Meting van metileenblou se mitochondriale effekte: suurstof, ATP en membraanpotensiaal

Gestel ’n laboratorium voeg metileenblou by mitochondria met verswakte respirasie en sien hoe suurstofverbruik styg. Die vanselfsprekende sin om te skryf, is dat die kleurstof mitochondriale funksie herstel het. Daardie sin kan verkeerd wees. Suurstofvloei, ATP-sintese en membraanpotensiaal is drie afsonderlike begrippe. Hulle deel dieselfde organel soos rugsteun, sinchronisering en deling dieselfde wolkvouer deel: verwant, maar deur verskillende reëls beheer. Verwar die een met die ander en die interpretasie misluk, selfs wanneer elke meting tegnies korrek is.

Metileenblou maak hierdie verwarring waarskynlik omdat dit deelneem aan die stelsel wat dit meet. Dit ondergaan redokssiklusse, aanvaar elektrone stroomop en skenk hulle stroomaf; dit is ’n lipofiele katioon wat in geënergiseerde mitochondria ophoop; en dit is ’n sterk blou verbinding wat lig in dieselfde bande as algemene probes absorbeer en uitstraal. ’n Enkele meetwaarde kan nie daardie las dra nie. Die betroubare patroon, soos in die mitochondriale studies uit Boedapest getoon, is om suurstofvloei plus ATP-sintesetempo plus membraanpotensiaal plus waterstofperoksiedvrystelling te meet, met kleurstofspesifieke kontroles by elke stap.

Respirometrie meet suurstofvloei, nie energie-uitset nie

Hoëresolusie-respirometrie, hetsy met ’n Oroboros Oxygraph of ’n Seahorse ekstrasellulêre vloeiontleder, rapporteer een ding: hoe vinnig suurstof gereduseer word. Dit rapporteer nie hoeveel protone per elektron gepomp is, hoeveel van die gradiënt behoue gebly het, of of ATP-sintase dit gebruik het nie.

Die terminologie maak saak. In geïsoleerde mitochondria lewer substraat sonder ADP lekrespirasie, substraat met versadigende ADP lewer oksidatiewe fosforileringskapasiteit, en titrasie met ’n ontkoppelaar lewer maksimum elektronoordragkapasiteit. In intakte selle is die Seahorse-ekwivalente basale respirasie, oligomisien-sensitiewe ATP-gekoppelde respirasie, protonlek, FCCP-gedefinieerde maksimale respirasie en rotenoon- plus antimisien-bestande niemitochondriale suurstofverbruik. Om Seahorse-uitsette Toestand 3 en Toestand 4 te noem, maak aanspraak op ’n presisie wat die preparaat nie ondersteun nie, soos die Agilent Mito Stress Test-raamwerk duidelik maak.

Metileenblou verbreek die intuïtiewe verband tussen meer suurstof en meer energie. In geïsoleerde breinmitochondria van marmotte het 100 nM tot 1 uM kleurstof die rustende suurstofverbruik met glutamaat plus malaat, suksinaat en alfa-gliserofosfaat as substrate verhoog, met ’n styging van ongeveer 64 persent met alfa-gliserofosfaat. Tog het ADP-gestimuleerde respirasie in gesonde mitochondria feitlik onveranderd gebly, volgens die studie van geïsoleerde breinmitochondria. Omdat lekrespirasie toegeneem het terwyl ADP-gestimuleerde vloei onveranderd gebly het, daal die berekende respiratoriese kontroleverhouding. Daardie daling beteken nie dat die kleurstof die mitochondria beskadig het nie. Dit beteken dat die kleurstof ’n suurstofverbruikende redokssiklus bo-op normale respirasie bygevoeg het. ’n Metileenblou-suurstofverbruikstoets wat slegs die styging rapporteer, het werklike chemie gemeet en niks oor energiebehoud gesê nie.

Die hersteleksperimente toon dieselfde gaping op ’n groter skaal. Met Kompleks I geblokkeer, het suurstofvloei ongeveer drievoudig herstel, terwyl ATP-sintese slegs ongeveer 1.5-voudig herstel het. Meer suurstof het die elektrode bereik. Minder daarvan het tot ATP-produksie bygedra. Enige aanspraak op verbeterde oksidatiewe fosforilering benodig ook die ATP-kant van die vergelyking, verkieslik uitgedruk as ’n ATP-per-suurstof-verhouding met die konvensie vir die noemer vermeld.

ATP-toetse meet sintesetempo, waarvoor inhoud nie kan instaan nie

’n ATP-toets beantwoord ’n ander vraag: hoeveel ATP per tydseenheid gegenereer word. ’n Kinetiese meting, hetsy glimwurmlusiferase-luminessensie wat oor minute gevolg word of ’n gekoppelde heksokinase- plus glukose-6-fosfaatdehidrogenase-toets wat by 340 nm afgelees word, lewer ’n tempo. ’n Enkele eindpuntmeting van totale ATP lewer inhoud, wat sintese minus verbruik weerspieël en op sigself min oor oksidatiewe fosforilering vertel.

