Artikel
Metileenblou en stikstofmonoksied: NOS, cGMP en vaskulêre seinering
Die vraag klink eenvoudig: inhibeer metileenblou stikstofmonoksied? In die laboratorium verdeel die antwoord in vier afsonderlike vrae, elk met ’n ander eksperimentele toets. Verwarring tussen hulle is die hoofrede waarom skryfwerk oor metileenblou en stikstofmonoksied selfversekerd maar vaag voorkom.
Dink aan die stikstofmonoksiedsein as ’n ketting met vier skakels. ’n Geen word getranskribeer om stikstofmonoksiedsintase te maak. Die ensiem skakel arginien om na stikstofmonoksied. Die gas diffundeer na sy teiken voordat dit met iets anders reageer. Oplosbare guanilaatsiklase bespeur dit en maak sikliese GMP. Effekte van metileenblou is by elke skakel gepubliseer, maar die bewyse kom uit verskillende preparate, verskillende konsentrasies en verskillende isovorme. ’n Resultaat by een skakel bewys nie werking by ’n ander nie.
Die kanonieke ketting, eenvoudig gestel
In ’n bloedvatwand verloop die standaardvolgorde soos volg. ’n Stimulus werk op ’n endoteelsel in. Endoteelstikstofmonoksiedsintase, genaamd eNOS of NOS3, maak ’n klein puls stikstofmonoksied. Die gas diffundeer na die aangrensende gladdespiersel, bind aan die heem met gereduseerde yster van oplosbare guanilaatsiklase, en versnel die omskakeling van GTP na sikliese GMP. Sikliese GMP aktiveer proteïenkinase G, kalsiumhantering verander, en die spier ontspan.
Daar is ’n tweede ketting wat afsonderlik beskou moet word. Tydens infeksie of blootstelling aan sitokiene transkribeer selle ’n ander ensiem, induseerbare stikstofmonoksiedsintase of iNOS, ook NOS2 genoem. Dit lewer groter en langer aanhoudende stikstofmonoksiedvloede as eNOS. ’n Derde isovorm, neuronale NOS of nNOS, hoort by nog ’n ander konteks. Wanneer ’n artikel stikstofmonoksiedsintase noem sonder om die isovorm te spesifiseer, stop en kyk watter een gemeet is. Die oorsig van hoe metileenblou elektrone oordra, maak dieselfde punt oor redoksteikens in die algemeen: die oordragstelsel doen niks op sy eie nie, en die vennoot aan elke kant bepaal die uitkoms.
Gemete sikliese GMP is ook ’n geïntegreerde uitleeswaarde, nie ’n direkte ensiemtoets nie. Die vlak daarvan weerspieël sintese deur siklase minus afbraak deur fosfodiësterases, veral PDE5 in vaskulêre gladdespier. ’n Daling in sikliese GMP beteken dus dat minder sein die detektor bereik het. Dit identifiseer nie op sigself die skakel wat gefaal het nie.
Skakel 1: minder iNOS-ensiem word gemaak
In muismakrofage wat met bakteriële lipopolisakkaried, interferon gamma, of albei gestimuleer is, het metileenblou die verwagte styging in iNOS-proteïen voorkom en iNOS-boodskapper-RNA sterk onderdruk in die makrofaagtranskripsie-eksperimente. Die insiggewende deel is wat nie verander het nie. Afbraak van die inhibeerder I kappa B alfa, fosforilering van NF kappa B en STAT1, en beweging van dié faktore na die kern het grotendeels onveranderd gebly. Wat afgeneem het, was hul binding aan DNA, soos bevestig deur chromatienimmunopresipitasie wat verminderde besetting van die iNOS-promotor getoon het.
Dit is ’n geenregulerende effek stroomop van ensiemhoeveelheid, nie akute blokkering van ’n bestaande ensiem nie. Dit hoort by inflammatoriese seinering, waar transkripsiefaktore aan ’n promotor moet bind voordat proteïen verskyn. Dit sê niks direk oor konstitutiewe eNOS in ’n rustende bloedvat nie, en behoort in daardie terme beskryf te word.
Skakel 2: die bestaande NOS-ensiem werk stadiger
’n Studie in rotte het ’n ander vlak getoets. Bewuste manlike rotte het lipopolisakkaried intraveneus ontvang, en drie uur later óf soutoplossing óf metileenblou teen 3 mg per kg intraveneus. Stikstofmonoksiedsintase-aktiwiteit in die mediale basale hipotalamus is gemeet deur die omskakeling van gemerkte arginien na sitrullien in die studie oor hipotalamiese NOS-aktiwiteit. Stres saam met slegs soutoplossing het ’n mate van kalsiumonafhanklike aktiwiteit geïnduseer, en lipopolisakkaried het dit tot ongeveer tien keer die kontrolevlak verhoog. Metileenblou het albei geïnduseerde komponente uitgeskakel. Kalsiumafhanklike konstitutiewe aktiwiteit het nie in daardie weefsel by daardie dosis en tydstip verander nie.
