 4 እጥፍ የደም ይዘት ጋር ተቀላቅሎ፣ ስሚር ከመዘጋጀቱ በፊት በ37 C ለ15 እስከ 20 ደቂቃዎች ይቆያል። በ2026 የNMB ማዋሃድ ጥናት እንደተዘገበው፣ ለCLSI H44 አሠራር በቅርቡ የተተገበረ የማዋሃድ ዘዴ በpH 7.4 ባለ ፎስፌት ባፈር የጨው መፍትሔ ውስጥ ዝቅተኛ ክምችት ያለውን 0.1 በመቶ መፍትሔ ተጠቅሟል፣ በ20 C ለ10 ደቂቃዎች አቆይቷል፣ ፊክሴሽንም አላደረገም።

የቆጠራ ደንቦቹ በሁሉም የዘዴው ቅርጾች ተመሳሳይ ናቸው። አንድ ሕዋስ ቢያንስ ሁለት በሰማያዊ የተቀለሙ፣ እርስ በርሳቸው የተለዩ ቅንጣቶች ወይም የክር ክፍሎች ሲኖሩት እንደ ሬቲኩሎሳይት ይቁጠሩት፤ ይህም ለብቻው ያለን የማቅለሚያ ዝቃጭ ከቆጠራው ያስወጣል። በመደበኛ ሥራ ቢያንስ 1,000 ቀይ የደም ሕዋሳትን ይቁጠሩ፣ ሬቲኩሎሳይቶችንም በመቶኛ ይግለጹ። መቶኛው ዝቅተኛ ሲሆን፣ የስታቲስቲክስ መስፈርቶች ብዙ ሕዋሳት እንዲቆጠሩ ይጠይቃሉ። በDe Gruyter ያለው የCLSI H44 ግምገማ ውስጥ፣ የCLSI H44 ዘዴ ግምገማ የሬቲኩሎሳይት መጠን ወደ 1 በመቶ ሲሆን፣ የቆጠራ ልዩነትን ወደ 5 በመቶ ለማምጣት በግምት 4,400 ሕዋሳት እንደሚያስፈልጉ ይጠቅሳል። የሚለር የዓይን ሌንስ ዲስክ ብዙ ሕዋሳትን መቁጠር በተግባር እንዲቻል ያደርጋል። ዝቃጩ በሕዋስ ውስጥ ያሉ ቅንጣታዊ አካላትን ስለሚመስል፣ ማቅለሚያውን ያጣሩ ወይም አዲስ ያዘጋጁ።

በተመሳሳይ ዝግጅት ውስጥ የሃይንዝ አካላት

ያው የሱፕራቫይታል ስሚር የሃይንዝ አካላትንም ሊያሳይ ይችላል፤ እነዚህ የቀረ RNA ሳይሆኑ፣ ኦክሲዴሽን የተደረገበትና የተፈጥሮ መዋቅሩን ያጣ ሄሞግሎቢን ክምችቶች ናቸው። በአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ዝግጅቶች ውስጥ ክብ አካላት ሆነው ይታያሉ፣ ብዙ ጊዜም አንድ ብቻ ሆነው በሕዋስ ሽፋኑ አቅራቢያ ይገኛሉ፣ ከመረብና ክር መሰል ቁሱ ይልቅ ፈዛዛ ሰማያዊ ይቀለማሉ። በፊክሴሽንና በተጨማሪ ማቅለም ወቅት በደንብ ስለማይጠበቁ፣ ፊክሴሽን ያልተደረገበትን ስሚር ይመርምሩ። ያንን አሠራር በዘገበው የPMC ጥናት ውስጥ፣ በቅርቡ የተጠቀመ ፕሮቶኮል 20 ማይክሮሊትር የEDTA ደምን ከ20 ማይክሮሊትር 1 በመቶ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ጋር ቀላቅሎ ለ15 ደቂቃዎች ካቆየ በኋላ፣ ከ250 ኤሪትሮሳይቶች መካከል የሃይንዝ አካላት ያሉባቸውን ሕዋሳት ቆጥሯል።

ሁለት ልዩነቶች የተሳሳተ ንባብን ይከላከላሉ። በመጀመሪያ፣ በScienceDirect የሃይንዝ አካላት ርዕስ እንደተጠቀሰው፣ ሜቲል ቫዮሌትና ክሪስታል ቫዮሌት የሃይንዝ አካላትን ከአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ይልቅ በጠንካራ ቀለም ያቀልማሉ። አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ሬቲኩሎሳይቶችና የሃይንዝ አካላት በአንድ ላይ ሲገመገሙ ምቹ ምርጫ ነው እንጂ ለሃይንዝ አካላት ብቻ የሚያገለግል እጅግ ጠንካራው ማቅለሚያ አይደለም። ሁለተኛ፣ በአልፋ ታላሴሚያ ተሸካሚነት ውስጥ ያሉ የHbH ክምችቶች ከሱፕራቫይታል ማቅለም በኋላ በሕዋሱ ሁሉ ላይ ብዙ ትንንሽ ነጥቦችን ያሳያሉ፣ የተለመዱት የሃይንዝ አካላት ግን በቁጥር ያነሱ፣ በመጠን የበለጡ እና ብዙ ጊዜ ከሕዋስ ሽፋኑ ጋር የተያያዙ ናቸው። የማቅለሚያ ዝቃጭ ሦስተኛው አስመሳይ ነው፦ ከሕዋሳቱ የትኩረት ወለል ውጭ ይገኛል፣ ከአንድ የእይታ መስክ ወደ ሌላም ይለያያል።