Die Boedapest-groep het die gekoppelde ensiematiese metode met onderdrukte adenilaatkinase gebruik en bevind dat metileenblou teen 1 tot 2 uM ATP-produksie in rotenoonbehandelde en antimisienbehandelde mitochondria matig maar beduidend verhoog het. Dit is werklike herstel, en dit is gedeeltelik. Die TEGDMA-toksisiteitstudie het dieselfde soort antwoord in ’n ander model gelewer: 5 mM van die tandheelkundige monomeer TEGDMA het Kompleks I-gekoppelde respirasie van ongeveer 286 tot 28 vloei-eenhede laat ineenstort, en 2 uM kleurstof het dit tot ongeveer 86 herstel.

Twee kontroles is ononderhandelbaar met ’n gekleurde redoksverbinding. Gebruik eerstens oligomisien om vas te stel hoeveel van die gemete ATP-sintese van ATP-sintase afhanklik is. Voer tweedens ’n selvrye herwinningstoets met ’n bekende ATP-byvoeging uit, met die volledige reagens en presies die kleurstofkonsentrasies wat gebruik word: minstens 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM en 2 uM. Die kleurstof kan uitgestraalde lig absorbeer, die verslaggewerensiem inhibeer of die reagens se redokschemie verander, en algemene riglyne vir lusiferasetoetse beveel biochemiese teentoetse vir presies hierdie soort interferensie aan. Moenie aanvaar dat 1 uM artefakvry is omdat fluoressensiedemping gewoonlik by hoër konsentrasies erger is nie.

Membraanpotensiaalprobes meet kleurstofverspreiding, nie vloei nie

Safranien O, TMRM en TMRE, rhodamien 123 en JC-1 is almal membraandeurlaatbare katione. Hulle hoop volgens elektrochemiese ewewig in die negatief gelaaide matriks op, sodat die totale fluoressensie die potensiaal indirek rapporteer deur waar die probe geleë is. Nie een van hulle meet ATP of elektronvloei nie.

Elke probe het ’n voorkeurpreparaat. Safranien O is geskik vir geïsoleerde mitochondria en gepermeabiliseerde selle, tipies naby 2 uM met eksitasie naby 495 nm en emissie naby 585 nm. Dit werk in ’n dempingsregime waar opname die totale fluoressensie verander. TMRM en TMRE is geskik vir intakte selle by lae nanomolêre belading in ’n niedempende modus, waar depolarisasie kleurstof vrystel en mitochondriale fluoressensie afneem; by hoë belading kan die rigting van die sein deur selfdemping omkeer. JC-1 gee ’n gerieflike groen-tot-rooi-verhouding, maar is afhanklik van belading en mitochondriale massa, wat dit minder geskik vir kwantitatiewe werk maak as noukeurig gekontroleerde TMRM. Hierdie afwegings word in ’n wyd gebruikte oorsig van mitochondriale membraanpotensiaalprobes opgesom.

Metileenblou veroorsaak optiese interferensie by presies die werkskonsentrasies. Sy absorpsiebande naby 600 tot 665 nm oorvleuel met die emissie van rooi probes, dus is binnefiltereffekte, demping en absorpsie van eksitasielig almal geloofwaardige moontlikhede. Die kleurstof is ook ’n tweede lipofiele katioon waarvan die eie verspreiding verander met die potensiaal wat gemeet word. Die verweer is oortollige metings plus blanko’s: die probe alleen, die kleurstof alleen, die probe plus elke kleurstofkonsentrasie, volledige depolarisasie met FCCP as die nulverwysing, en verkieslik ’n tweede, opties onderskeibare probe. Die studie oor die omseiling van Kompleks III het daardie presedent gestel deur die herstel van membraanpotensiaal met sowel safranien O as TMRM ná inhibisie met antimisien en miksotiasool te herhaal en dieselfde kwalitatiewe herstel te verkry. Een optiese verslaggewer is ’n leidraad. Twee onafhanklike verslaggewers is bewys.

Drie preparate, drie verskillende vrae

Geïsoleerde mitochondria, gepermeabiliseerde selle en intakte selle is nie uitruilbare sensitiwiteitsinstellings op een toets nie. Hulle is verskillende konsepte met verskillende werkingsbeginsels.

Geïsoleerde mitochondria behou die elektrontransportketting, binnemembraan en matriksmasjinerie, terwyl die plasmamembraan, sitosol en netwerkargitektuur verwyder word. Daardie verwydering is juis die doel: substrate, ADP, inhibeerders en kleurstofkonsentrasies word presies gedefinieer, sodat ’n roete geïdentifiseer kan word. Die prys is die verlies van natuurlike substraattoevoer, seinwerking en aanvraag.

