Búlúù methylene fún fífi àwọ̀ sí DNA àti RNA: lílò nínú jélì àti lórí mẹ́ńbírénì

Akẹ́kọ̀ọ́ kan ṣe ìyapa nínú jélì agarose, ó fi búlúù methylene kun un, kò sì rí nǹkan kan níbi tí ó ti retí láti rí ìlà tó hàn kedere. Ní ibi iṣẹ́ tó tẹ̀ lé e, olùwádìí kan tó ti gba oyè dókítà fi àwọ̀ láti inú ìgò búlúù kan náà sí mẹ́ńbírénì Northern, ó sì rí àwọn ìlà ribosome tó hàn kedere láàárín ìṣẹ́jú mẹ́ta. Akẹ́kọ̀ọ́ náà pinnu pé iṣẹ́ jélì náà kò yọrí sí rere. Iṣẹ́ jélì náà kò kùnà. Iṣẹ́ méjèèjì yàtọ̀ síra, àwọ̀ kan náà sì ń dáhùn sí wọn pẹ̀lú agbára ìwárí tó yàtọ̀, àwọ̀ abẹ́lẹ̀ tó yàtọ̀, àti àwọn òfin tó yàtọ̀ fún ohun tí a ó ṣe lẹ́yìn náà.

Fífi búlúù methylene sí DNA àti fífi búlúù methylene sí RNA ní kẹ́mísírì kan náà, ṣùgbọ́n ète wọn yàtọ̀. Nínú jélì, àwọ̀ náà ń fi iye ásíìdì núkléíkì tó wà nínú àgbékalẹ̀ aláhò hàn. Lórí mẹ́ńbírénì, ó ń fi hàn bóyá ìgbéwọlé náà ṣiṣẹ́ àti bóyá a kó iye àpẹẹrẹ tó dọ́gba sí àwọn ọ̀nà ìyapa. Nígbà tí ìyàtọ̀ yìí bá ṣe kedere, àwọn ìlànà, ààlà ìwárí, àti ààlà ìbámu á túbọ̀ yé ni.

Ìdáhùn ní ṣókí

Búlúù methylene jẹ́ àwọ̀ onílẹ̀ pẹlẹbẹ tó ní ẹ̀rù elẹ́kítíríkì rere, tí ó ń so mọ́ àwọn ásíìdì núkléíkì láìsí ìsopọ̀ kóválẹ́ǹtì, tí a sì lè tú ìsopọ̀ náà ká. Ó ń ṣe bẹ́ẹ̀ nípasẹ̀ àpapọ̀ ìfàmọ́ra elẹ́kítíríkì sí phosphate, yíyọ sínú àárín àwọn tọkọtaya base, àti sísopọ̀ mọ́ ọ̀nà kékeré tó wà lórí DNA. Agbára láti tú ìsopọ̀ náà ká ni kókó náà. A lè fi àwọ̀ sí àwọn ìlà, wo wọ́n lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ tí ojú rí, ya àwòrán wọn, lẹ́yìn náà yọ àwọ̀ kúrò tàbí sọ àpẹẹrẹ náà di mímọ́ fún ṣíṣe ẹ̀dà DNA, hybridization, tàbí fífi probe tún ṣàyẹ̀wò rẹ̀.