Lees daardie resultaat presies soos dit geskryf staan: onderdrukking van gemete iNOS-tipe aktiwiteit onder daardie toestande. Dit is nie ’n meting van geenuitdrukking nie, en dit bewys nie blywende selektiwiteit vir iNOS bo eNOS of nNOS nie. Werk met gesuiwerde ensieme beklemtoon hierdie voorbehoud. In direkte toetse van gesuiwerde stikstofmonoksiedsintase het metileenblou sitrullienvorming volledig geblokkeer by 30 micromolar, met ’n konsentrasie vir halfmaksimale inhibisie van ongeveer 5.3 micromolar sonder superoksieddismutase en 9.2 micromolar daarmee, soos gerapporteer in die vergelyking van gesuiwerde NOS en guanilaatsiklase. ’n Afsonderlike studie van gesuiwerde nNOS het oksidasie van ensiemgebonde heem geïmpliseer. Die praktiese les is dat direkte NOS-inhibisie werklik in geïsoleerde stelsels voorkom, maar die hipotalamusresultaat kan nie uitgebrei word tot ’n algemene bewering dat metileenblou alle konstitutiewe NOS oral onaangetas laat nie.
Skakel 3: stikstofmonoksied gaan verlore voordat dit aankom
Die duidelikste demonstrasie dat iets anders as ensiemblokkering ’n daling in sikliese GMP kan verklaar, kom uit gekweekte gladdespierselle van konynlongslagare. Die proefontwerp het endogene NOS heeltemal omseil deur stikstofmonoksiedskenkers direk by te voeg, en daarna getoets of metileenblou steeds die sikliese-GMP-respons onderdruk het in die studie oor superoksied in vaskulêre gladdespier.
Drie skenkers is van 1 tot 100 micromolar getoets: S-nitroso-L-sisteïen, natriumnitroprussied en ’n stabiele gedeamineerde analoog genaamd MPANO. Almal het sikliese GMP met ongeveer 1.5 tot 12 keer verhoog. Metileenblou teen 10 micromolar het die eerste twee met 51 tot 100 persent geïnhibeer en die MPANO-respons onveranderd gelaat. As metileenblou bloot die siklase se katalitiese plek geblokkeer het, sou daardie skenkerselektiwiteit moeilik verklaarbaar wees, aangesien al drie op dieselfde stroomaf-ensiem uitloop.
Drie kontroletoetse het die meganisme toe aan superoksied toegeskryf. Eerstens het die opwekking van ekstrasellulêre superoksied met xantien plus xantienoksidase dieselfde patroon nageboots: CYSNO en nitroprussied is geblokkeer, terwyl MPANO onaangetas gebly het. Tweedens het metileenblou dosis- en tydafhanklike superoksiedproduksie deur die gladdespierselle veroorsaak, gemeet deur sitochroom c-reduksie. Derdens het superoksieddismutase die inhibisie volledig voorkom, terwyl katalase dit nie gedoen het nie. Dit dui op superoksied eerder as waterstofperoksied as die direk betrokke chemiese spesie in daardie preparaat.
Die ko-kultuurweergawe van die eksperiment is die moeite werd om te beskryf, omdat dit die effek ruimtelik plaas. Endoteelselle op dekglasies is kortstondig saam met gladdespierselle gekweek, sodat endoteelfaktor wat onder basale toestande vrygestel is, sikliese GMP in gladdespier drie- tot agtvoudig verhoog het. Voorbehandeling van enigeen van die twee kompartemente met metileenblou het daardie sein verminder, en superoksieddismutase het die effek van endoteelvoorbehandeling gedeeltelik omgekeer. Met ander woorde, metileenblou hoef glad nie binne die gladdespierdetektorsel te werk nie. Dit kan die sein verminder deur die boodskapper onderweg te verwyder. Die gids vir die lees van metileenblounavorsing behandel dit as ’n algemene reël: noem die kompartement waarin die ingreep plaasgevind het voordat jy ’n molekulêre teiken noem.
Dit sou verkeerd wees om dit NOS-inhibisie te noem. Geen sintasestap was nodig vir die skenkers om te werk nie, maar die sein het steeds afgeneem.
