ሜቲሊን ብሉ እና ኦቶፋጂ፦ AMPK፣ mTOR እና የነርቭ ሕዋስ ሙከራዎች

የሕዋስ ሙከራ እያካሄዱ ሜቲሊን ብሉ እንደጨመሩና በብሎት ምርመራዎ ላይ LC3-II የተባለ የፕሮቲን ባንድ ይበልጥ ጥቁር እንደሆነ እንዳዩ ያስቡ። ውህዱ «ኦቶፋጂን ያጠናክራል» ብሎ ለማወጅና ወደ ቀጣዩ ለመሄድ ሊፈትን ይችላል። ያ ትርጓሜ ግን ያለጊዜው ነው። ይበልጥ ጥቁር የሆነ የLC3-II ባንድ ሕዋሱ ተጨማሪ የጽዳት ቬሲክሎችን እየፈጠረ መሆኑን ሊያመለክት ይችላል፤ ወይም የማስወገድ ደረጃው በመዘጋቱ ቬሲክሎቹ እየተከማቹ መሆናቸውን ሊያመለክት ይችላል። ሁለቱ ትርጓሜዎች ወደ ተቃራኒ አቅጣጫዎች ይጠቁማሉ፤ ሜቲሊን ብሉን በነርቭ ሕዋሳት ላይ የሚመለከቱ ጽሑፎችም ለሁለቱም ዓይነት ማስረጃዎች ምሳሌዎችን ይዘዋል። ይህ ጽሑፍ በእውነት ምን እንደተለካ፣ እያንዳንዱን መለኪያ ሙከራ በመመርመር ያብራራል።

እዚህ የተጠናው ዓይነት የሆነው ማክሮኦቶፋጂ፣ ሕዋሱ ቁሳቁሶችን በጅምላ እንደገና የሚጠቀምበት ሂደት ነው። ፋጎፎር የተባለ በሽፋን የተሠራ ከረጢት ባረጁ ፕሮቲኖችና ኦርጋኔሎች ዙሪያ ይስፋፋል፣ ተዘግቶ ኦቶፋጎሶም ይሆናል፣ ከላይሶሶም ጋር ይዋሃዳል፣ ከዚያም ይዘቱ ተፈርሶ እንደገና ለመጠቀም ይለቀቃል። የነርቭ ሕዋሳት ስለማይከፈሉና የተጎዱ ክፍሎችን በመከፈል መጠናቸውን ማሳነስ ስለማይችሉ፣ በዚህ መደበኛ ሂደት ላይ ይመካሉ። እንደገና የመጠቀም ሂደቱ ሲቆም ቆሻሻ ይከማቻል። ሲሠራ ደግሞ ሕዋሱ በጫና ወቅት የግንባታ ቁሳቁሶቹን መልሶ ያገኛል።

አንድ የሂፖካምፐስ ሙከራ ያሳየው

ዋናው የማነሳሳት ጥናት ሴረም በማሳጣት ለ24 ሰዓታት ጫና የተፈጠረባቸውን HT22 የአይጥ ሂፖካምፐስ ሕዋሳት ተጠቅሟል። ይህ ሁኔታ የእድገት አስተዋጽኦ ያላቸውን ንጥረ ነገሮችና ሕዋስን የሚደግፉ ምልክቶችን በማስወገድ፣ አፖፕቶሲስንም ኦቶፋጂንም ያነሳሳል። ተመራማሪዎቹ እንደዘገቡት፣ ሜቲሊን ብሉ በመጠኑ ላይ በተመሠረተ መልኩ የሕዋስ ሞትን ቀንሷል፤ ይህ ጥበቃም ከማክሮኦቶፋጂ ምልክቶች ጋር አብሮ ታይቷል።