Fún fífi búlúù methylene sí DNA oní-okùn méjì nínú jélì agarose, àdàpọ̀ ìyára tí a sábà máa ń lò jẹ́ 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) nínú omi, pẹ̀lú fífi àwọ̀ sí i fún bí ìṣẹ́jú 15 àti yíyọ àwọ̀ kúrò nínú omi fún bí ìṣẹ́jú 15, tí a sì ń wo lórí àpótí ìmọ́lẹ̀ funfun. Fún àwọn mẹ́ńbírénì, àdàpọ̀ ìbílẹ̀ fún Northern blot jẹ́ àwọ̀ 0.02 sí 0.04 percent nínú sodium acetate ní pH tó sún mọ́ 5.2, fífi àwọ̀ sí i fún ìṣẹ́jú díẹ̀ lẹ́yìn ìgbéwọlé àti fífi àpẹẹrẹ dúró ṣinṣin, lẹ́yìn náà fífi omi ṣan án àti yíyọ gbogbo àwọ̀ kúrò kí hybridization tó bẹ̀rẹ̀. Agbára ìwárí rẹ̀ kò ga: láti àwọn mẹ́wàá sí ọgọ́rọ̀ọ̀rún nanograms fún ìlà jélì kọ̀ọ̀kan ní ipò tó dára, àwọn ìtọ́sọ́nà tó ṣọ́ra sì ń sọ 0.5 sí 1 microgram. Èyí ga ju iye tí ethidium bromide àti àwọn àwọ̀ SYBR lè rí lọ ní ọ̀pọ̀ ìpele ìlọ́po mẹ́wàá. Lórí àwọn mẹ́ńbírénì, kò sí ààlà ìwárí kan ṣoṣo tó wúlò fún transcript kan, nítorí àwọ̀ náà máa ń fi RNA ribosome tó pọ̀ àti gbogbo ohun tí a kó sí i hàn ní pàtàkì. Má ṣe rọ́pò ohun èlò nínú èyíkéyìí nínú àdàpọ̀ wọ̀nyí pẹ̀lú ojútùú àfikún oúnjẹ tí a ń tà fún aráàlú. Àwọn ọ̀nà tí a ti fìdí wọn múlẹ̀ gbára lé àwọ̀ tó yẹ fún ìtúpalẹ̀, àwọn ojútùú buffer tí a mọ àkópọ̀ wọn, àti mímú ohun èlò lọ́nà tí kò ní RNase níbi tí RNA bá wà.

Bí ìsopọ̀ ṣe ń ṣiṣẹ́, àti ibi tí ó ti lè ṣi ni lọ́nà

Àwòṣe tó wúlò ní apá mẹ́ta. Àkọ́kọ́, ètò àwọn òrùka tó ní ẹ̀rù elẹ́kítíríkì rere ń fà mọ́ ẹ̀yìn phosphate tó ní ẹ̀rù elẹ́kítíríkì odi. Àwọn ìwádìí spectroscopy fi hàn pé ìfàmọ́ra elẹ́kítíríkì yìí ló lágbára jù nígbà tí iyọ̀ bá kéré, nígbà tí àwòṣe àti ìṣípò àwọn molecule fi yíyọ sínú àárín àwọn tọkọtaya base àti sísopọ̀ mọ́ ọ̀nà kékeré hàn gẹ́gẹ́ bí àwọn ọ̀nà ìsopọ̀ tó dúró ṣinṣin fún DNA oní-okùn méjì, gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàkótán nínú ìwádìí spectroscopy lórí ìsopọ̀ búlúù methylene mọ́ DNA. Èkejì, ó ní ìfẹ́ díẹ̀ sí GC, pẹ̀lú àwọn àwòṣe tó fi àwọn ìgbésẹ̀ CpG àti GpC síwájú, àti àwọn àdánwò tó sọ pé ó fẹ́ràn sísopọ̀ mọ́ àwọn okùn méjì tí GC pọ̀ nínú wọn nínú iṣẹ́ lórí àwọn ìfẹ́ búlúù methylene fún yíyọ sínú àárín àwọn tọkọtaya base, ṣùgbọ́n ó tún ń so mọ́ àwọn okùn méjì AT. Fífi àwọ̀ sí àpẹẹrẹ ní ojoojúmọ́ kò yan ọ̀wọ́ base kan pàtó. Ẹ̀kẹta, DNA oní-okùn kan àti RNA ń so mọ́ ọn ní pàtàkì nípasẹ̀ ìfàmọ́ra elẹ́kítíríkì àti títò pọ̀ mọ́ àwọn base tí ó lè dé àti àwọn agbègbè oní-okùn méjì; ìdí nìyẹn tí bí àwọ̀ ṣe lágbára fi ń yàtọ̀ pẹ̀lú gígùn, ọ̀wọ́ base, àti ìṣètò kejì.

