Eenvoudige kleuring met methyleenblou teenoor Gram-kleuring: wat elke metode kan bewys

’n Student berei ’n smeer voor uit ’n kultuur met die etiket E. coli, bedek dit vir een minuut met methyleenblou, spoel dit af en kyk deur die olie-immersie-objektief. Blou staafvormige selle vul die gesigsveld. Die laboratoriumverslag lui: "Gram-negatiewe staafvormige bakterieë geïdentifiseer as E. coli." Die waarneming is korrek. Die gevolgtrekking word nie deur daardie preparaat geregverdig nie.

Die fout is konseptueel, nie tegnies nie. Die student het ’n eenvoudige kleuring behandel asof dit ’n differensiële toets is. ’n Eenvoudige kleuring en ’n Gram-kleuring beantwoord verskillende vrae omdat hulle op verskillende kleuringsbeginsels berus. Die een vra: watter vorm is teenwoordig? Die ander vra: hoe reageer die selwand wanneer dit aan ’n toets onderwerp word? Verwar die twee, en ’n korrek gekleurde preparaat lei tot ’n ongegronde verslag.

Hierdie vergelyking hou die twee metodes apart, wys watter aansprake elke resultaat regverdig en beantwoord die twee vrae wat studente die meeste vra: kan methyleenblou in Gram-kleuring gebruik word, en wat toon ’n methyleenbloukleuring van E. coli werklik?

Die kort antwoord

Eenvoudige kleuring met methyleenblou kleur elke kleurbare sel dieselfde blou, en toon dus morfologie (stawe, sfere, spirale) en rangskikking (enkelselle, pare, kettings), maar niks oor die Gram-kategorie nie. Gram-kleuring voeg jodium, ’n ontkleuringsstap en ’n teenkleurstof by, en onderskei dus tussen Gram-positiewe (pers) en Gram-negatiewe (pienk of rooi) bakterieë op grond van hoe hul selomhulsels kleurstof behou. Blou stawe ná methyleenblou beteken "staafvormige selle is teenwoordig". Pienk stawe ná ’n volledige Gram-prosedure beteken "Gram-negatiewe staafvormige bakterieë is teenwoordig". Die tweede stelling is sterker omdat die prosedure ’n bykomende toets uitgevoer het.

Vir die breër groep bakteriële metodes met een kleurstof waartoe hierdie artikel behoort, sien die atlas van kleuring vir mikroskopie.

Eenvoudige kleuring: een kleurstof, een vraag

Methyleenblou is ’n basiese (kationiese) kleurstof. Die gekleurde ioon dra ’n positiewe lading en bind aan negatief gelaaide strukture in die sel, insluitend nukleïensure en suur oppervlakgroepe, sodat selle blou teen ’n ligte agtergrond vertoon. OpenStax beskryf hierdie beginsel van positiewe kleuring in sy hoofstuk oor kleuring. Die kleurstofkation self is die klein, plat fenotiasienioon wat in die chemiese verwysingsartikel oor methyleenblou uiteengesit word; die chloriedteenioon is nie vir die kleur verantwoordelik nie.

’n Standaardonderrigprotokol is doelbewus eenvoudig: maak ’n dun smeer, laat dit in die lug droog word, fikseer dit met hitte, bedek dit vir ongeveer een minuut met sowat 1% methyleenblou in water, spoel dit liggies met water af, dep dit droog en ondersoek dit met olie-immersie. ’n Onderrigprotokol van LibreTexts gee presies hierdie 1%-prosedure van een minuut, en merk op dat sommige laboratoriums die tyd verleng. Geen beitsmiddel, geen ontkleurder, geen tweede kleurstof nie. Dit is juis die punt. Met slegs een kleurstof en geen selektiewe verwydering nie, eindig elke sel wat kleurstof bind met dieselfde kleur.

By E. coli is die verwagte gesigsveld blou staafvormige selle (basille), afsonderlik of in pare of klein groepies. Die blou kom van die kleurstof. Die staafvorm kom van die organisme. Maar dié kombinasie identifiseer nie die organisme nie, want baie spesies is staafvormig en baie staafvormige bakterieë kleur blou met ’n eenvoudige kleuring. ATCC stel hierdie beperking tot slegs morfologie uitdruklik in sy gids oor mikrobiologiese kulture. ’n Korrekte verslag lui: "blou basille waargeneem". Enigiets buiten vorm en rangskikking vereis meer bewyse.

Gram-kleuring: vier reagense, een gedragstoets

Gram-kleuring is ’n differensiële kleuring. Dit onderwerp alle selle aan dieselfde reeks stappe en toon watter selle die eerste kleurstof behou en watter dit verloor. Die Gram-kleuringsprotokolle van die American Society for Microbiology definieer die standaardvolgorde van vier stappe: kristalviolet (primêre kleurstof), Gram-jodium (beitsmiddel), alkohol of asetoon-alkohol (ontkleurder), en dan safranien (teenkleurstof).

Die standaardonderrigmodel verklaar die onderskeid aan die hand van die struktuur van die selomhulsel. Gram-positiewe selle het ’n dik peptidoglikaanwand wat tydens die alkoholspoeling dehidreer en die kristalviolet-jodiumkompleks behou. Gram-negatiewe selle het ’n dun peptidoglikaanlaag en ’n lipiedryke buitenste membraan wat deur die ontkleurder ontwrig word, sodat die kompleks uitspoel en die selle daarna safranien opneem. Die NCBI Bookshelf-oorsig oor Gram-kleuring gee hierdie verklaring op grond van die selwand. Spesialiste voeg by dat die volledige fisies-chemiese proses ingewikkelder is as wanddikte alleen, maar vir interpretasie in die laboratorium geld die gedragsreël: pers beteken die kleurstof is behou; pienk beteken dit is verloor en daarna deur teenkleuring vervang.

