Nuwe metileenblou en retikulosietkleuring: 'n afsonderlike kleurstof en 'n metode met lewende selle

'n Student berei 'n retikulosiettelling voor, bestel metileenblou, meng dit met bloed en sien byna niks. 'n Klasgenoot gebruik 'n bottel met die etiket nuwe metileenblou en kry duidelike blou filamente binne 'n gedeelte van die rooibloedselle. Die eerste student neem aan dat die tweede bottel varser of meer gekonsentreerd is. Dit is nie een van die twee nie. Dit bevat 'n ander molekule.

Dit is die begripsfout agter die meeste verwarring op hierdie gebied. Die naam suggereer dat nuwe metileenblou 'n verbeterde lot metileenblou is. Die chemie sê anders. Nuwe metileenblou N is 'n afsonderlike fenotiasienkleurstof met sy eie Colour Index-nommer, sy eie substitusiepatroon en sy eie gestandaardiseerde rol in hematologie. Sodra daardie onderskeid duidelik is, word die res van die metode eenvoudig: waarom die selle lewend moet wees wanneer hulle gekleur word, wat as 'n retikulosiet tel, waar Heinz-liggaampies inpas en wanneer briljante kresielblou ter sprake kom.

Die kort antwoord

Nuwe metileenblou N, die hematologiereagens, word gewoonlik geïdentifiseer as Basic Blue 24 in die PubChem-inskrywing vir nuwe metileenblou, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formule C18H22ClN3S. Gewone metileenblou is metielt ioniniumchloried, Basic Blue 9, in sy PubChem-inskrywing, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formule C16H18ClN3S. Struktureel dra nuwe metileenblou twee metielgroepe aan die ring en etielamino-sykettings waar metileenblou dimetielaminogroepe dra. Daardie verskil verander die kleurgedrag. Hematologiehandboeke beskryf gewone metileenblou as 'n relatief swak retikulosietkleurstof en nuwe metileenblou as een wat dieper en meer eenvormig kleur, 'n vergelyking wat in die ScienceDirect-onderwerp oor nuwe metileenblou saamgevat word.

Ja, nuwe metileenblou is 'n supravitale kleurstof. Supravitale kleuring beteken dat lewende selle ná verwydering uit die liggaam en vóór fiksasie gekleur word, soos omskryf in die NCBI-oorsig van supravitale kleuringsbeginsels. Beide nuwe metileenblou en briljante kresielblou behoort tot hierdie kategorie, en die CLSI-retikulosietstandaard dek nuwe metileenblou uitdruklik as 'n supravitale kleurstof. Studente groepeer dit soms saam met Romanowsky-kleuring van gefikseerde uitstrykies. Daardie denkmodel werk nie hier nie. Fikseer eers, en die metode hou op werk.

Vir lesers wat soortgelyke kleurstofname probeer onderskei, behandel metielblou teenoor metileenblou 'n ander en groter verwarring tussen 'n anioniese triarielmetaankleurstof en die kationiese fenotiasienfamilie. Die oorsig van laboratoriumkleuring plaas supravitale werk tussen metodes vir gefikseerde uitstrykies, en die gids oor bloedselmorfologie wys waar retikulosietbeoordeling in die breër differensiële telling inpas.

Een waarskuwing oor katalogusse: 'n afsonderlike sinkchloried-dubbelsoutvorm van nuwe metileenblou bestaan onder CAS 6586-05-6. 'n Metode-afdeling behoort daarom die soutvorm en verskaffer te noem, nie net die algemene naam nie.

Wat supravitale kleuring werklik doen

'n Retikulosiet is 'n jong rooibloedsel wat sy kern verloor het, maar oorblywende ribosomale RNA behou. In 'n ongekleurde nat preparaat is daardie RNA onsigbaar. Die supravitale kleurstof dring die lewende sel binne en presipiteer of aggregeer daardie RNA tot blou korrels en filamente, die retikulofilamentêre materiaal wat onder olie-immersie gesien word. Die netwerk is dus 'n produk van die kleuring, nie 'n voorafgevormde skelet wat op kleur wag nie. Dit is waarom protokolveranderlikes (kleurstofkonsentrasie, buffer, bloed-tot-kleurstofverhouding, temperatuur, tyd) net so belangrik soos die kleurstofnaam is.

Die praktiese gevolg is 'n streng volgorde van handelinge: meng eers bloed wat met 'n antistolmiddel behandel is met kleurstof, inkubeer, maak dan uitstrykies en ondersoek hulle ongefikseer en sonder teenkleuring. Fiksasie vóór kleuring, of 'n teenkleuring wat dowwe filamente verberg, vernietig die inligting waarvan die telling afhanklik is.

'n Werkbare retikulosietprotokol met nuwe metileenblou

Daar is nie 'n enkele universele formulering nie; meld dus die een wat gebruik is. Drie gedokumenteerde variante wys die omvang.

Die klassieke Brecher-tipe prosedure gebruik ongeveer 0.5 persent nuwe metileenblou met kaliumoksalaat, wat in gelyke volumes met goed gemengde EDTA-bloed gemeng word en ongeveer 10 tot 15 minute by kamertemperatuur geïnkubeer word. Ná versigtige hermenging word dun wigvormige uitstrykies voorberei, in die lug gedroog en ongefikseer onder die 100x olie-immersie-objektief ondersoek. Die NCBI-prosedure vir retikulosiettelling beskryf hierdie werksproses en die telraam wat daarmee gebruik word.

