Waarom metileenblou as 'n suurvaste teenkleurstof gebruik word

'n Tegnikus ondersoek 'n sputumsmeer ná die volledige kleuringsproses. Rooi staafies staan teen 'n blou veld uit, en die verslag meld dat suurvaste basille waargeneem is. Die volgende dag toon 'n ander voorwerpglas 'n eenvormige blou veld sonder rooi staafies, en dit word as negatief vir tuberkulose gerapporteer. Een van hierdie verslae maak 'n groter aanspraak as wat die voorwerpglas ondersteun, en dit is nie die eerste een nie.

Die verwarring is begripsmatig. Die tegnikus het die blou kleurstof as deel van die opsporingschemie beskou, asof metileenblou gehelp het om die mikobakterieë te vind. Dit het nie. Teen die tyd dat metileenblou die voorwerpglas raak, is die toets reeds verby. Die kleurstof kleur slegs die agtergrond sodat die resultaat leesbaar is. Hierdie artikel verduidelik die doel van metileenblou by suurvaste kleuring, waarom dit blou eerder as enige ander kleur is, en watter gevolgtrekkings rooi teen 'n blou agtergrond regverdig.

Die kort antwoord

Suurvaste kleuring is 'n differensiële toets wat op drie idees berus. Karbolfuksien, die primêre kleurstof, word in elke sel ingedwing, insluitend wasagtige mikobakterieë. Suur-alkohol, die ontkleuringsmiddel, verwyder die rooi kleurstof uit gewone selle, maar kan dit nie uit suurvaste selle onttrek nie. Metileenblou, die teenkleurstof, kleur dan alles waaruit die ontkleuringsmiddel die kleurstof verwyder het, sodat nie-suurvaste selle, gasheerselle en selreste blou vertoon terwyl suurvaste basille rooi bly. Die teenkleurstof verskaf kontras. Dit speel geen rol in die chemie wat 'n sel suurvas maak nie.

Wat elke stap doen

Die diagram hieronder toon die verdeling van take. Lees dit van links na regs as 'n prosedure, en lees die onderste strook as 'n herinnering dat elke kleuringsgroep 'n ander vraag stel.

Indringing kom eerste. Mikobakterieë weerstaan gewone waterige kleurstowwe omdat hul selomhulsel buitengewoon hidrofobies is; daarom dwing die protokol die kleurstof in. By die Ziehl-Neelsen-metode dryf verhitting tot stoomvorming die fenolbevattende karbolfuksien deur die wasagtige wand. By die Kinyoun-koue metode word hitte deur 'n veel sterker primêre kleurstofformulering vervang, en sommige aangepaste weergawes sonder verhitting voeg oppervlakaktiewe stowwe by. Die suurvaste kleuringsprotokolle van die American Society for Microbiology dokumenteer albei formulerings langs mekaar, en die konsentrasieverskil is opvallend: ongeveer 0.3 g basiese fuksien per 100 mL vir die verhitte metode teenoor sowat 4 g vir die koue metode.

Differensiasie kom tweede. Suur-alkohol, gewoonlik 3 mL gekonsentreerde soutsuur in 97 mL etanol van 95 persent, was die rooi kleurstof uit elke sel waarvan die wand geen besondere weerstand bied nie. Selle met 'n ongeskonde mikobakteriële lipiedomhulsel behou die kleurstof. Dit is die stap waarop die hele metode berus, en die stap wat die sensitiefste vir tegniek is, soos hieronder bespreek.

Kontras kom laaste. Die voorwerpglas bevat nou rooi suurvaste selle teen 'n byna kleurlose agtergrond van ontkleurde selle. Metileenblou teen 0.3 persent w/v maak daardie agtergrond weer sigbaar in 'n kleur wat so sterk moontlik met rooi kontrasteer. Teenkleuring is kort, gewoonlik 20 tot 30 sekondes by die verhitte metode en tot 'n paar minute by sommige variante van die koue metode. Die tydsduur hang van die protokol af, eerder as van 'n eienskap van die kleurstof self.