ብሪሊያንት ክሬዚል ሰማያዊ ከአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ጋር ሲነጻጸር

ሁለቱም ማቅለሚያዎች ለሬቲኩሎሳይቶች የሚያገለግሉ የሱፕራቫይታል ማቅለሚያዎች ናቸው፣ የመስፈርት አወጣጡ ግን አንዱን ይመርጣል። ከዓለም አቀፍ የሄማቶሎጂ መስፈርት ማውጣት ምክር ቤት ጋር በጋራ የተዘጋጀውና በCLSI H44 መስፈርት ገጽ ላይ የተዘረዘረው የCLSI H44-A2 ሬቲኩሎሳይት ዘዴ፣ የEDTA ደምን በአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ማቅለም በእጅ የሚደረግ የንጽጽር ዘዴ እንዲሆን ይሰይማል። የተለመደው የሄማቶሎጂ ትምህርትም በመልክ ረገድ ከዚህ ጋር ይስማማል፦ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ክሮቹን በይበልጥ ጥልቅና ወጥ ቀለም ያቀልማል፣ ብሪሊያንት ክሬዚል ሰማያዊ ግን ከአንድ የምርት ዙር ወደ ሌላ እና ከአንድ ናሙና ወደ ሌላ የበለጠ ይለያያል።

ይህ ደረጃ ግን ገደቡ መገለጽ አለበት። የICSH ተንታኝ መሣሪያ ግምገማ መመሪያ በአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ በእጅ የሚደረግ የማይክሮስኮፕ ምልከታን እንደ ማጣቀሻ የንጽጽር አቀራረብ ይቀበላል፣ ነገር ግን በተመልካቹ ፍርድ የሚመረኮዝና በአንጻራዊነት ውጤቶቹ ወጥነት ያነሰ መሆኑን ይገልጻል፤ የፍሎው ሳይቶሜትሪ ማጣቀሻ አሠራሮች ባሉበት ቦታ እነሱ ይመረጣሉ። በ2022 በ100 ናሙናዎች ላይ የተደረገ ንጽጽር፣ ከተጠቀመበት ተንታኝ መሣሪያ ጋር ሲነጻጸር ብሪሊያንት ክሬዚል ሰማያዊ ከአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ ይልቅ ያነሰ ሥርዓታዊ ልዩነት እንዳለው አግኝቷል፤ ይህም በPMC የማቅለም ዘዴዎች ንጽጽር ተዘግቧል። ለተማሪዎች በማስረጃ ሊደገፍ የሚችለው ማጠቃለያ ይህ ነው፦ አዲስ ሜቲሊን ሰማያዊን መስፈርት የተቀመጠለት በእጅ የሚደረግ የንጽጽር ዘዴ አድርገው ይጠቀሙ፣ በሥራ ቦታዎ የሚጠቀሙበትን ማንኛውንም የብሪሊያንት ክሬዚል ሰማያዊ ዘዴ ከእሱ ወይም ከራስ-ሰር ዘዴ ጋር በማነጻጸር ያረጋግጡ፣ በሁለቱም ሁኔታዎች በእጅ ከሚደረግ የማይክሮስኮፕ ምልከታ የበለጠ ሰፊ የውጤት መበታተን ይጠብቁ። የቆዩ የመስፈርት ማውጣት ጽሑፎችም፣ የንግድ ማቅለሚያ ምርት ዙሮች ስለሚለያዩ፣ የተጣራ Azure B በኬሚካላዊ ንጽህና የተሻለ አማራጭ እንደሆነ ደግፈዋል፤ ይህ በማርሻል የAzure B ጥናት ውስጥ ተጠቅሷል፣ የሪኤጀንት የጥራት ደረጃ አሁንም በዘዴዎች ውይይት ውስጥ ለምን እንደሚነሳም ያብራራል።

የተለመዱ ስህተቶችን ማስወገድ

የአብዛኛዎቹ ያልተሳኩ ዝግጅቶች መነሻ አራት ስህተቶች ናቸው። ከአዲስ ሜቲሊን ሰማያዊ N ይልቅ ተራውን ሜቲሊን ሰማያዊ ማዘዝ ደካማ ማቅለምን ያስከትላል፤ ምክንያቱም ኬሚስትሪው እንጂ ቴክኒኩ አይደለም። ከምልከታ በፊት ፊክሴሽን ማድረግ ወይም ተጨማሪ ማቅለሚያ መጠቀም የሱፕራቫይታል ምልክቱን ያስወግዳል። የማቅለሚያ ዝቃጭን እንደ ቅንጣቶች መቁጠር ውጤቱን ከእውነቱ በላይ ያሳድገዋል፤ የሁለት ቅንጣት ደንብና የተጣራ ማቅለሚያ ይህን ይከላከላሉ። የሬቲኩሎሳይት መቶኛ ዝቅተኛ ሲሆን እጅግ ጥቂት ሕዋሳትን መቁጠር፣ ትክክለኛ የሚመስል ነገር ግን ሰፊ የመተማመኛ ገደቦች ያሉትን ቁጥር ያስገኛል። እያንዳንዱ ስህተት ተመሳሳይ መገለጫ አለው፦ የማይክሮስኮፕ ተመልካቹ፣ በሪኤጀንት ደረጃ ቀድሞ ለተወሰነው ውጤት ማይክሮስኮፑን ይወቅሳል።