Àbájáde méjì ló tẹ̀ lé èyí. Nítorí pé ìsopọ̀ náà kì í ṣe kóválẹ́ǹtì, fífọ̀ lè yọ àwọ̀ kúrò. Àwọn ìlà polyacrylamide ń rẹ̀ ní kíákíá àyàfi tí a bá mọ̀ọ́mọ̀ mú wọn dúró ṣinṣin, irú ọ̀nà kan sì wà fún fífi wọn dúró títí láé gan-an nítorí fífi àwọ̀ sí wọn lọ́nà déédéé jẹ́ fún ìgbà díẹ̀, gẹ́gẹ́ bí Soto àti Draper ṣe ṣàlàyé fún àwọn jélì PAGE. Nítorí pé àwọ̀ náà jẹ́ ohun tó ń jẹ́ kí ìmọ́lẹ̀ fa ìṣesí kẹ́míkà, fífi DNA tí a ti fi àwọ̀ sí sí ìmọ́lẹ̀ tó lágbára fún ìgbà pípẹ́ níbi tí oxygen wà lè fa oxidation guanine, kí ó sì gé apá kan lára àwọn okùn níkẹyìn; iṣẹ́ lórí oxidation guanine tí búlúù methylene ń mú ṣẹlẹ̀ nípasẹ̀ ìmọ́lẹ̀ ṣàlàyé ọ̀nà yìí ní kíkún. Wíwo rẹ̀ ní ṣókí lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ funfun ń yẹra fún ìpalára UV tí a mọ̀ dáadáa nínú àwọn ìlànà ethidium bromide ìbílẹ̀, àǹfààní yẹn sì jẹ́ òtítọ́ fún gbígba DNA padà láti lò ó síwájú. Ìmọ́lẹ̀ tí ojú rí rọrùn sí àpẹẹrẹ ju UV lọ, ṣùgbọ́n kò túmọ̀ sí pé kò lè ṣe ìpalára. Jẹ́ kí àkókò ìmọ́lẹ̀ kúrú nígbà tí a bá fẹ́ ṣe ẹ̀dà DNA náà. Fún ẹ̀kúnrẹ́rẹ́ kẹ́mísírì ìmọ́lẹ̀ tó wà lẹ́yìn ìṣọ́ra yẹn, wo àwọn ọ̀nà méjì nínú kẹ́mísírì ìmọ́lẹ̀ búlúù methylene. Fún tọkọtaya redox àti àwọn ipò ẹ̀rù elẹ́kítíríkì tó ṣàlàyé ìdí tí fọ́ọ̀mù tí oxidation ti ṣẹlẹ̀ sí fi ń so mọ́ DNA àti ìdí tí fọ́ọ̀mù tí reduction ti ṣẹlẹ̀ sí kì í ṣe bẹ́ẹ̀, wo kẹ́mísírì ìṣètò àti àwọn àbùdá búlúù methylene.

Iṣẹ́ àkọ́kọ́: fífi àwọ̀ sí ohun tó wà nínú jélì

Fífi àwọ̀ sí jélì ń dáhùn ìbéèrè kan: ṣé ásíìdì núkléíkì tó wà nínú ìlà yìí pọ̀ tó kí ojú lè rí i? DNA oní-okùn méjì nínú agarose ni ọ̀ràn tí a ti ṣàlàyé rẹ̀ dáadáa jù. Ọ̀nà àkọ́kọ́ tí Flores àti àwọn alábàáṣiṣẹ́ rẹ̀ fi búlúù methylene sí jélì fìdí ìlànà ìyára 0.02 percent múlẹ̀ lórí agarose 1 percent, ó sì fi hàn pé a lè gba DNA padà kí a sì ṣe ẹ̀dà rẹ̀ ní àṣeyọrí lẹ́yìn náà. Ìlànà olùpèsè kan náà wà lórí ojú ìwé ọjà búlúù methylene ti IBI Scientific, tí ó ṣe àkọsílẹ̀ àdàpọ̀ 0.04 percent fún mẹ́ńbírénì àti irú ìlànà ìyára fún jélì lẹ́gbẹ̀ẹ́ ara wọn.

Ìlànà iṣẹ́ tó ṣeé tẹ̀ lé:

1. Ṣe ìyapa nínú jélì bí ó ti yẹ. Fi àwọ̀ sí i lẹ́yìn electrophoresis, kì í ṣe nígbà tí ó ń lọ, àyàfi tí a bá ti fìdí ìgbéwọlé tàbí agbára ìyapa múlẹ̀ fún ọ̀nà tí a ṣàtúnṣe.
2. Rì í sínú búlúù methylene 0.02 percent w/v nínú omi tí a ti sọ di mímọ́ nípasẹ̀ distillation, kí o sì máa mì í rọra, fún bí ìṣẹ́jú 15.
3. Yọ àwọ̀ kúrò nípa yíyí omi padà ní ọ̀pọ̀ ìgbà, fún bí ìṣẹ́jú 15 lápapọ̀, títí àwọ̀ abẹ́lẹ̀ àgbékalẹ̀ náà yóò fi dín kù tí àwọn ìlà yóò sì hàn kedere.
4. Ya àwòrán rẹ̀ kíákíá lórí ohun èlò ìmọ́lẹ̀ funfun.

