Ìdánwò ìwúkàrà pẹ̀lú methylene blue: kíkà sẹ́ẹ̀lì alààyè àti dídiwọ̀n àkókò mímí

Túùbù méjì wà lórí tábìlì iṣẹ́. Àwọn méjèèjì jẹ́ búlúù. Nínú ọ̀kan, sẹ́ẹ̀lì búlúù tí a rí lábẹ́ maikirosikopu túmọ̀ sí ìwúkàrà tí ó ti kú. Nínú èkejì, túùbù tí ó yí padà láti búlúù sí àìní àwọ̀ túmọ̀ sí pé ìwúkàrà wà láàyè, ó sì ń mí. Ohun àwọ̀ kan náà, ṣùgbọ́n ìtumọ̀ àbájáde tó tako ara wọn. Bí o bá da àwọn ìdánwò méjèèjì pọ̀, gbogbo ìparí tí o bá fa yóò yí padà.

Ìyàtọ̀ yìí ni gbogbo àpilẹ̀kọ náà dá lé. Methylene blue jẹ́ ohun àwọ̀ redox: nígbà tí ó bá wà ní ipò oxidation, ó jẹ́ búlúù; nígbà tí ó bá ti gba ìdínkù kẹ́míkà, ó jẹ́ leucomethylene blue tí kò ní àwọ̀. Kíkà ìwàláàyè ń lo ìṣe kẹ́míkà yẹn fún àyẹ̀wò kúkúrú lábẹ́ maikirosikopu. Ìdánwò mímí ń lò ó nínú ìṣe kẹ́míkà àpapọ̀ tí a ń díwọ̀n àkókò rẹ̀. Ọ̀kọ̀ọ̀kan nílò ìlànà tirẹ̀, àwọn àpẹẹrẹ ìṣàkóso tirẹ̀, àti ṣíṣe àyẹ̀wò àbájáde rẹ̀ pẹ̀lú ìṣọ́ra.

Kíkà ìwàláàyè: fífún ní àwọ̀ fún ìgbà kúkúrú, kí a sì ka àbájáde kíákíá

Ìlànà tí ilé iṣẹ́ ọtí bíà ń lò ni èyí tí a ti ṣètò sí ìwọ̀n àjọṣepọ̀ jù lọ. Pèsè methylene blue 0.01% w/v nínú sodium citrate 2%, dà á pọ̀ ní ìpín 1:1 pẹ̀lú ìwúkàrà tí a tú ká sínú omi, kí o sì ṣàyẹ̀wò àdàlù náà lẹ́yìn àkókò kúkúrú kan tí a ti pinnu. Àwọn àkókò tí a tẹ̀ jáde yàtọ̀ láti 1 sí 2 ìṣẹ́jú nínú ìwé ìtọ́sọ́nà Brewing Science Institute sí nǹkan bí 5 ìṣẹ́jú nínú àwọn ìlànà ìwádìí, nígbà tí ọ̀nà OIV fún ìmọ̀ àwọn ohun alààyè kéékèèké nínú wáìnì sọ pé a gbọ́dọ̀ ṣàyẹ̀wò láàárín 10 ìṣẹ́jú. Ìfojúsùn ohun àwọ̀ nínú àdàlù tí a ó kà yóò wà ní nǹkan bí 0.005%. Fi àdàlù náà sínú yàrá kíkà Neubauer tí a ti mú sunwọ̀n sí i, kí o sì fi ìmú-nlá tó tó 400x pín àwọn sẹ́ẹ̀lì sí ẹgbẹ́: sẹ́ẹ̀lì búlúù dúdú gẹ́gẹ́ bí èyí tí kò wà láàyè, àti sẹ́ẹ̀lì tí kò gba àwọ̀ gẹ́gẹ́ bí èyí tí ó wà láàyè. Ọ̀nà OIV ń ka sẹ́ẹ̀lì búlúù fẹ́ẹ́rẹ́ sí èyí tí ó wà láàyè, èyí sì ti ń tọ́ka sí ìṣòro ìdájọ́ ẹni kọ̀ọ̀kan tí a ó jíròrò nísàlẹ̀.