Waarom hierdie kleurstof, en waarom blou

Metileenblou is 'n kationiese basiese kleurstof, wat beteken dat sy gekleurde ioon 'n positiewe lading dra en aan die negatief gelaaide oppervlaktes van ontkleurde bakterieë, gasheerselle en selreste bind. OpenStax Mikrobiologie beskryf hierdie ladingsbeginsel as die algemene grondslag van basiese kleurstowwe. Metileenblou is egter nie hier chemies uniek nie. Kristalviolet en safranien is ook basiese kleurstowwe. Die keuse is opties, nie chemies nie.

Rooi staafies het 'n agtergrond in 'n kontrasterende kleur nodig, en blou bied die nuttigste kontras met rooi vir helderveldmikroskopie. Safranien sou 'n swak teenkleurstof wees omdat die pienkrooi eindkleur te na aan die behoue karbolfuksien lê, wat juis die onderskeid wat die prosedure geskep het, uitwis. Kristalviolet sou 'n donker violet agtergrond gee wat met dun rooi basille om aandag meeding. Die sterkste bewys dat die taak kontras eerder as chemie is, is vervanging: groen teenkleurstowwe soos malachietgroen en briljantgroen word in sommige veeartsenykundige en aangepaste protokolle gebruik, en die toets werk steeds, omdat enige duidelik onderskeibare kleur dieselfde taak verrig.

Twee praktiese gevolgtrekkings volg hieruit. Eerstens spesifiseer die standaardresep geen pH-aanpassing nie; moenie hierdie gewone waterige oplossing van 0.3 persent verwar met alkaliese formulerings soos Loeffler se metileenblou, wat by 'n ander kleuringsbeginsel hoort nie. Tweedens is oormatige kleuring nadelig. Histologieliteratuur waarsku spesifiek dat 'n te digte blou agtergrond yl verspreide basille kan verberg; om die voorwerpglas langer met kleurstof te bedek as wat die protokol toelaat, verminder dus leesbaarheid sonder enige voordeel.

Die wandchemie wat die toets moontlik maak

Die rede waarom suur-alkohol onderskei, lê in die mikobakteriële omhulsel. Die strukturele kern daarvan is die mikoliel-arabinogalaktaan-peptidoglikaan-kompleks: peptidoglikaan wat aan arabinogalaktaan gekoppel is, waarvan die buitenste punte mikolsure met baie lang kettings dra. Dit vorm 'n lipiedryke buitenste mikomembraan met buitengewoon lae deurlaatbaarheid. Die oorsig van die mikobakteriële buitenste membraan beskryf hierdie struktuur in besonderhede. Die versperring werk in albei rigtings. Dit weerstaan die indringing van kleurstof, en daarom vereis indringing hitte of 'n sterker primêre kleurstof. Dit weerstaan ook die onttrekking van kleurstof, en daarom kan suur-alkohol nie karbolfuksien verwyder nadat dit binnegedring het nie. Gewone bakterieë het nie hierdie omhulsel nie en verloor die kleurstof. Suurvastheid word dus die beste verstaan as 'n lipiedversperringsverskynsel, nie as fuksien wat chemies aan mikolsuur bind nie.

Hierdie chemie verklaar ook 'n algemene raaisel: mikobakterieë kleur swak en onvoorspelbaar met die Gram-metode, en verskyn soms as dowwe, kraalagtige vorms of ongekleurde spookvorms. Hul hidrofobiese wand beperk die indringing van kristalviolet. Suurvaste kleuring is nie 'n aangepaste Gram-kleuring nie. Dit is 'n ander differensiële beginsel wat op 'n ander wandeienskap berus, soos die vergelyking van eenvoudige kleuring met Gram-kleuring vir die ander twee metodes toon.

Drie metodes, drie vrae

Vir die breër groep bakteriële metodes met een kleurstof, sien die mikroskopiese kleuringsatlas.

Wat rooi teen 'n blou agtergrond nie kan bewys nie

Rooi staafies beteken dat die organismes karbolfuksien tydens blootstelling aan suur-alkohol behou het. Daardie bevinding stem met Mycobacterium tuberculosis ooreen, maar die CDC se riglyne vir tuberkulosediagnose meld uitdruklik dat ander mikobakterieë ook suurvas is. Spesie-identifikasie vereis dus kweek en nukleïensuurtoetse, nie kleur nie.