Agarose àti polyacrylamide kì í hùwà bákan náà. Agarose ń pa àwọ̀ mọ́ sínú àgbékalẹ̀ rẹ̀, nítorí náà yíyọ àwọ̀ kúrò ni ìgbésẹ̀ tó ń pẹ́. Àwọn jélì polyacrylamide tín-ín-rín ń gba àwọ̀ ní kíákíá, ṣùgbọ́n wọ́n tún ń pàdánù àwọ̀ ní kíákíá; èyí ń ràn gígé àpẹẹrẹ jáde fún lílò síwájú lọ́wọ́, ṣùgbọ́n ó ń ṣòro fún pípa àkọsílẹ̀ mọ́ pẹ́. A lè fi àdàpọ̀ 0.02 percent kan náà tọ́ka sí ibi tí àwọn oligonucleotide tí a ṣe ní yàrá ìwádìí wà nínú polyacrylamide láàárín ìṣẹ́jú 20 sí 30, pẹ̀lú fífọ̀ wọ́n pẹ̀lú omi léraléra, ní títẹ̀lé àwọn ọ̀nà PAGE tí a ti fìdí múlẹ̀ ní irú ìlànà Current Protocols. A ti ròyìn àwọn irú àdàpọ̀ tó fẹ́rẹ̀ẹ́ gan-an, ní àyíká 0.0002 percent nínú TBE tí a ti fi omi pọ̀ sí, fún àwọn oligo tí a fẹ́ lò síwájú, lórí ọ̀pọ̀ wákàtí, ṣùgbọ́n ẹ̀rí tó ṣe àtìlẹ́yìn fún wọn kò lágbára tó.

Ìyàtọ̀ láàárín DNA àti RNA ṣe pàtàkì. DNA oní-okùn méjì ń fúnni ní ìsopọ̀ tí ìṣètò rẹ̀ lágbára jù. RNA àti DNA oní-okùn kan ń gba àwọ̀, ṣùgbọ́n ó rọ̀ ju ti DNA oní-okùn méjì lọ, ó sì ṣòro láti sọ tẹ́lẹ̀ bí yóò ṣe rí. Fún àwọn jélì RNA agarose tí ó ní formaldehyde, ọ̀pọ̀ yàrá ìwádìí kì í fi àwọ̀ búlúù sí RNA nínú jélì; wọ́n kọ́kọ́ gbé RNA sí mẹ́ńbírénì, wọ́n sì fi àwọ̀ sí i níbẹ̀. Ìgbésẹ̀ yẹn ń rọ́pò àmì jélì tí kò lágbára pẹ̀lú àmì mẹ́ńbírénì tó ṣe kedere sí i, ó sì tún ń fúnni ní àkọsílẹ̀ iye tí a kó sí i.

Iṣẹ́ kejì: fífi àwọ̀ sí ohun tó wà lórí mẹ́ńbírénì

Fífi àwọ̀ sí mẹ́ńbírénì ń dáhùn ìbéèrè míì: ṣé ìgbéwọlé ṣiṣẹ́, ṣé a sì lè fi àwọn ọ̀nà ìyapa wéra? Lílò ìbílẹ̀ rẹ̀ ni àwọ̀ Northern blot ti Herrin àti Schmidt tí a lè yọ kúrò, tí ó bẹ̀rẹ̀ pẹ̀lú àwọ̀ 0.04 percent nínú sodium acetate 50 mM ní pH 5.0 fún ìṣẹ́jú 2 sí 3, pẹ̀lú fífi omi ṣan án, tí a sì lè yọ kúrò pẹ̀lú SDS tí a ti fi omi pọ̀ sí nínú SSPE kí hybridization tó bẹ̀rẹ̀.