Die Dacie-en-Lewis-variant gebruik 1.0 persent nuwe metileenblou in sitraat-soutoplossing, gemeng met 2 tot 4 volumes bloed en vir 15 tot 20 minute by 37 C gehou voordat uitstrykies gemaak word. 'n Onlangse harmoniseringsimplementering vir die CLSI H44-prosedure het 'n meer verdunde 0.1 persent-oplossing in fosfaatgebufferde soutoplossing by pH 7.4 gebruik, met inkubasie by 20 C vir 10 minute en geen fiksasie nie, soos gerapporteer in die 2026 NMB-harmoniseringstudie.

Die telreëls is dieselfde vir al die variante. Tel 'n sel as 'n retikulosiet wanneer dit minstens twee afsonderlike blougekleurde korrels of filamentsegmente bevat; dit sluit geïsoleerde kleurstofneerslag uit. Tel minstens 1,000 rooibloedselle in roetinewerk en rapporteer retikulosiete as 'n persentasie. By lae persentasies vereis die statistiek meer selle. 'n Oorsig van die CLSI H44-metodologie merk op dat by ongeveer 1 persent retikulosiete sowat 4,400 selle nodig is om telvariasie tot 5 persent te verlaag, in die CLSI H44-oorsig by De Gruyter. 'n Miller-okulêrskyf maak groot tellings prakties uitvoerbaar. Filtreer die kleurstof of berei dit vars voor, want presipitaat boots korrelvormige insluitings na.

Heinz-liggaampies in dieselfde preparaat

Dieselfde supravitale uitstrykie kan ook Heinz-liggaampies aantoon, wat aggregate van geoksideerde en gedenatureerde hemoglobien eerder as oorblywende RNA is. In nuwe-metileenbloupreparate verskyn hulle as ronde liggaampies, dikwels enkel en naby die membraan, wat ligter blou as retikulofilamentêre materiaal kleur. Hulle bly swak behoue ná fiksasie en teenkleuring; ondersoek dus die ongefikseerde uitstrykie. 'n Onlangse protokol wat 20 mikroliter EDTA-bloed met 20 mikroliter van 1 persent nuwe metileenblou en 15 minute inkubasie gebruik het, het selle met Heinz-liggaampies onder 250 eritrosiete gekwantifiseer, in die PMC-studie wat daardie prosedure rapporteer.

Twee onderskeide voorkom verkeerde interpretasies. Eerstens kleur metielviolet en kristalviolet Heinz-liggaampies intenser as nuwe metileenblou, soos opgemerk in die ScienceDirect-onderwerp oor Heinz-liggaampies. Nuwe metileenblou is die gerieflike keuse wanneer retikulosiete en Heinz-liggaampies saam beoordeel word, nie die sterkste kleurstof spesifiek vir Heinz-liggaampies nie. Tweedens vorm HbH-insluitings by alfa-talassemiedraerskap talle fyn kolletjies regdeur die sel ná supravitale kleuring, terwyl klassieke Heinz-liggaampies minder, groter en dikwels met die membraan geassosieer is. Kleurstofneerslag is die derde nabootser: dit lê buite die selle se fokusvlak en wissel tussen gesigsvelde.

Briljante kresielblou teenoor nuwe metileenblou

Albei kleurstowwe is supravitale kleurstowwe vir retikulosiete, maar standaardisering bevoordeel een van hulle. Die CLSI H44-A2-retikulosietmetode, wat saam met die International Council for Standardization in Haematology ontwikkel is en op die CLSI H44-standaardblad gelys word, wys nuwe-metileenbloukleuring van EDTA-bloed as die handmatige vergelykingsmetode aan. Klassieke hematologie-onderrig stem saam oor die voorkoms: nuwe metileenblou gee dieper en meer eenvormige filamentkleuring, terwyl briljante kresielblou meer tussen lotte en monsters wissel.

Daardie status moet gekwalifiseer word. Die ICSH-riglyn vir ontledersevaluering aanvaar handmatige mikroskopie met nuwe metileenblou as 'n verwysingsbenadering vir vergelyking, maar noem dit subjektief en relatief onpresies, met vloeisitometriese verwysingsprosedures wat voorkeur geniet waar hulle beskikbaar is. 'n Vergelyking van 100 monsters in 2022 het laer sistematiese afwyking teenoor die gebruikte ontleder met briljante kresielblou as met nuwe metileenblou gevind, soos gerapporteer in die PMC-vergelyking van kleuringsmetodes. Die verdedigbare samevatting vir studente: gebruik nuwe metileenblou as die gestandaardiseerde handmatige vergelykingsmiddel, verifieer enige plaaslike briljante-kresielbloumetode daarteen of teen outomatisering, en verwag in albei gevalle groter spreiding met handmatige mikroskopie. Ouer standaardiseringsliteratuur het ook gesuiwerde Azure B as 'n chemies suiwerder alternatief voorgestaan omdat kommersiële kleurstoflotte gewissel het, in die Marshall-studie oor Azure B, wat verklaar waarom reagensgraad steeds in metodebesprekings voorkom.

Vermy die gewone foute

Vier foute is verantwoordelik vir die meeste mislukte preparate. Om gewone metileenblou in plaas van nuwe metileenblou N te bestel, lewer swak kleuring weens die chemie, nie die tegniek nie. Fiksasie of teenkleuring vóór beoordeling verwyder die supravitale sein. Om kleurstofpresipitaat as korrels te tel, verhoog die resultaat kunsmatig; die twee-korrelreël en gefiltreerde kleurstof voorkom dit. Om te min selle by lae retikulosietpersentasies te tel, lewer 'n getal wat presies lyk, maar wye vertrouensgrense het. Elke fout het dieselfde kenmerk: die mikroskopis blameer die mikroskoop vir wat die reagensstap bepaal het.