የጠቋሚዎቹ ተከታታይ ማስረጃ ግልጽ ነበር። ወደ 20 nM ሜቲሊን ብሉ አካባቢ ሲደርስ፣ በሕዋሱ ውስጥ ተበትኖ የነበረው የLC3B ማቅለሚያ ምልክት በሕዋስ ኒውክሊየስ ዙሪያ ወዳሉ ነጥብ መሰል ስብስቦች መሰባሰብ ጀመረ፤ እጅግ ጠንካራው የLC3-I እና LC3-II ምላሽ ደግሞ በ1 μM አካባቢ ታየ። LC3B-I እና LC3B-II ሁለቱም በመጠንና በጊዜ ላይ በተመሠረተ መልኩ ጨመሩ። ዋናው ነገር፣ ቡድኑ ከአንድ የተወሰነ ጊዜ የLC3 ብሎት ምርመራ አንድ ደረጃ ወደፊት መሄዱ ነበር። በላይሶሶም የሚካሄደውን ማስወገድ የሚገታ 10 μM ክሎሮኩዊን ጨመሩ፤ በሜቲሊን ብሉ በተያዙ ሕዋሳት ውስጥም ከፍ ያለ LC3-II እና ሳይፈርስ የቆየ p62 አገኙ። ይህ ንድፍ ከተራ መከማቸት ይልቅ በላይሶሶም ላይ የተመሠረተ መፍረስና መተካት መኖሩን ይደግፋል። ክሎሮኩዊን አፖፕቶሲስን የሚከላከለውን ውጤት በከፊል እንደቀለበሰውም አሳዩ፤ ይህም በዚህ ሞዴል ውስጥ ጥበቃውን ከኦቶፋጂና ከላይሶሶም መንገድ ጋር ያገናኘዋል።

የምልክት ማስተላለፉ ውጤት ብዙ ጊዜ በተሳሳተ መልኩ የሚጠቀሰው ክፍል ነው። በፎስፈረሌት በተደረገ AMPK እና ከእሱ በታች ባለው ዒላማው፣ በፎስፈረሌት በተደረገ ACC የተለካው የAMPK ምልክት ማስተላለፍ፣ በ12 እና 24 ሰዓታት በመጠን ላይ በተመሠረተ መልኩ ጨመረ። በመጨረሻዎቹ 4 ሰዓታት ውስጥ በ20 μM የተጨመረው የAMPK አጋች Compound C፣ የACC ፎስፈረሌሽንንም የLC3 መነቃቃትንም ቀነሰ። በአንጻሩ፣ ፎስፈረሌት የተደረገው mTOR ሊለካ የሚችል መገታት አላሳየም። ስለዚህ፣ ጫና በተፈጠረባቸው የሂፖካምፐስ ሕዋሳት ውስጥ፣ ግኝቱ ከAMPK ጋር የተያያዘ ማነሳሳት ሲሆን፣ ያለፈበት መንገድ በmTOR ላይ ያልተመሠረተ ይመስላል። ተመሳሳይ ንድፍ በሕይወት ባሉ አይጦችም ታይቷል፤ በእነሱ ውስጥ ሜቲሊን ብሉ መጠቀም በአንጎል ኮርቴክስና በሂፖካምፐስ የማክሮኦቶፋጂ ጠቋሚዎችን አነሳስቷል።

ማነሳሳት የተጠናቀቀ ፍሰት አይደለም

እዚህ የጽንሰ ሐሳቦቹ ልዩነት በጣም አስፈላጊ ነው። ማነሳሳት ማለት በሂደቱ መጀመሪያ ያለው ሥርዓት ተጨማሪ ኦቶፋጎሶሞችን ይፈጥራል ማለት ነው። ፍሰት ማለት ይዘቱ መላውን መንገድ ያልፋል ማለት ነው፦ መከበብ፣ መብሰል፣ ከላይሶሶም ጋር መዋሃድ፣ መፍረስና እንደገና ጥቅም ላይ መዋል። የፍሰት ሙከራ ቀሪውን ጉዞ እስኪያረጋግጥ ድረስ፣ እያንዳንዱ የLC3-II ጭማሪ የማነሳሳት ማስረጃ ነው።