Irú ọ̀nà òde òní tí a ń lò lọ́pọ̀lọpọ̀ ń lọ báyìí:

1. Gbé RNA tàbí DNA tí a ti tú àwọn okùn rẹ̀ yà sí nylon tàbí nitrocellulose, lẹ́yìn náà mú un dúró ṣinṣin nípasẹ̀ ìsopọ̀ àgbélébùú UV tàbí fífi sí ooru kí àpẹẹrẹ má bàa sọnù nígbà fífi àwọ̀ sí i.
2. Kò pọn dandan ṣùgbọ́n a sábà máa ń ṣe é: jẹ́ kí mẹ́ńbírénì náà rì nínú acetic acid 5 percent fún bí ìṣẹ́jú 15.
3. Fi àwọ̀ sí i fún ìṣẹ́jú 5 sí 10 nínú búlúù methylene 0.02 sí 0.04 percent nínú sodium acetate 0.3 sí 0.5 M ní pH tó sún mọ́ 5.2.
4. Fi omi ṣan án, kí o sì yọ àwọ̀ kúrò nínú omi fún ìṣẹ́jú 5 sí 15, ṣe àkọsílẹ̀ àwòrán, lẹ́yìn náà yọ àwọ̀ tó ṣẹ́ kù kúrò kí hybridization tó bẹ̀rẹ̀.

Nylon tó ní ẹ̀rù elẹ́kítíríkì rere ni a ń lò jù lọ fún iṣẹ́ Northern. Nitrocellulose náà ń ṣiṣẹ́ pẹ̀lú ìlànà acetic acid àti acetate kan náà. A ń lo àwòrán náà láti jẹ́rìí ìgbéwọlé, láti fi àwọn ìlà 28S àti 18S wéra (tàbí 23S àti 16S fún RNA bakitéríà), láti samisi àwọn àmì ìwọ̀n àti àwọn ohun èlò ìfiwéra, àti láti pa àkọsílẹ̀ ìsọdọ̀gba gbogbo RNA mọ́ ní ìwọ̀n àfojúsùn. Àwọn ọ̀nà Northern tí a ti tẹ̀ jáde ń wọn àwọn ìlà ribosome tí a ti fi àwọ̀ sí láti ṣàyẹ̀wò iye tí a kó sí àwọn ọ̀nà ìyapa, pẹ̀lú iṣẹ́ ìmọ̀ sáyẹ́ǹsì wàrà tó lo àwọn ìlà ribosome tí a fi búlúù methylene sí fún ìsọdọ̀gba. A lè fi àwọn mẹ́ńbírénì Southern hàn lọ́nà kan náà, ṣùgbọ́n lílò àwọ̀ náà fún ṣíṣàyẹ̀wò iye tí a kó sí i àti ìgbéwọlé nínú Northern ti fìdí múlẹ̀ púpọ̀ sí i, a sì máa ń tú àwọn okùn DNA Southern yà kí ìgbéwọlé tó bẹ̀rẹ̀, nítorí náà àwọn iye agbára ìwárí nínú jélì kò kan án ní tààrà.

Ààlà ìwárí àti àwọ̀ abẹ́lẹ̀: ibi tí búlúù ti ń ṣẹ́gun kéré

Ìfiwéra tó wà nísàlẹ̀ jẹ́ àfojúsùn ní mọ̀ọ́mọ̀. Bí àwọ̀ ṣe ń ṣiṣẹ́ dá lórí ìpín jélì, fífẹ̀ ìlà, àwọn ohun èlò ìmọ́lẹ̀, àti bí a ṣe ń tẹ̀ lé ìlànà yíyọ àwọ̀ kúrò. Wo nọ́ńbà kọ̀ọ̀kan gẹ́gẹ́ bí ìpele ìwọ̀n, kì í ṣe iye pàtó tí a dá lójú.

Ìṣàkóso àwọ̀ abẹ́lẹ̀ ló ń pinnu bóyá àmì tí kò lágbára náà ṣeé lò. Àwọ̀ tí kò so mọ́ àpẹẹrẹ ní àwọ̀ tó jinlẹ̀ gan-an, nítorí náà ìyàtọ̀ tó jẹ́ kí a rí àwọn ìlà ń wá láti yíyọ àwọ̀ tí kò so mọ́ àpẹẹrẹ kúrò láìyọ èyí tó so mọ́ ọn. Àwọ̀ tí ó ní ìfojúrí tó ga sí i kì í sábà mú agbára ìwárí pọ̀ sí i. Ohun tí ó ń ṣe ní pàtàkì ni fífi àkókò yíyọ àwọ̀ kúrò kún un. Ṣe àdánwò àwọn iye àpẹẹrẹ tí a dín kù ní ìpele lórí jélì, mẹ́ńbírénì, àti kámẹ́rà gan-an tí o fẹ́ lò, kí o sì lo ààlà nìkan níbi tí àpapọ̀ ìjinlẹ̀ àwọ̀ ti ń bá iye àpẹẹrẹ tí a fi sí i pọ̀ ní ìbámu. Búlúù methylene ń ṣe àtìlẹ́yìn fún ìsọdọ̀gba iye àpẹẹrẹ ní ìwọ̀n àfojúsùn. Kì í ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n tó lè bo ààlà iye tó gbòòrò, nítorí agbára mẹ́ńbírénì, ìṣiṣẹ́ ìgbéwọlé, ìkúnwọ̀n, àti yíyọ àwọ̀ kúrò ń yàtọ̀ láti ọ̀nà ìyapa kan sí òmíràn.

