Loeffler se alkaliese en polichrome metileenblou-kleurstowwe verduidelik

Drie bottels kan langs mekaar op 'n kleuringswerkbank staan, elk gemerk met 'n variant van metileenblou. Op een staan waterige metileenblou 1%. Op een staan Loeffler se alkaliese metileenblou. Op een staan polichrome metileenblou. 'n Besige werker gryp die een wat die naaste is. Die smeer kleur dan te flou, of te eenvormig blou, of in onverwagte pers skakerings, en die monster kry die skuld vir die resultaat.

Dit is 'n formuleringsprobleem, nie 'n monsterprobleem nie. Die drie oplossings bevat verwante kleurstowwe, maar berus op verskillende kleuringskonsepte. Een is 'n gewone kationiese kleurstof by 'n byna neutrale pH. Een is dieselfde kleurstof wat deur alkali sterker laat werk word. Een is glad nie meer 'n enkele kleurstof nie, maar 'n doelbewus geoksideerde mengsel. Gebruik die verkeerde een, en die kleuringsbeginsel verander onder jou hande.

Die kort antwoord

Gewone waterige metileenblou is die vertrekpunt: ongeveer 1% kleurstof in water, 'n eenvoudige kationiese kleurstof vir bakteriële morfologie en algemene mikroskopie. Loeffler se alkaliese metileenblou voeg 'n klein, afgemete hoeveelheid verdunde alkali by 'n alkoholiese voorraadoplossing wat in water verdun is. Dit verhoog die pH en bevorder sterker binding van die kationiese kleurstof aan suur bakteriële strukture. Polichrome metileenblou is metileenblou wat doelbewus deur oksidasie in alkali verouder is. Die bottel bevat dus 'n mengsel van gedemetileerde homoloë (azure A, azure B, azure C), tionien en metileenviolet saam met oorblywende metileenblou, en dié mengsel kleur verskillende strukture in verskillende skakerings.

As jy net een sin onthou: alkalisering verander die kleuringsintensiteit, terwyl polichromering die kleuringskleure verander.

Gewone waterige metileenblou: die verwysingspunt

Die eenvoudigste formulering is metileenblou wat in water opgelos is, gewoonlik teen 1% w/v, sonder alkali en sonder oksidasie. Die gekleurde spesie is die metieltioninium-katioon met 'n chloried-teenioon, 'n klein, plat fenotiasienkleurstof wat in PubChem se metileenblou-inskrywing as metieltioniniumchloried beskryf word. As katioon bind dit aan die fosfaatruggraat van nukleïensure en suur groepe op bakteriële selwande, wat selle blou teen 'n ligte agtergrond kleur.

Die voordeel daarvan is voorspelbaarheid. Kerne en bakterieë lyk blou. Die kontras is beskeie. Organismes wat moeilik sigbaar is, kan swak kleur, en dit is juis die beperking wat Loeffler wou regstel. Vir die breër groep eenvoudige bakteriële kleurstowwe waartoe hierdie oplossing behoort, sien 'n oorsig van eenvoudige bakteriële kleuring. Noukeurige identifikasie bly ook hier belangrik: metielblou is 'n heeltemal ander molekule, soos metielblou teenoor metileenblou verduidelik. 'n Katalogussoektog wat slegs op die kleurnaam berus, kan dus die verkeerde kleurstofklas oplewer.

Loeffler se alkaliese metileenblou: dieselfde kleurstof, sterker aangedryf

Die klassieke Loeffler-resep kombineer 'n alkoholiese metileenblou-voorraadoplossing met verdunde alkali in water. Handboekweergawes skryf 0.3 g kleurstof in 30 mL 95% etanol plus 100 mL 0.01% waterige kaliumhidroksied voor (of, gelykwaardig, 30 mL versadigde alkoholiese metileenblou, 100 mL gedistilleerde water en 1 mL 1% KOH). Dit lewer 'n werkoplossing met ongeveer 0.3% kleurstof by 'n duidelik alkaliese pH. Kommersiële weergawes volg dieselfde beginsel, en die Thermo Fisher-katalogus van mikrobiologiese kleurstowwe lys Loeffler se alkaliese metileenblou saam met polichrome en waterige variante as afsonderlike katalogusitems met afsonderlike beoogde gebruike.

Die alkali is die kern van die werking. Wanneer die pH verhoog word, word karboksiel- en fosfaatgroepe op die monster gedeprotoneer, wat die digtheid van negatiewe bindingsplekke verhoog. Die etanol-voorraadoplossing hou terselfdertyd die kleurstof volledig opgelos, sodat dit dié bindingsplekke in monomeriese vorm bereik. Die resultaat is vinniger, intenser kleuring van bakterieë as met 'n neutrale waterige kleurstof, met die bekende diepblou stawe en kokke van 'n roetine-bakteriologiese smeer. Die kleurtyd is gewoonlik een tot drie minute, gevolg deur afspoeling met water.

Die klassieke toepassing is Corynebacterium diphtheriae wat op Loeffler-serummedium gekweek is: skraal, dikwels knotsvormige stawe met sterk gekleurde metachromatiese Babes-Ernst-granules van opgegaarde polifosfaat. Die kombinasie van medium en kleurstof is histories, en albei word aan dieselfde bakterioloog toegeskryf. Die granulekontras is die diagnostiese voordeel. Benewens werk met witseerkeel dien die kleurstof as 'n algemene bakteriologiese kleurstof vir smere uit kulture, vir Neisseria-morfologie in kliniese smere, en oral waar 'n Gram-kleuring onnodig is maar gewone waterige blou te flou is. Dit is 'n monochrome kleurstof. Alles wat suur is, neem die een of ander blou skakering aan. Wanneer 'n protokol differensiële kleuring vereis, kan alkali alleen dit nie verskaf nie.