መደበኛው የፍሰት ሙከራ፣ እንደ ባፊሎማይሲን A1 ወይም ክሎሮኩዊን ያለ አጭር የላይሶሶም እገዳ ሲኖርና ሳይኖር LC3-II ይለካል። ሕዋሱ የተጋለጠለት ውህድ ምርቱን በእውነት የሚያፋጥን ከሆነ፣ መፍረሱን መገታት LC3-IIን የበለጠ ሊጨምረው ይገባል። የተጣመረ mCherry-GFP-LC3 ሪፖርተር ሁለተኛ የመመልከቻ አቅጣጫ ይጨምራል፦ መዋቅሮቹ ከላይሶሶም ጋር ከመዋሃዳቸው በፊት ቢጫ ሆነው ያበራሉ፣ አሲዳማነቱ የGFP ምልክትን ካጠፋ በኋላ ደግሞ ቀይ ብቻ ይሆናሉ። ስለዚህ፣ ቀይ ብቻ የሆኑ ነጥብ መሰል ስብስቦች መብዛታቸው ወደ አሲዳማ ኦቶላይሶሶሞች መሸጋገርን ይደግፋል። የp62 ፕሮቲን መቀነስ የይዘት መፍረስና መተካትን ሊያጠናክር ይችላል፤ ሆኖም የp62 ትራንስክሪፕሽን ራሱም ለጫና ምላሽ ስለሚሰጥ፣ በmRNA ደረጃ መመርመር እንዳለበት መዘንጋት የለበትም።

ከታች ያለው የማረጋገጫ ዝርዝር፣ በእነዚህ ጽሑፎች ውስጥ እያንዳንዱ መለኪያ ሙከራ ምን እንደሚለካና ብቻውን ምን ማረጋገጥ እንደማይችል ያሳያል። አንባቢዎች እነዚህን ጠቋሚዎች የሚጠቀሙ ስለ ጾምና ረጅም ዕድሜ የሚቀርቡ ክርክሮችን ጨምሮ፣ ወደፊት የሚቀርብ ማንኛውንም የማክሮኦቶፋጂ አባባል ለመመርመር ሊጠቀሙበት ይችላሉ።

ሰንጠረዡ ከሚያስወግዳቸው የአገላለጽ ወጥመዶች አንዱን ልብ ይበሉ። ፎስፈረሌት የተደረገ ACC፣ ኢንዛይማዊ እንቅስቃሴው የተገታው ቅርጽ ነው። መጨመሩ የAMPK ምላሽን ያሳያል እንጂ የACC መነቃቃትን አያሳይም።

«ማክሮኦቶፋጂን መገታት የነርቭ ሕዋስ ጥበቃውን አስቀረ» የሚለው ሐረግም ተመሳሳይ ትክክለኛነት ይፈልጋል። በHT22 ሞዴል ውስጥ፣ ይህ ማለት የኦቶፋጂና የላይሶሶም መንገድን ማስተጓጎል፣ ሴረም በተከለከለበት ሁኔታ ሜቲሊን ብሉ ሕዋሳትን በሕይወት ለማቆየት የሰጠውን ጥቅም አስወገደ ማለት ነው። ይህ በዚያ የላቦራቶሪ ሳህን ውስጥ ኦቶፋጂ አስፈላጊ ወይም አስተዋጽኦ ያለው መሆኑን ይደግፋል። ኦቶፋጂ የውህዱ ብቸኛ የጥበቃ ዘዴ መሆኑን አያረጋግጥም፣ ክሎሮኩዊን በኦቶፋጂ ብቻ እንደሚሠራም አያረጋግጥም። የምክንያትና ውጤት አባባሉን ለማጠናከር፣ ATG5፣ ATG7 ወይም ULK1ን በጄኔቲክ ዘዴ ማስተጓጎል ያስፈልጋል።

ወደ አንድ ሥርዓት የሚያመሩ ሁለት መንገዶች

ቀላል የሂደት ካርታ ይረዳል። የኃይል ጫና AMPKን ያሳድጋል፣ AMPK የULK1 ኮምፕሌክስን ያነቃቃል፣ ኦቶፋጂም ይጀምራል። የእድገት አስተዋጽኦ ያላቸው ንጥረ ነገሮችና አልሚ ንጥረ ነገሮች mTORC1ን ያሳድጋሉ፣ mTORC1 ደግሞ ULK1ን ይገታል፣ ኦቶፋጂም ሳይጀምር ይቆያል። ከULK1 በኋላ ባለው የሂደት ክፍል፣ የBeclin-1 እና VPS34 ኮምፕሌክስ የፋጎፎርን መፈጠር ይጀምራል፣ LC3-I ሊፒድ ተያይዞበት LC3-II ይሆናል፣ ኦቶፋጎሶሙ ይዘጋል፣ ከላይሶሶም ጋር ይዋሃዳል፣ ከዚያም ይዘቱ ይፈርሳል፣ p62ም ይፈርሳልና ይተካል።