Skakel 4: die detektor self reageer minder
Direkte effekte op oplosbare guanilaatsiklase bestaan, maar die konsentrasies maak saak. In die vergelyking van gesuiwerde ensieme wat hierbo aangehaal is, het stikstofmonoksiedgestimuleerde siklase ongeveer 60 micromolar metileenblou vir halfmaksimale inhibisie nodig gehad, teenoor NOS se halfmaksimale inhibisie by ongeveer 5 tot 9 micromolar, en selfs 1 millimolar het slegs gedeeltelike maksimale blokkering veroorsaak. Dit is ongeveer ’n ses- tot elfvoudige verskil. ’n Seleksperiment by ’n lae mikromolêre konsentrasie wat sikliese GMP verlaag, kan dus nie op grond van die sikliese-GMP-waarde alleen as selektiewe siklase-inhibisie bestempel word nie.
’n Latere redoksstudie het ’n tweede voorbehoud bygevoeg: metileenblou het stikstofmonoksiedgeaktiveerde siklase gedeaktiveer deur ’n meganisme wat verskil van eenvoudige oksidasie van die heemyster deur lug. Die detektor kan dus benadeel word, maar die chemie is nog nie uitgeklaar nie, en die konsentrasieverskil beteken dat superoksied- en NOS-effekte eers by lae mikromolêre blootstellings uitgesluit behoort te word. Dit is ook waar kontrole vir fosfodiësterase-aktiwiteit hoort. Tensy afbraak gemeet of geblokkeer is, is verminderde ophoping van sikliese GMP verenigbaar met minder sintese, vinniger afbraak, of albei.
Waarom dit nie tot een bloeddrukbewering herlei kan word nie
Elke skakel is in ’n ander stelsel vasgestel. Makrofaagtranskripsie is nie hipotalamiese ensiemaktiwiteit nie. Hipotalamiese aktiwiteit ná lipopolisakkaried is nie rustende endoteeltonus nie. Endoteelfaktor wat onder basale toestande in ko-kultuur vrygestel word, is nie agonisgestimuleerde vasodilatasie nie. Gekweekte longslagaarselle by 10 micromolar metileenblou is nie ’n menslike bloedsomloop nie. Om hulle saam te vat in ’n stelling soos dat metileenblou bloeddruk verhoog deur stikstofmonoksied te blokkeer, verwerp juis die onderskeide wat die kontroletoetse ontwerp is om te behou.
Drie kontrolepunte hou die uiteensetting eerlik. Noem eerstens die isovorm: eNOS vir rustende vaskulêre tonus, iNOS vir geïnduseerde inflammatoriese vloei, en nNOS vir neuronale kontekste en sommige kontekste met gesuiwerde ensieme. Noem tweedens hoe die stikstofmonoksiedsein gelewer word: endogene sintese, basale endoteelvrystelling, of ’n spesifieke skenker soos CYSNO, nitroprussied of MPANO, aangesien die stabiele skenker metileenblou weerstaan het terwyl die labiele skenkers dit nie gedoen het nie. Noem derdens die konsentrasie en die omkering: omkering deur superoksieddismutase impliseer superoksied, mislukking van katalase tel teen waterstofperoksied in daardie preparaat, nabootsing deur xantienoksidase toon dat dit voldoende is, en toetse met gesuiwerde ensieme onderskei direkte effekte op katalise van verliese onderweg.
Die kort samevatting is dit. Metileenblou word beter beskou as ’n middel wat stikstofmonoksied-na-sikliese-GMP-seinering op verskeie plekke versteur, eerder as ’n selektiewe siklaseblokkeerder. Afhangend van die preparaat en konsentrasie kan dit transkripsiefaktorbinding by iNOS verminder, NOS-ensieme direk inhibeer, stikstofmonoksiedbeskikbaarheid deur superoksiedopwekking verlaag, en stikstofmonoksiedgeaktiveerde siklase benadeel. Die rol van sikliese-GMP-seinering in vaskulêre studies en die vergelyking van stikstofmonoksiedskenkers wat in seltoetse gebruik word behandel elk een van daardie vertakkings in meer besonderhede, en die metodes wat gebruik word om redokseffekte van ensiemeffekte te onderskei verduidelik waarom superoksieddismutase plus katalase plus ’n kontrole met ’n stabiele skenker so dikwels in hierdie literatuur voorkom.
’n Lae sikliese-GMP-waarde ná metileenblou dui op ’n gebreekte ketting. Slegs die kontroletoetse wys watter skakel gebreek het.