Gepermeabiliseerde selle hou mitochondria binne ’n groot deel van hul sellulêre argitektuur, terwyl eksogene substrate en ADP deur die oopgemaakte plasmamembraan toegelaat word. Hulle is die regte hulpmiddel om ’n defek in ’n substraatroete binne ’n sellulêre konteks te lokaliseer. Oormatige permeabilisering beskadig die buitemembraan, en sitosoliese regulering word uitgewas.

Intakte selle behou alles: die plasmamembraanversperring, sitosoliese reduseermiddels, endogene substraattransport, die mitochondriale netwerk en ATP-aanvraag. Hulle is die naaste aan fisiologie en die verste van meganisme, omdat kleurstofopname, reduksie en afsondering almal die effektiewe mitochondriale blootstelling bepaal.

Die TEGDMA-studie het doelbewus al drie vlakke gebruik: geïsoleerde breinmitochondria vir herstel van oksidasie en potensiaal deur die kleurstof, gepermeabiliseerde tandpulpstamselle hoofsaaklik om die letsel tot Kompleks I-gekoppelde substraatoksidasie te lokaliseer, en intakte stamselle vir die fisiologiese netto effek van 2 uM kleurstof op onderdrukte suurstofverbruik. Vir lesers wat mitochondriale meetwaardes tussen preparate vergelyk, gee die meegaande verduideliking van hoe metileenblou elektrone deur die respiratoriese ketting beweeg die agtergrond oor die roete, en die gids tot die lees van metileenblou-respirasiestudies dek die logika van dosis en inhibeerders.

Kontroles wat ’n redoksaktiewe kleurstof vereis

’n Stof wat redokssiklusse ondergaan, benodig ’n langer lys kontroles as ’n gewone inhibeerder, omdat chemie wat slegs deur die kleurstof veroorsaak word, biologie kan naboots.

Vir respirometrie moet ’n kamer met slegs buffer vir drywing gebruik word, asook ’n kamer met buffer plus kleurstof sonder biologiese materiaal, kleurstof plus enige ekstrasellulêre reduseermiddel wat in die toets teenwoordig is, en rotenoon plus antimisien aan die einde om niemitochondriale suurstofverbruik in intakte selle te definieer. Let daarop dat gereduseerde kleurstof heroksideer deur elektrone na suurstof oor te dra om waterstofperoksied te vorm. ’n Blanko met slegs kleurstof en geen elektronskenker nie onderskat dus die selvrye suurstofverbruik wat ontstaan sodra NADH of NADPH beskikbaar is.

Vir waterstofperoksied moet gekalibreerde Amplex UltraRed plus peperwortelperoksidase bo nieselektiewe DCFDA-kleurstowwe verkies word; verifieer met katalase en toets afhanklikheid van beligting, aangesien die kleurstof ’n fotosensitiseerder is. Die breinmitochondria-studie het bevind dat die peroksiedlas by slegs 100 nM kleurstof meer as viervoudig gestyg het terwyl verwydering vertraag het, met peroksied wat direk deur gereduseerde kleurstof gevorm is sonder ’n superoksiedtussenproduk. Besonderhede oor probekeuse en ligkontroles hoort by die meegaande stuk oor die meting van reaktiewe suurstofspesies in kleurstofeksperimente, en die breër vraag oor wanneer peroksied as ’n sein eerder as ’n las optree, word saam met sellulêre redoksbalans en aansprake oor antioksidante behandel.

Vir aansprake oor die roete moet albei Kompleks III-inhibeerderplekke getoets word: antimisien A by die Qi-plek en miksotiasool by die Qo-plek, plus ’n Kompleks IV-eindpunt met sianied. ’n Vroeëre studie van muisbreine het herstel deur die kleurstof van rotenoongeblokkeerde, maar nie antimisiengeblokkeerde, respirasie gerapporteer. Die latere studie met drie spesies het egter gedeeltelike herstel met albei inhibeerders en bewyse van direkte sitochroom c-reduksie gevind. Beskou die omseiling as versoenbaar met die nuwer data eerder as finaal bewys, aangesien kleurstofkonsentrasie, inhibeerderplek, substraattoestand en kleurstofverspreiding almal die waargenome roete verander.

Toetskeusematriks

Gebruik hierdie tabel om die meting volgens die vraag te kies, nie andersom nie.

Die minimum vir ’n oortuigende aanspraak is om dieselfde kleurstofkonsentrasies, 100 nM, 300 nM, 1 uM en 2 uM, te gebruik vir metings van suurstofvloei onder lek-, ADP-, oligomisien- en ontkoppelaartoestande, ATP-sintesetempo, membraanpotensiaal met verkieslik twee probes, en gekalibreerde peroksiedvrystelling met katalase en selvrye kontroles. Rapporteer die gekoppelde stel: suurstofvloei plus ATP-tempo plus ATP per suurstof plus potensiaal plus peroksied. Enigeen van daardie getalle op sy eie is ’n meting op soek na betekenis.