Ìfojúsùn sẹ́ẹ̀lì wá láti ìwọ̀n àti ìrísí yàrá kíkà náà. Nígbà tí a bá ka gbogbo onígun mẹ́rin àárín tí ẹgbẹ́ rẹ̀ jẹ́ 1 mm, iye sẹ́ẹ̀lì fún mL dọ́gba pẹ̀lú N lọ́wọ́ iye ìfomi-kún-un lọ́wọ́ 10^4, níbi tí N ti jẹ́ iye tí a kà ní àgbègbè yẹn, gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé nínú àwọn ọ̀nà ASBC fún ìwúkàrà. Ìwàláàyè rọrùn jù bẹ́ẹ̀ lọ: pín iye sẹ́ẹ̀lì tí kò gba àwọ̀ nípasẹ̀ gbogbo sẹ́ẹ̀lì, kí o sì sọ ọ́ di 100 lọ́wọ́. Ka nǹkan bí 400 sẹ́ẹ̀lì láti ṣírò ìwàláàyè, ní títẹ̀lé ìwádìí FEMS tó fi àwọn ọ̀nà ilé iṣẹ́ ọtí bíà wéra àti ìṣe OIV. Lo òfin ààlà kan ní ọ̀nà kan náà ní gbogbo ìgbà; fún àpẹẹrẹ, ka sẹ́ẹ̀lì tó wà lórí àwọn ìlà àwọ̀n ìsàlẹ̀ àti òsì, má sì ka èyí tó wà lórí àwọn ìlà òkè àti ọ̀tún.

A nílò òfin fún àwọn ẹ̀ka tuntun tí ń yọ lára sẹ́ẹ̀lì kí kíkà tó bẹ̀rẹ̀. Ìlànà tí ó wọ́pọ̀ ń ka ẹ̀ka tuntun gẹ́gẹ́ bí sẹ́ẹ̀lì ọ̀tọ̀ nígbà tí ó bá tó nǹkan bí ìdajì ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì ìyá, ó sì ń kà á pọ̀ mọ́ ìyá bí ó bá kéré sí i. Èyíkéyìí òfin tí a bá yàn, lò ó fún gbogbo onígun mẹ́rin, kí o sì kọ ọ́ sórí bébà iṣẹ́ kí ẹni tó tẹ̀ lé lè tún un ṣe.

Bébà iṣẹ́ kíkà (tẹ èyí jáde)

Bébà iṣẹ́ yìí jẹ́ ohun èlò àkọ́kọ́ tí a dá fún àpilẹ̀kọ yìí. Dà á kọ sínú ìwé àkọsílẹ̀ tàbí tẹ ẹyọ kan jáde fún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, níbi tí N ti wá láti àgbègbè yàrá kíkà tí a ti sọ. Kọ àkókò fífún ní àwọ̀ sí ẹ̀gbẹ́ àbájáde, nítorí pé iye ìwàláàyè tí kò ní àkókò rẹ̀ kò ṣeé tún rí nípasẹ̀ títún ìdánwò ṣe.

Ìdí tí àwọn iye ìwàláàyè fi ń yí padà

Àkókò ni ohun àkọ́kọ́ tó ń da ìdánwò rú, ó sì lè fa àṣìṣe ní ọ̀nà méjèèjì. Àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ìṣètò oúnjẹ inú wọn ń ṣiṣẹ́ ń ṣe ìdínkù kẹ́míkà sí ohun àwọ̀, nítorí náà kíkà àbájáde ní kùtùkùtù lè mú sẹ́ẹ̀lì alààyè kí wọ́n tó parí ìdínkù náà, kí a sì ṣàṣìṣe kà wọ́n sí òkú. Ṣùgbọ́n fífi wọn sínú ohun àwọ̀ fún àkókò pípẹ́ fúnra rẹ̀ ní májèlé, ó sì ń dá sẹ́ẹ̀lì búlúù tí ó ti bà jẹ́ ní tòótọ́ sílẹ̀, tí ó ń mú kí fífún ní àwọ̀ fi ikú hàn lọ́nà èké. Nítorí náà, ìlànà ìkọ́ni yàrá ìdánwò kan sọ pé a gbọdọ̀ ka àbájáde láàárín 5 ìṣẹ́jú, gẹ́gẹ́ bí a ti kọ sínú ìlànà ìkọ́ni ìwúkàrà Wisconsin. Ọ̀nà tó bójú mu láti sọ ọ́ ni pé kíkà àbájáde methylene blue sinmi lórí àkókò; nítorí náà, yan àkókò kúkúrú kan, kí o sì jẹ́ kí ó jẹ́ bákan náà fún gbogbo àpẹẹrẹ nínú ọ̀wọ́ ìdánwò kan.