Tegniekfoute kom hoofsaaklik by die twee wasstappe voor. Onvoldoende ontkleuring laat agtergrondmateriaal rooi en kan tot vals positiewe interpretasies lei. Oormatige ontkleuring verwyder primêre kleurstof wat swak behou word en dra tot vals negatiewe resultate by. 'n Teenkleurstof wat te swaar aangewend word, verberg yl verspreide basille in blou. Dik smere, neergeslane reagense en besmette spoelwater voeg hul eie artefakte by.

Sensitiwiteit word deur die hoeveelheid organismes beperk, ongeag hoe foutloos die tegniek is. Konvensionele smeermikroskopie vereis ongeveer 5,000 tot 10,000 basille per milliliter sputum, en ouer CDC-oorsigte van die bewyse het smeersensitiwiteit op sowat 45 tot 80 persent gestel onder longtuberkulosegevalle wat deur kweek bevestig is. 'n Negatiewe smeer sluit dus nooit tuberkulose uit nie. Huidige CDC-riglyne vereis steeds kweek saam met elke smeer en beveel nukleïensuuramplifikasietoetsing op minstens een respiratoriese monster aan wanneer longtuberkulose oorweeg word en die resultaat die hantering van die pasiënt sou verander.

Praktiese werk vereis gemagtigde protokolle

Onderrigbeskrywings, insluitend hierdie artikel, magtig nie kliniese werk nie. Volg vir praktiese laboratoriumwerk die laboratorium se gevalideerde standaardbedryfsprosedure wat met huidige CDC-, APHL- of CLSI-dokumente strook; die CDC-verwysing vir suurvaste kleuring in sy Stacks-argief toon hoe sulke prosedures reagense en resultaatinterpretasie spesifiseer. Werk met tuberkulosemonsters vereis inperking: smere word in 'n biologiese veiligheidskabinet voorberei omdat die voorbereiding aërosols en spatsels veroorsaak. Die CDC se riglyne vir laboratoriumveiligheid verklaar dat selfs hittegefikseerde smere lewensvatbare tuberkelbasille kan bevat en steeds as besmet hanteer moet word. Die inskrywing in die CDC se Public Health Image Library oor 'n karbolfuksien- en metileenblousmeer wat vir M. leprae ondersoek is is 'n nuttige herinnering dat die metode se toepassings verder as tuberkulose strek: dieselfde rooi-op-blou-kontras word gebruik waar ook al na suurvaste organismes gesoek word, en 'n noukeurig bepaalde negatiewe bevinding is op sigself 'n resultaat wat die moeite werd is om aan te teken.

Die beoordeling van die voltooide voorwerpglas

Die teenkleurstof verdien sy plek tydens sifting. 'n Mikroskopis wat by lae vergroting soek, gebruik eers die blou agtergrond om die gehalte van die smeer te beoordeel: eweredige selverspreiding, ongeskonde gasheerselle om op te fokus, en geen swaar neerslag nie. Rooi kandidaat-organismes trek dan juis die aandag omdat niks anders op die voorwerpglas rooi is nie. Bevestiging vind onder olie-immersie plaas, waar werklike basille die verwagte dun, soms effens geboë of kraalagtige staafies toon, eerder as eenvormige kleurstofreste.

Agtergrondkleuring bepaal ook die bewoording van die verslag. 'n Voorwerpglas met rooi basille word gerapporteer as suurvaste basille waargeneem, dikwels met 'n semikwantitatiewe gradering volgens die laboratorium se skaal. 'n Voorwerpglas sonder rooi organismes word gerapporteer as geen suurvaste basille waargeneem nie, nooit as negatief vir tuberkulose nie. Die onderskeid is belangrik omdat die blou veld bewys dat die kleuring gewerk het, selle teenkleurstof opgeneem het en die optika voldoende was, maar niks sê oor organismes onder die opsporingsgrens nie. 'n Leë blou veld is 'n geldige resultaat oor die voorwerpglas, nie 'n uitspraak oor die pasiënt nie.

Onthou die verdeling van take, en die verslae skryf hulself. Karbolfuksien spoor kandidaat-organismes op. Suur-alkohol voer die toets uit. Metileenblou maak slegs die antwoord leesbaar: rooi het die kleurstof ondanks die suur behou; blou het dit verloor. Alles anders—spesie, hoeveelheid organismes en kliniese betekenis—kom uit werk buite die voorwerpglas.