Illustratiewe panele. Gestileerde tekeninge vir metodevergelyking, nie mikrograwe wat met ’n kamera geneem is nie. Kleure is vereenvoudig om die beginsel te verduidelik: een kleur by eenvoudige kleuring, twee kleure ná Gram-ontkleuring.

Kan methyleenblou in Gram-kleuring gebruik word

Hierdie vraag kan op twee maniere verstaan word, en elkeen vereis ’n ander antwoord.

Die eerste betekenis: kan ’n enkele bedekking met methyleenblou die hele Gram-prosedure vervang? Nee. Sonder jodium, ’n ontkleurder en ’n teenkleurstof is daar geen differensiële stap nie, en word geen Gram-kategorie getoets nie. ’n Blou gesigsveld ná methyleenblou alleen is die resultaat van ’n eenvoudige kleuring, selfs al staan die bottel langs die Gram-reagense. Moet dit nie as ’n Gram-resultaat aanteken nie.

Die tweede betekenis: kan methyleenblou safranien as die teenkleurstof by stap 4 vervang? Funksioneel kan dit die ontkleurde selle kleur, en ’n handboekoefening voorspel pers Gram-positiewe selle en blou Gram-negatiewe selle ná so ’n vervanging. Die redenasie is geldig, want korrek ontkleurde Gram-negatiewe selle is byna kleurloos en sal ’n ander kationiese kleurstof opneem. Maar dit is nie die standaardprotokol nie. ASM-protokolle spesifiseer safranien, met erkende alternatiewe soos basiese fuchsien in sommige variante, nie methyleenblou nie. Daar is ook ’n praktiese nadeel: blou teenoor pers is moeiliker om te onderskei as pienk teenoor pers, veral vir beginners en veral met verslete mikroskooplampe. Gebruik vir kursuswerk en enige resultaat wat saak maak die teenkleurstof wat jou protokol voorskryf, gewoonlik safranien, en beskou teenkleuring met methyleenblou as ’n demonstrasievariant eerder as ’n gelykwaardige standaard.

Die verwante vraag oor hoe methyleenblou met ander enkelkleurstofopsies vergelyk, word in ’n vergelyking van eenvoudige bakteriële kleurings behandel.

Wat methyleenbloukleuring van E. coli bewys, en wat dit nie bewys nie

E. coli is ’n Gram-negatiewe staafvormige bakterie, maar daardie sin kombineer feite uit verskeie metodes: morfologie uit mikroskopie, die Gram-reaksie uit ’n Gram-kleuring en identiteit uit kweking plus biochemiese of molekulêre toetse. ’n Methyleenblousmeer dra slegs die eerste deel by. Dit bevestig dat staafvormige selle in die gekleurde monster teenwoordig is en toon hoe hulle gerangskik is. Dit bepaal nie die Gram-reaksie nie, want geen ontkleuringstoets is uitgevoer nie. Dit identifiseer nie die spesie nie, want staafvormige selle van baie spesies lyk by hierdie resolusie eenders.

Dit is waar verslae op ’n voorspelbare manier skeefloop. Die skrywer dra agtergrondkennis ("hierdie kultuur is veronderstel om E. coli te wees, en E. coli is Gram-negatief") in die waarnemingsreël in, sodat die preparaat skynbaar bevestig wat eintlik aangeneem is. ’n Noukeuriger verslag skei die vlakke: "Eenvoudige kleuring met methyleenblou: blou basille waargeneem; slegs morfologie, geen Gram-kategorie getoets nie." Dan, indien ’n Gram-kleuring korrek met kontroles uitgevoer is: "Gram-kleuring: pienk stawe, in ooreenstemming met Gram-negatief." Spesie-identiteit volg later uit die identifikasieproses, nie uit kleur alleen nie.

’n Praktiese interpretasiegids

Gebruik hierdie beslissingsreël in die laboratorium. As alle selle een kleur het en die protokol een kleurstof sonder ’n ontkleurder gebruik het, het jy ’n eenvoudige kleuring uitgevoer. Rapporteer vorm, beraamde grootte en rangskikking. Stop daar. As die protokol kristalviolet, jodium, ’n ontkleurder en ’n teenkleurstof saam met bekende positiewe en negatiewe kontroles gebruik het, het jy ’n Gram-kleuring uitgevoer. Rapporteer kleur saam met morfologie: pers kokke in kettings, pienk stawe, ensovoorts.

Drie foute veroorsaak die meeste verwarring. Eerstens, om blou stawe verkeerdelik as bevestiging van E. coli te interpreteer. Tweedens, om ’n methyleenbloupreparaat onder die opskrif "Gram-kleuring" in ’n notaboek aan te teken, wat latere lesers verkeerd sal interpreteer. Derdens, om teenkleurstowwe sonder deeglike oorweging te vervang en dan kleure tussen laboratoriums te vergelyk asof die kleurpalette dieselfde is. Elke fout het dieselfde oplossing: noem die metode wat werklik uitgevoer is, en maak slegs aansprake oor wat daardie metode toets.

Eenvoudige kleuring verdien sy plek juis omdat dit min aansprake maak. Dit is vinnig, verdra geringe tegniese afwykings en is voldoende wanneer die vraag oor morfologie gaan: is enigiets daar, en watter vorm het dit? Wanneer die vraag oor klassifikasie gaan, voer die differensiële toets uit. Die blou preparaat wys hoe die selle lyk. Die pers of pienk preparaat wys hoe hul wande reageer. Nie een van die twee preparate kan op sy eie die spesie aandui nie.