Àwọn àpẹẹrẹ tí ìwàláàyè wọn kéré ní irú àṣìṣe kejì. Ọ̀nà tí a ti ṣètò sí ìwọ̀n àjọṣepọ̀ kìlọ̀ pé methylene blue lè ṣírò ìwàláàyè gidi ga jù bó ṣe rí lọ ní ìsàlẹ̀ nǹkan bí 80%, nítorí pé àwọn sẹ́ẹ̀lì tí wọ́n ṣì ń ṣe ìdínkù kẹ́míkà sí ohun àwọ̀ lè má ní agbára láti bímọ mọ́. Àwọn ìwé nípa ṣíṣe ọtí bíà ṣàpèjúwe àìṣeégbẹ́kẹ̀lé kan náà nígbà tí ìwàláàyè bá ti dín kù gidigidi. Wo methylene blue gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà ìṣírò àfojúsùn kíákíá, kí o sì fi kíkà lórí àwo ìdàgbàsókè tàbí ohun àwọ̀ ìdánwò míràn jẹ́rìí sí àwọn ìpinnu pàtàkì nípa ìwàláàyè kékeré, bíi títún lo ìwúkàrà tí a ti tọ́ láti bẹ̀rẹ̀ ìpele ìṣelọpọ tuntun.

Ipa àyíká àpẹẹrẹ ni ẹ̀kẹta. Ọ̀nà OIV ń ṣiṣẹ́ ní pH tó sún mọ́ 4.6, ó sì kìlọ̀ pé àwọn àpẹẹrẹ pH kékeré tí wọ́n ní agbára púpọ̀ láti dènà ìyípadà pH ń dènà ìṣe tó tọ́ ti ohun àwọ̀. Ó tún gba ni nímọ̀ràn láti má lo ìdánwò náà nígbà tí ṣúgà bá ju 100 g/L lọ, níbi tí àwọn sẹ́ẹ̀lì ti ń dà bí búlúù fẹ́ẹ́rẹ́ lọ́nà tó lè ṣi ni lọ́nà. Ìfiwéra pH fífún ní àwọ̀ nínú ìdánwò kan rí ìyípadà tó pọ̀ nínú agbára ìdánwò láti rí ohun tí ó ń wá jákèjádò àwọn pH tí a dán wò, èyí tó bá ìwádìí ọ̀nà methylene blue tó sinmi lórí pH mu. Ìdọ̀tí jẹ́ ìdẹkùn ọ̀tọ̀: àwọn patikulu tí ó gba àwọ̀ nínú àdàlù ọkà ẹlẹ́gbin ń dà bí sẹ́ẹ̀lì òkú, wọ́n sì ń mú ìyàtọ̀ àbájáde láàárín àwọn olùṣe ìdánwò pọ̀ sí i.