ሥዕሉ እያንዳንዱን የሜቲሊን ብሉ ግኝት በዚህ ካርታ ላይ ያስቀምጣል፦ የሂፖካምፐስ ውጤቱን ከAMPK ቅርንጫፍ አጠገብ፣ የቅድመ ሕዋስ ውጤቱን ደግሞ ከmTOR ቅርንጫፍ አጠገብ።

ይህ አቀራረብ ከሁለተኛው የXie ጥናት ጋር ያለ የሚመስለውን አለመጣጣም ይፈታል። እየተባዙ ባሉ የአይጥ የነርቭ ቅድመ ሕዋሳት ውስጥ፣ ሌላ የተለየ ሙከራ 5 μM ሜቲሊን ብሉ መባዛትን እንደገታና ሕዋሳት ወደ እረፍት ሁኔታ እንዲገቡ እንዳበረታታ አግኝቷል። Ki67 አዎንታዊ የሆኑ ሕዋሳት በቀናት 1 እና 3 ቀንሰዋል፤ ወደ ነርቭ ሕዋስነት አቅጣጫ የገባው የመለየት ሂደት ግን ሳይጎዳ ቀጥሏል። በዚያ ሙከራ፣ ዘዴው የmTOR ምልክት ማስተላለፍን በመገታት ተከናውኗል፦ አጠቃላይ mTOR እና ፎስፈረሌት የተደረገ mTOR ቀንሰዋል፣ የp70S6K እና 4EBP1 ኤክስፕሬሽንም ዝቅ ብሏል፣ እንዲሁም ሳይክሊኖች E1፣ B1፣ D1 እና D2 ተቀንሰዋል። ዋነኛው የታየ ባህሪ የቅድመ ሕዋሳት የእረፍት ሁኔታ ነበር፤ ደራሲዎቹም ይህን ያገናኙት የሕዋስ እርጅና ከመዘግየት ጋር እንጂ ጫና የተፈጠረባቸውን የሂፖካምፐስ ሕዋሳት ከማዳን ጋር አልነበረም።

በሁለቱ ጽሑፎች መካከል ተቃርኖ የለም። AMPK እና mTOR እንደ ሁኔታው መረጃ የሚያዋህዱ ሥርዓቶች እንጂ ቋሚ ማብሪያና ማጥፊያዎች አይደሉም። ጫና የተፈጠረበት ነርቭ ሕዋስ መሰል ሕዋስ፣ ሊለካ የሚችል የmTOR እገዳ ሳይኖር AMPKን ሊያነቃቃ ይችላል። መከፈልን በሚያነሳሱ ንጥረ ነገሮች የሚገፋ ቅድመ ሕዋስ ደግሞ፣ በmTOR ላይ የተመሠረተውን የእድገት ሥርዓት በመገደብ ለተመሳሳዩ ውህድ ምላሽ ሊሰጥ ይችላል። የሕዋስ ዓይነት፣ የጫናው ሁኔታ፣ ክምችትና የመለኪያ ጊዜ የትኛው ቅርንጫፍ እንደሚበልጥ ይወስናሉ። የሜቲሊን ብሉ በማይቶኮንድሪያ ኃይልና በሬዶክስ ላይ የሚኖሩት ተጽዕኖዎችም በተመሳሳይ አጠቃላይ እይታ ውስጥ የሚካተቱት ለዚህ ነው። የነርቭ ሕዋስ ጥበቃ ዘዴዎችን የሚመለከት የግምገማ ጽሑፍ እንደሚገልጸው፣ ውህዱ እንደ አማራጭ ኤሌክትሮን ተሸካሚ ይሠራል፣ ኦክሲዴሽንንና አፖፕቶሲስን የሚከላከሉ የምልክት መንገዶችን ያነቃቃል፣ MAO እና NOSን ይገታል፣ እንዲሁም በአዲስ ማይቶኮንድሪያ መፈጠርና በኦቶፋጂ በኩል ከማይቶኮንድሪያ እድሳት ጋር ይገናኛል። ኦቶፋጂ ብዙ ተጽዕኖዎች ካሉት ባህሪያት አንዱ ቅርንጫፍ ነው እንጂ ሙሉው ታሪክ አይደለም።

