Kleuring van wangselle met metileenblou: wat om waar te neem

'n Leerder plaas 'n druppel wangsel-suspensie op 'n voorwerpglas, kyk deur die mikroskoop en sien byna niks. 'n Paar bleek spookbeelde dryf oor 'n helder gesigsveld. Sy verstel die fokus, verhoog dan die beligting en besluit uiteindelik dat die voorwerpglas leeg is. Die voorwerpglas is nie leeg nie. Die selle is daar. Hulle is byna deursigtig, en daardie deursigtigheid is juis die probleem wat hierdie kleuring moet oplos.

Dit is die moeite werd om hierdie wanverhouding tussen verwagting en beeld uit te wys voordat die protokol begin. Beginners verwag dat 'n mikroskoop besonderhede sal onthul soos 'n kamera se zoemfunksie 'n veraf bord duideliker maak. 'n Helderveldmikroskoop doen iets meer beperk: dit toon verskille in ligabsorpsie. 'n Ongekleurde wangsel absorbeer byna geen lig nie en lewer dus byna geen verskil nie. Metileenblou voeg die verskil by. Dit bind oneweredig binne die sel en verander struktuur in kontras. Sodra leerders hierdie konsep begryp, maak elke daaropvolgende stap sin as 'n gevolg eerder as bloot 'n resep.

Agtergrond oor hoe eenvoudige kleurings kontras in die skoollaboratorium skep, help hier, en 'n opknapping oor die opstel van 'n helderveldmikroskoop voor kleuring voorkom die helfte van die mislukte preparate. Die chemie agter die kleur word behandel in 'n inleiding tot metileenblou in mikroskopie, wat verduidelik waarom hierdie spesifieke kleurstof telkens op die laboratoriumwerkbank verskyn.

Die klaskamerprotokol

Die natpreparaat hieronder is die eenvoudiger verstekmetode vir algemene klasse. Dit vereis geen vlam of fikseerstap nie. Die gefikseerde smeerpreparaat wat in sommige kollegehandleidings gebruik word, voeg lugdroging en kort hittefiksering by, soos in die wangsmeeraktiwiteit van North Central Texas College wat deur Biology LibreTexts gepubliseer is, maar hittefiksering is 'n gebruik in mikrobiologie, nie 'n vereiste om epiteelselle te sien nie.

Wat jy nodig het: skoon voorwerpglase en dekglasies, steriele eenmalige depperstokkies (verkieslik) of nuwe plat tandestokkies, 'n drupperbottel met 'n 0.5 tot 1 persent waterige metileenblou-oplossing, gedistilleerde of gedeïoniseerde water, kladpapier, handskoene en 'n saamgestelde mikroskoop met 100x en 400x totale vergroting.

1. Spoel die mond met gewone water uit. Dit verwyder voedseldeeltjies wat later intens kleur en die aandag van die selle aftrek.
2. Elke leerder neem slegs 'n monster van hul eie wang. Vryf die binnekant van die wang liggies met 'n nuwe steriele depperstokkie. Druk, moenie skraap nie. Hou op lank voordat enige ongemak of bloeding voorkom.
3. Rol die depperstokkie in 'n dun laag oor die middel van 'n skoon voorwerpglas. 'n Dun lagie is die belangrikste enkele voorspeller van 'n bruikbare preparaat. 'n Dik wit neerslag sal tot 'n ononderskeibare blou massa kleur.
4. Voeg een druppel metileenblou oor die smeer by. Laat dit vir 1 tot 3 minute staan. Een minuut is voldoende in baie kollegeprotokolle; die NCERT-wetenskaplaboratoriumhandleiding vir klas IX gebruik ongeveer 3 minute vir 'n tydelike preparaat. Langer is nie beter nie, en oorkleuring is die algemeenste tydsberekeningsfout.
5. Spoel liggies met gedistilleerde water of trek oortollige kleurstof met kladpapier weg, volgens die plaaslike protokol. Die agtergrond moet ligblou word, nie donker vlootblou nie.
6. Laat sak 'n dekglasie teen 'n hoek sodat een rand eerste raak, en laat dit dan stadig sak. Dit voorkom lugborrels.
7. Begin by lae vergroting om die selle te vind, bevestig die fokus en sentrering en beweeg dan na 100x en uiteindelik 400x. Gebruik by 400x slegs die fyninstelling.