A ti díwọ̀n ìyàtọ̀ yẹn; kì í ṣe ìtàn ẹnu lásán. Nínú ìdánwò ilé iṣẹ́ ọtí bíà tí ó gba oṣù mẹ́fà, tí a ròyìn nínú ìfiwéra ìwúkàrà FEMS, ìwọ̀n ìyapa boṣewa àwọn ìwọ̀n methylene blue tí a ṣe lẹ́ẹ̀mejì jẹ́ 6.1% ní àpapọ̀, ní ìfiwéra pẹ̀lú 0.2% fún kíkà sẹ́ẹ̀lì nínú ìṣàn pẹ̀lú oxonol. Àwọn olùṣe ìdánwò méjì sì yàtọ̀ sí ara wọn tó 13 àmì ìdá ọgọ́rùn-ún lórí àpẹẹrẹ kan náà. Ìfiwéra oníṣirò àwọn ọ̀nà ìwàláàyè ní 2023 rí i pé maikirosikopu fluorescence àti kíkà sẹ́ẹ̀lì nínú ìṣàn ní ìpéye tó ga púpọ̀ sí i, nígbà tí ó tún fi hàn pé iṣẹ́ wọn sinmi lórí irú ẹ̀dá àti àyíká àpẹẹrẹ. Àpèjúwe ọ̀nà àtijọ́ láti ọwọ́ Painting àti Kirsop (PMID 24430080) ṣì jẹ́ ibi ìtọ́kasí, àti àtúnyẹ̀wò tó gbòòrò sí i nípa ìdánwò ìwàláàyè àti agbára iṣẹ́ ìwúkàrà (PMID 25154541) fi methylene blue sí ẹgbẹ́ àwọn ìdánwò tí ń ṣe àfikún sí ara wọn, kì í ṣe èyí tí ń fúnni ní ìdáhùn àṣeparí. Trypan blue kì í ṣe ohun tó dára jù lọ fúnra rẹ̀ níbí: ó ń fi hàn pé awọ tó yí sẹ́ẹ̀lì ká ti pàdánù ìpéye rẹ̀, nígbà tí methylene blue ń fi gbígba ohun àwọ̀ sínú sẹ́ẹ̀lì àti iṣẹ́ ìdínkù kẹ́míkà hàn. Nítorí náà, àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó wà lábẹ́ ìnira lè wọ ẹgbẹ́ tó yàtọ̀ lábẹ́ ohun àwọ̀ méjèèjì.

Ìdánwò mímí: díwọ̀n àkókò tí búlúù fi ń parẹ́

Ìdánwò kejì kò lo maikirosikopu rárá. Ìwúkàrà pẹ̀lú glucose àti methylene blue tí a ti fi omi pọ̀ sí i lọ sínú túùbù tí a pa mọ́, aago sì ń díwọ̀n bí àwọ̀ búlúù ṣe pé tó kí ó tó parẹ́. Bí àwọn sẹ́ẹ̀lì ṣe ń ṣe ìṣètò oúnjẹ inú wọn, wọ́n ń mú àwọn èròjà tó ní agbára ìdínkù kẹ́míkà jáde, tí wọ́n ń yí ohun àwọ̀ búlúù padà sí ìrísí rẹ̀ tí kò ní àwọ̀, nígbà tí atẹ́gùn tí ó tú sínú omi ń tún un padà sí ipò oxidation. Nígbà tí àwọn sẹ́ẹ̀lì bá ti lo atẹ́gùn dé ìwọ̀n kékeré, ìdínkù kẹ́míkà lápapọ̀ ń borí, túùbù náà sì pàdánù àwọ̀ rẹ̀. Nítorí náà, òpin ìdánwò ń fi ìwọ̀ntúnwọ̀nsì láàárín mímí, ìfojúsùn ohun àwọ̀, àti atẹ́gùn tí ó wà hàn. A sì yẹ kí a ròyìn rẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àkókò ìdínkù kẹ́míkà tàbí píparẹ́ àwọ̀ methylene blue, kì í ṣe gẹ́gẹ́ bí òṣùwọ̀n lílo atẹ́gùn molikula tààrà.