Ààlà ìbámu: ohun tí a ṣì lè ṣe lẹ́yìn fífi àwọ̀ sí i

A ti fi hàn pé a lè ṣe ẹ̀dà DNA lẹ́yìn fífi àwọ̀ búlúù sí i. Flores àti àwọn alábàáṣiṣẹ́ rẹ̀ gé àwọn ìlà agarose tí a ti fi àwọ̀ sí jáde, wọ́n gba DNA padà, wọ́n so àwọn ege rẹ̀ pọ̀, wọ́n sì fi í sínú sẹ́ẹ̀lì; wọ́n ròyìn pé ṣíṣe ẹ̀dà rẹ̀ dára ju lẹ́yìn lílo ethidium bromide pẹ̀lú UV lọ. Ìdí tó ṣeé ṣe ni ìpalára ìmọ́lẹ̀ tó dín kù, kì í ṣe àǹfààní kankan láti ọ̀dọ̀ àwọ̀ fúnra rẹ̀. Jẹ́ kí àkókò tí ìmọ́lẹ̀ funfun fi ń tàn sí i kúrú, kí o sì sọ DNA tí o gba padà di mímọ́ nípasẹ̀ ìlànà ìyọkúrò DNA láti inú jélì tí a ń lò déédéé.

Ẹ̀rí fún PCR àti kíkà ọ̀wọ́ base kò pọ̀ tó. Àwọ̀ tó ṣẹ́ kù ń so mọ́ àwọn ásíìdì núkléíkì, nítorí náà yọ àwọ̀ kúrò kí o sì sọ àpẹẹrẹ di mímọ́ kí àwọn ìgbésẹ̀ ensáyímù tó bẹ̀rẹ̀. A retí pé DNA tí a ti sọ di mímọ́ dáadáa láti inú jélì búlúù yóò ṣiṣẹ́, ṣùgbọ́n a kò tíì wọn dáadáa iye àwọ̀ tó lè tẹ̀ lé àpẹẹrẹ lọ ní tààrà láìdí àwọn polymerase àti àwọn kẹ́mísírì kíkà ọ̀wọ́ base lọ́wọ́. Má ṣe rò pé kò ní fa ìṣòro.

Hybridization blot bá fífi àwọ̀ sí i mu nígbà tí a bá tẹ̀ lé ètò náà ní pípé: ìgbéwọlé, fífi àpẹẹrẹ dúró ṣinṣin, fífi àwọ̀ sí i, ṣíṣe àkọsílẹ̀ àwòrán, yíyọ àwọ̀ kúrò, hybridization. Ètò yẹn ni àpẹrẹ Herrin àti Schmidt. Fífi àwọ̀ sí i kí ìgbéwọlé tó bẹ̀rẹ̀, tàbí fífi yíyọ àwọ̀ kúrò sílẹ̀, jẹ́ ọ̀nà míì tí ó nílò ìfìdímúlẹ̀ tirẹ̀. Lẹ́yìn yíyọ àwọ̀ kúrò, yíyọ probe kúrò àti fífi probe tún ṣàyẹ̀wò rẹ̀ ń tẹ̀ síwájú bí ó ti yẹ. Fún fífi àwọ̀ sí sẹ́ẹ̀lì pẹ̀lú ẹbí àwọ̀ kan náà àti ìdí tí ìlànà àpẹẹrẹ tí a ti mú dúró ṣinṣin lórí fíìmù kò fi kan àwọn ọ̀nà fún sẹ́ẹ̀lì alààyè, wo àtẹ àpẹẹrẹ fífi àwọ̀ sí ohun tí a ń wo pẹ̀lú maikirosikopu.