Die kleurstofkonsentrasie verdien een sin ter verduideliking. Skoolprotokolle gebruik meestal ongeveer 1 persent waterige metileenblou. 'n Sterker voorraadoplossing of langer blootstelling verdonker die agtergrond vinniger as die kern, wat die kontras waarvan die oefening afhanklik is, omkeer.

Veilige hantering van wangmateriaal

Wangmonsters bevat speeksel en normale mondmikroörganismes. Behandel dus elke vars smeer as potensieel aansteeklike materiaal, al is die skenkers gesonde klasmaats. Die American Society for Microbiology se bioveiligheidsriglyne vir onderriglaboratoriums stel die algemene beginsels: beoordeel die risiko voor die sessie, dra handskoene, beskerm die oë waar spatsels moontlik is, was hande daarna, ontsmet werkbanke en voer besmette weggooibare materiaal deur die goedgekeurde biologiese afvalstroom af.

Vier klaskamerreëls dek die meeste risiko's. Een skenker per depperstokkie en per voorwerpglas; dit word nooit gedeel nie. Neem slegs jou eie monster, nooit dié van iemand langs jou nie. Eenmalige depperstokkies en tandestokkies gaan reguit na die aangewese afvalhouer, nooit terug op die werkbank nie. Metileenblou self vlek vel en klere en irriteer die oë, dus geld handskoene en die gewone higiënepraktyke vir kleurstowwe. Moenie hierdie oefening uitbrei deur enigiets uit die smeer te kweek nie, en moenie hittefiksering van vars menslike materiaal buite die skool se veiligheidsprosedure improviseer nie.

Wat om waar te neem, en waarom dit so lyk

Soek by 100x na breë, plat, ligblou selle met onreëlmatige ovaal of veelhoekige buitelyne. Hulle lê afsonderlik of in los, oorvleuelende lae. Elke sel het gewoonlik een donkerder blou kol. Daardie kol is die kern. Let ook op die rangskikking: plaveiselepiteelselle is dun teëltjies, nie sfere nie. Daarom lyk hul rande soos gebarste glasuursel eerder as ronde ballonne.

By 400x word drie kenmerke duidelik onderskei. Die selgrens verskyn as 'n dun, donkerder lyn wat die sel omsluit. Die sitoplasma vul die binnekant met 'n ligte, egalige blou kleur. Die kern is donkerder en meer kompak, dikwels ovaal, gewoonlik naby die middel maar nie altyd nie. Vra leerders om al drie aan te teken, saam met die vorm en vergroting, want dit is presies wat die werkblad vra.

Een punt oor akkuraatheid is hier belangrik, en baie werkblaaie stel dit verkeerd. Die sigbare grens stem ooreen met die streek van die plasmamembraan, maar die membraan self, 'n lipieddubbellaag van ongeveer 7 tot 10 nanometers dik, is ver onder wat 'n skoolmikroskoop kan onderskei. Wat leerders sien, is die optiese rand van die sel saam met kleurstof wat daar opgehoop het. Dieselfde waarskuwing geld vir organelle. Mitochondria, die endoplasmiese retikulum, Golgi-liggame en ribosome is nie in hierdie preparaat sigbaar nie. 'n Gewone ligmikroskoop kan onder goeie toestande besonderhede tot ongeveer 0.2 mikrometers onderskei, soos die NCBI se selbiologiese agtergrond oor mikroskopie-instrumente verduidelik, en die meeste ultrastruktuur lê onder of naby daardie grens. Hoër leë vergroting maak die beeld groter sonder om besonderhede by te voeg.