Lo ohun àwọ̀ tí a ti fi omi pọ̀ sí i gan-an ju èyí tí a lò fún ìwàláàyè lọ, kí àkókò náà lè wà ní àárín ìwọ̀n tí ó rọrùn láti díwọ̀n. Ìwé ìtọ́sọ́nà iṣẹ́ ìdánwò dandan AQA A level ṣètò èyí dáadáa: 1 g glucose fún omi 100 mL tí a mú gbóná sí nǹkan bí 30 C, 5 g ìwúkàrà gbígbẹ tí a fi kún un lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ kí a tó lò ó, àti ojútùú ohun àwọ̀ fún lílo tó sún mọ́ 0.001%, tí a pèsè nípa fífi omi kún 0.1 mL ojútùú ìpìlẹ̀ 1% dé 100 mL. Da 2 mL àdàlù ìwúkàrà àti glucose pọ̀ mọ́ 2 mL ojútùú ohun àwọ̀ fún lílo, jẹ́ kí ó dé ìwọ̀ntúnwọ̀nsì ní ìwọ̀n otútù ìdánwò, mì í lẹ́ẹ̀kan fún 10 ìṣẹ́jú-àáyá, bẹ̀rẹ̀ aago, má sì mì í mọ́. Mímì ń tún atẹ́gùn wọlé, ó sì ń mú túùbù padà sí búlúù; èyí ni àṣìṣe tí ìlànà iṣẹ́ ń fà tó tóbi jù lọ. AQA sọ pé àdàlù tí a pèsè yẹ kí ó sábà pàdánù àwọ̀ rẹ̀ láàárín nǹkan bí 5 ìṣẹ́jú ní 35 C, pẹ̀lú àpapọ̀ àkókò ìdánwò 275 s ní 20 C, 128 s ní 35 C, àti 145 s ní 45 C. Àwọn wọ̀nyí jẹ́ àpẹẹrẹ láti ètò ìdánwò kan, kì í ṣe ìwọ̀n àfiwé fún gbogbo ipò. Àwọn ìwádìí pàtó nípa ìdínkù kẹ́míkà ṣe àtìlẹ́yìn fún ìbáṣepọ̀ oníṣirò láàárín òṣùwọ̀n ìdínkù àti ìwúkàrà tí ìṣètò oúnjẹ inú rẹ̀ ń ṣiṣẹ́ ní àwọn ipò tí a ṣàkóso, pẹ̀lú iṣẹ́ tí a tọ́ka sí gẹ́gẹ́ bí PMID 25773544 àti ìwádìí nípa bí ìṣe náà ṣe ń ṣiṣẹ́ nínú Yeast (2014).

Àfihàn ìyípadà pẹ̀lú àkókò (ohun èlò àkọ́kọ́)

Tábìlì nísàlẹ̀ jẹ́ àfihàn àkọ́kọ́ tí a ṣe fún àpilẹ̀kọ yìí, ní lílo ètò irú AQA tí a ṣàpèjúwe lókè: 2 mL àdàlù ìwúkàrà àti glucose pẹ̀lú 2 mL ojútùú ohun àwọ̀ fún lílo tó sún mọ́ 0.001%, mímì lẹ́ẹ̀kan fún 10 ìṣẹ́jú-àáyá, lẹ́yìn náà fífi sílẹ̀ ní ipò ìdánwò láìda á láàmú. Àwọn àkọsílẹ̀ jẹ́ àpẹẹrẹ ìwọ̀n ní ìrísí tí ẹgbẹ́ akẹ́kọ̀ọ́ yẹ kí ó kọ sílẹ̀, níbi tí atọ́ka òṣùwọ̀n ti jẹ́ 1 tí a pín nípasẹ̀ àkókò píparẹ́ àwọ̀ ní ìṣẹ́jú-àáyá. Ṣe ìdánwò pẹ̀lú àwọn túùbù kan náà, kí o sì fi àwọn iye tí o díwọ̀n rọ́pò àwọn àkọsílẹ̀ wọ̀nyí.

Ya àwòrán ìbáṣepọ̀ atọ́ka òṣùwọ̀n àti ìwọ̀n otútù fún túùbù A, B, àti C. Ìlà náà ń gòkè, lẹ́yìn náà ó tẹ́ tàbí sọ̀kalẹ̀; èyí ni àpẹẹrẹ tí a ń retí láti inú iṣẹ́ enzyme, kì í ṣe ìlà tààrà. Túùbù D, E, àti F kì í ṣe àwọn àmì dátà lórí ìlà yẹn. Wọ́n jẹ́ àwọn àpẹẹrẹ ìṣàkóso tí ó mú kí a lè túmọ̀ ìlà náà.