Een praktiese waarskuwing: alkaliese kleurstofoplossings verswak en vorm neerslae tydens berging en met koolstofdioksiedopname. Laboratoriums berei óf beperkte volumes voor óf koop die katalogusoplossing en hou by die rakleeftyd daarvan, eerder as om 'n ou bottel aan die gang te hou wat nou sediment op elke voorwerpglas laat beland.

Polichrome metileenblou: een naam, verskeie kleurstowwe

Polichrome metileenblou begin met dieselfde kleurstof, maar onderwerp dit aan beheerde oksidasie in alkali, wat histories veroudering of polichromering genoem is. Alkaliese veroudering, verhitting met karbonaat of oksidasie met middels soos dichromaat verwyder metielgroepe stapsgewys van die dimetielamino-substituente. Die produk is 'n mengsel: oorblywende metileenblou plus azure B (een metielgroep verloor), azure A en azure C (verdere demetilering), tionien (volledig gedemetileer) en oksidatiewe neweprodukte van die metileenvioletgroep. Elke komponent het sy eie kleurskakering en weefselaffiniteit, dus kleur die mengsel metachromaties: kerne, granules, musiene en kraakbeen neem elk onderskeibare blou tot rooipers skakerings aan.

Hierdie chemie is dieselfde chemie agter die bekende bloedkleurstowwe. Vroeë navorsers het bevind dat gealkaliseerde metileenblou die kerne van malariaparasiete in pers skakerings kleur, maar hul waterige verouderde oplossings was onstabiel en het binne dae neerslae gevorm. Die oorsig van hoe die pers bloedkleurstof uitgevind is beskryf hoe Malachowski en Romanowsky hierdie effek in 1891 onafhanklik benut het, hoe metanol ingevoer is om die kleurstofneerslag te stabiliseer en smere sonder hitte te fikseer, en hoe Giemsa later die mengsel gestandaardiseer het rondom afgemete azure B plus eosien met gliserolstabilisering. Moderne Giemsa-tipe kleurstowwe stam regstreeks af van polichrome metileenblou plus eosien, die kombinasie wat die Romanowsky-effek lewer. Vir besonderhede oor die kombinasie met eosien en die azure B-komponent, sien Romanowsky-tipe kleurstowwe en die wisselwerking tussen azure B en eosien.

Omdat dit 'n mengsel is, is polichrome metileenblou van nature die minste gestandaardiseerde van die drie. Die presiese balans tussen kleurskakerings hang af van die oksidasieroete en die omvang van oksidasie. Daarom verkoop histologieverskaffers dit as 'n afsonderlike produk met sy eie prestasietoetsing, eerder as verouderde Loeffler-oplossing. Tipiese gebruike sluit in die metachromatiese uitwysing van mastselle se granules, musiene en kraakbeen, besonderhede van plasmaselle, en Helicobacter pylori in weefselsnitte deur polichrome metodes van die Goodpasture-tipe. Dit is die regte keuse wanneer die vraag differensiasie volgens kleur is, en die verkeerde keuse wanneer die protokol 'n duidelike monochrome bakteriële silhoeët vereis.

Vergelyking van formulering en doel

Lees die tabel as 'n besluitnemingsprosedure. As die monster te flou kleur, verander die pH-konsep en gebruik Loeffler se oplossing. As alles kleur maar niks onderskeibaar is nie, verander die kleurstofkonsep en gebruik polichrome metileenblou. As 'n Loeffler-smeer granules pragtig vertoon, maar die toesighouer vra waarom kerne en sitoplasma dieselfde blou kleur het, is die antwoord dat geen alkaliese monochrome kleurstof daardie taak kan verrig nie. Dié vraag hoort by die polichrome groep en sy bloedkleurstofafgeleides.

Vermy die algemene verwarrings

Twee foute is verantwoordelik vir die meeste verwarring. Die eerste is om Loeffler se oplossing as uitruilbaar met gewone metileenblou te beskou omdat albei blou in die bottel lyk. Hulle verskil in pH en intensiteit, en wanneer neutrale kleurstof gebruik word waar Loeffler se oplossing voorgeskryf is, gaan juis die granulekontras verlore waarop die protokol berus. Die tweede is om enige ou of toevallig verouderde alkaliese blou as polichroom te beskou. Onbeheerde veroudering lewer 'n onbekende mengsel met onbekende sterkte, terwyl ware polichrome oplossings deur omskrewe oksidasieroetes voorberei word en, in die bloedkleurstoflyn, met afgemete eosien gekombineer word. Die geskiedenis is hier leersaam: die onstabiele waterige verouderde oplossings van die 1890s het plek gemaak vir gestabiliseerde metanoliese formulerings juis omdat onbeheerde mengsels nie herhaalbaar was nie. Dit is 'n les wat die moeite werd is om te onthou voordat 'n diagnostiese voorwerpglas met 'n oplossing uit 'n bottel van onseker ouderdom gekleur word.

Noukeurige benaming rond die proses af. Bevestig die katalogusitem (waterig teenoor Loeffler teenoor polichroom), die kleurstofinhoud en die beoogde toepassing op die etiket, eerder as om dit uit die kleur af te lei. Die drie formulerings het 'n gemeenskaplike chromofoor-oorsprong. Hulle het nie 'n gemeenskaplike doel nie.