ሙከራዎቹ የማያሳዩት

ሴረም ማሳጣት፣ በላቦራቶሪ ሳህን ውስጥ የሕዋስ ድጋፍና የሜታቦሊዝም ጫናን ይወክላል። መላው ሕያው አካል የሚጾምበትን ሁኔታ አይወክልም፦ ግሉኮስ፣ አሚኖ አሲዶችና ጨዎች በመሠረታዊው ማሳደጊያ ፈሳሽ ውስጥ ይቀራሉ፣ ምግብ የመመገብ ባህሪም የለም። ከ20 nM እስከ 5 μM ያሉ የሕዋስ ማሳደጊያ ክምችቶችን በቀላል ስሌት ወደ ሰው የመጠቀሚያ መጠኖች መቀየር አይቻልም፤ ምክንያቱም መወሰድ፣ ከፕሮቲን ጋር መያያዝ፣ የሬዶክስ ሁኔታ፣ ሜታቦሊዝም፣ በሕብረ ሕዋስ ውስጥ መከማቸትና የተጋላጭነት ጊዜ ሁሉም ይለያያሉ።

ሜቲሊን ብሉ በታካሚዎች ውስጥ የኦቶፋጂ ፍሰትን እንደሚያነሳሳ ለማሳየት የተዘጋጀ የሰው ሙከራ የለም። የአሠራር ዘዴው ማስረጃ እስካሁን በሕዋሳት፣ ከአካል ውጭ በተወሰዱ ሕብረ ሕዋሳት እና በእንስሳት ላይ በተሠሩ ጥናቶች የተገደበ ነው። የግምገማ ጽሑፎችም ግኝቶቹን ወደ ሰው አጠቃቀም ለማሸጋገር ያለውን ማስረጃ አሁንም እንደ ቅድመ ደረጃ ይገልጹታል። ስለዚህ፣ እነዚህ ጥናቶች ሜቲሊን ብሉ የጾምን ሁኔታ እንደሚደግም፣ በኦቶፋጂ አማካይነት የሰውን ዕድሜ እንደሚያራዝም ወይም በሰው አንጎል ውስጥ የኦቶፋጂ ፍሰትን እንደሚያጠናቅቅ አያሳዩም። ጾምን መምሰልና ረጅም ዕድሜን የሚመለከቱ አባባሎች የራሳቸው ክሊኒካዊ ማስረጃ ያስፈልጋቸዋል፤ ሜቲሊን ብሉን ለሌሎች አጠቃቀሞች በሰዎች ላይ የሚመረምሩ ሙከራዎችም በዝምድና ብቻ የኦቶፋጂ ሙከራዎች አይሆኑም። የአልሚ ንጥረ ነገር ጫናንና የረጅም ዕድሜ ሞዴሎችን የሚመለከቱ ጥናቶች ይህን ወሰን በማስታወስ መነበብ አለባቸው።

ቀጣዩን የጥናት ጽሑፍ ሲያነቡ፣ የማረጋገጫ ዝርዝሩን በቅደም ተከተል ይጠቀሙ። መጀመሪያ የትኛው ቅርንጫፍ እንደተለወጠ ይጠይቁ፦ AMPK፣ mTOR ወይስ ሁለቱም አልተለወጡም? ከዚያ የLC3 ውጤቱ ከፍሰት ሙከራ ጋር ተጣምሮ እንደቀረበ ወይም ብቻውን እንደቀረበ ይጠይቁ። ቀጥሎ፣ መንገዱን መገታት ጥቅሙን እንዳስወገደውና ይህም በየትኛው ዘዴ እንደተደረገ ያረጋግጡ። ሦስቱንም የሚመልስ ጥናት ጠንካራ የአሠራር ዘዴ አባባል ለማቅረብ በቂ መሠረት አለው። የመጀመሪያውን ብቻ የሚመልስ ጥናት ያሳየው ፈቃድ የሚሰጥ ምልክት ብቻ ነው፤ ቀሪው ጉዞ ገና አልተመረመረም።