Waarom kleur die kern die donkerste? Metileenblou is 'n kationiese kleurstof wat in oplossing positief gelaai is, en dit assosieer met negatief gelaaide materiaal in die sel, veral nukleïensure. Chromatien konsentreer DNA in die kern, dus versamel die kern die meeste kleurstof. Sitoplasma bevat RNA en ander gelaaide molekules, daarom kleur dit ook, maar meer verspreid en ligter. Die belangrike voorbehoud: metileenblou is nie 'n DNA-spesifieke kleurstof nie. Navorsing oor die verspreiding van metileenblou by kernbeeldvorming beskryf hoe die katioon met nukleïensuurryke streke assosieer, en ouer kwantitatiewe navorsing oor metileenbloubinding in selpreparate het bevind dat die meeste gebonde kleurstof met nukleïensure geassosieer was. 'n Donker kern en ligte sitoplasma is dus 'n kontraspatroon, nie 'n molekulêre toets nie.

Foute wat leerders sal maak, en hoe om dit te interpreteer

Byna elke mislukte preparaat pas by een van vyf patrone. Leer leerders om vas te stel wat met die preparaat verkeerd is, eerder as om dit blindelings oor te doen.

Oorkleuring maak selle en agtergrond eenvormig donker, sodat die kern in die gesigsveld verdwyn. Stel dit reg met 'n korter kleurtyd of deegliker spoeling. Onderkleuring laat spookbeelde wat verdwyn wanneer die beligting verhoog word; verleng die kleurtyd in stappe van dertig sekondes. Dik smere vorm digte, oorvleuelende massas waarin geen buitelyn gevolg kan word nie; die regstelling is meganies: versprei die materiaal volgende keer dunner, want geen spoeling kan 'n hoop selle red nie. Lugborrels verskyn as volmaakte sirkels met skerp, donker rande en lei beginners af wat hulle vir strukture aansien; plaas die dekglasie weer stadig teen 'n hoek neer. Klein donker kolletjies wat op of rondom die selle versprei is, is gewoonlik normale mondbakterieë, soos skoolprotokolle soos die Ingrid Science-prosedure vir wangselle aandui. Hulle bevestig dat die mond bewoon is, wat leerders dalk sal onthou, maar hul spesies kan nie in hierdie oefening geïdentifiseer word nie en hulle moet nie as seldele geteken word nie. Voedselreste en slymdrade kleur onreëlmatig en intens; die voorafspoeling is bedoel om hulle te verminder.

Wat hierdie oefening nie kan doen nie

Dit is 'n opvoedkundige waarneming, nie 'n diagnostiese toets nie. Niks aan die voorkoms van selle in 'n klaskamerkleuring kan infeksie, kanker of enige siekte diagnoseer nie, en die artikel moet nie gelees word asof dit anders voorstel nie. Die preparaat toon vorm, grens, sitoplasma en kern by twee vergrotings. Dit toon nie membraanultrastruktuur, organelbesonderhede of molekulêre identiteit nie. Deur hierdie beperking uitdruklik te noem, word sowel die wetenskap as die leerders beskerm: 'n goeie resultaat is 'n korrek benoemde tekening met die vergroting en kleuring aangeteken, nie 'n gevolgtrekking oor gesondheid nie.

Leerderwerkblad en benoemde mikrograwe

Die twee projekhulpmiddels vir hierdie bladsy is die benoemde mikrograaf hierbo en die werkblad hieronder. Druk een werkblad per leerder uit, of projekteer dit en laat leerders die blokkies in hul notaboeke oorteken.

Hoe om dit in 'n sessie van 45 minute te gebruik: tien minute vir veiligheidsinstruksies en monsterneming, tien minute vir kleuring en montering, vyftien minute vir waarneming en sketse by albei vergrotings, tien minute vir die kontrolelys en vergelyking met die benoemde mikrograaf. Die kontrolelysitems is doelbewus prakties. Dun smeer, korrekte kleurtyd, kern donkerder as sitoplasma, vergroting aangeteken. 'n Leerder wat al vier kan afmerk, het die konsep verstaan wat hierdie les moet oordra: mikroskope toon verskille, en kleurings skep die verskille wat die moeite werd is om te toon.