Àwọn àpẹẹrẹ ìṣàkóso tí ń mú kí ìdánwò kọ̀ọ̀kan ní ìtumọ̀

Gbogbo ìpele ìdánwò mímí nílò àwọn àpẹẹrẹ mẹ́ta tó bá a lọ. Ìwúkàrà tí a sè tàbí pa, pẹ̀lú glucose àti ohun àwọ̀, yẹ kí ó ṣì jẹ́ búlúù, láti fi hàn pé ìdínkù kẹ́míkà kíákíá sinmi lórí ìṣètò oúnjẹ ohun alààyè. Ìwúkàrà alààyè pẹ̀lú ohun àwọ̀ láìfi glucose kún un jẹ́ àpẹẹrẹ ìṣàkóso fún èròjà tí a ń lò, ṣùgbọ́n retí pé àwọ̀ yóò parẹ́ díẹ̀díẹ̀ síbẹ̀, nítorí pé ìwúkàrà ń lo àwọn ohun tí ó ti fi pamọ́ sínú ara rẹ̀. Glucose pẹ̀lú ohun àwọ̀ láìsí ìwúkàrà jẹ́ àpẹẹrẹ òfo kẹ́míkà, tí ó ṣe pàtàkì nítorí pé glucose ní ipò alkaline lè ṣe ìdínkù kẹ́míkà sí methylene blue láìsí sẹ́ẹ̀lì kankan.

Kíkà ìwàláàyè nílò irú ìṣàkóso míràn: kí ìlànà iṣẹ́ dúró déédéé. Ojútùú ìpìlẹ̀ ohun àwọ̀ kan náà, ìpín àdàlù kan náà, àkókò fífún ní àwọ̀ kan náà, àgbègbè yàrá kíkà kan náà, àwọn òfin ẹ̀ka tuntun àti ààlà kan náà; kí a sì kà á láìmọ ìdánimọ̀ àpẹẹrẹ níbi tí ó ti ṣeé ṣe. Nígbà tí àwọn olùṣe ìdánwò méjì bá yàtọ̀ ní àmì mẹ́wàá, bébà iṣẹ́ sábà ń fi ohun tó fà á hàn: àkókò tó yàtọ̀, ààlà búlúù tí a fi ń ṣe ìpín tó yàtọ̀, tàbí òfin ẹ̀ka tuntun tó yàtọ̀. Àwọn ọgbọ́n fún pípèsè àti wíwo sẹ́ẹ̀lì tí a ti fún ní àwọ̀ ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú àwọn ọ̀nà fífún bakitéríà ní àwọ̀ ní ọ̀nà tó rọrùn, nígbà tí àyẹ̀wò tó gbòòrò sí i nípa ohun tí ohun àwọ̀ náà ń fi hàn nínú onírúurú àpẹẹrẹ wà nínú àkójọpọ̀ àwòrán fífún ní àwọ̀ fún maikirosikopu. Fún ìmọ̀ físíìkì tó wà lẹ́yìn dídiwọ̀n agbára àwọ̀ búlúù èyíkéyìí ní ọ̀nà oníṣirò, ìtọ́kasí gbígba ìmọ́lẹ̀ wọlé tí a fi àwọn ipò sí láàmì ṣàlàyé ìdí tí olùsọdipúpọ̀ kọ̀ọ̀kan fi gbọdọ̀ wá pẹ̀lú àwọn ipò ohun amútú, pH, àti ìfojúsùn rẹ̀.

Yan ìdánwò gẹ́gẹ́ bí ìbéèrè náà. Iye sẹ́ẹ̀lì tí ó wà láàyè ní báyìí jẹ́ ìbéèrè kíkà, tí a ń dáhùn lábẹ́ maikirosikopu pẹ̀lú bébà iṣẹ́. Bí ìwúkàrà tí a tọ́ yìí ṣe ń mí lọ́wọ́lọ́wọ́ tó jẹ́ ìbéèrè nípa òṣùwọ̀n iṣẹ́, tí a ń dáhùn pẹ̀lú aago ìdíwọ̀n àkókò àti àwọn túùbù tí a ṣàkóso. Methylene blue ń ṣiṣẹ́ fún àwọn méjèèjì, ṣùgbọ́n kì í ṣiṣẹ́ fún wọn nínú túùbù kan náà ní àkókò kan náà.