Gígé àwọn ìlà jáde ń ṣiṣẹ́ fún agarose tí a fẹ́ lò síwájú àti fún àwọn oligo PAGE tí a fi búlúù tọ́ka sí, níwọ̀n ìgbà tí a bá yẹra fún ọ̀nà fífi wọn dúró títí láé. Yíyọ àpẹẹrẹ jáde nípasẹ̀ elẹ́kítíríkì lẹ́yìn yíyọ àwọ̀ kúrò ṣeé ṣe ní ìlànà kẹ́míkà fún ohun tó ń so mọ́ àpẹẹrẹ tí a lè tú ká, ṣùgbọ́n dátà ìkórè láti àwọn àdánwò tí a ṣàkóso tó jẹ́ ti búlúù methylene ní pàtó kò pọ̀. Yọ iyọ̀ kúrò tàbí mú àpẹẹrẹ rọ̀ sílẹ̀ lẹ́yìn tí o bá yọ ọ́ jáde.

Àwọn ìṣòro tó ń tún ara wọn ṣe

Àwọn ìlà jélì tí kò hàn dáadáa sábà máa ń túmọ̀ sí pé iye àpẹẹrẹ kéré jù fún àwọ̀ tí a ń rí nípasẹ̀ àwọ̀ ojú, pàápàá fún àwọn àpẹẹrẹ RNA tàbí oní-okùn kan tí ó kúkúrú. Kó iye púpọ̀ sí i sí jélì, lo àwọ̀ tuntun, mú àkókò fífi àwọ̀ sí i gùn kí o tó mú ìfojúrí rẹ̀ pọ̀ sí i, kí o sì dá yíyọ àwọ̀ kúrò dúró ní kutukutu. Jélì tí ó jẹ́ búlúù ní gbogbo rẹ̀ láìsí ìyàtọ̀ sábà máa ń túmọ̀ sí fífi àwọ̀ pọ̀ jù tàbí àìyí omi padà tó. Rírẹ̀ àwọn ìlà PAGE jẹ́ kẹ́mísírì tí a retí, kì í ṣe fífi àwọ̀ tí ó kùnà. Ya àwòrán ní kíákíá. Àwọ̀ abẹ́lẹ̀ mẹ́ńbírénì tí kò dọ́gba ń tọ́ka sí ìlọ́po, àwọn ìṣù afẹ́fẹ́, àmì ìka, mímì tí kò dọ́gba, tàbí ìgbéwọlé tí kò pé ní gbogbo ibi. Má ṣe túmọ̀ èyí sí pé iye tí a kó sí àwọn ọ̀nà ìyapa kò dọ́gba láìsí àpẹẹrẹ ìṣàkóso hybridization. Àpẹrẹ àwọn ìlà ribosome tí ó tàn ká tí kò sì hàn dáadáa lè túmọ̀ sí ìbàjẹ́ RNA, ṣùgbọ́n ó tún lè jẹ́ ìgbéwọlé tí kò pé, gbogbo RNA tí ó kéré jù (àwọn ọ̀nà ìyapa déédéé máa ń ní láti micrograms díẹ̀ sí àwọn mẹ́wàá micrograms), tàbí yíyọ àwọ̀ kúrò ju bó ṣe yẹ lọ. Àwọ̀ náà ń fi RNA ribosome tó pọ̀ hàn. Kò ń fi transcript kan pàtó hàn. Iṣẹ́ yẹn jẹ́ ti probe.

Ààbò àti bí a ṣe ń mú ohun èlò láìsọ àsọdùn

Búlúù methylene rọrùn láti mú ju ethidium bromide lọ, ṣùgbọ́n kì í ṣe ohun tí kò lè ṣe ìpalára. Ìwé dátà ààbò MilliporeSigma tó wà lọ́wọ́lọ́wọ́ pín àwọ̀ náà sí Ẹ̀ka 4 fún májèlé kíákíá nípasẹ̀ ẹnu, ó sì sọ pé ó léwu bí a bá gbé e mì, àti pé a gbọ́dọ̀ sọ ọ́ nù nípasẹ̀ ọ̀nà ìdọ̀tí tí a fọwọ́ sí gẹ́gẹ́ bí SDS búlúù methylene ti Sigma-Aldrich. Ethidium bromide ní àwọn ìkìlọ̀ tó lágbára sí i nípa ìpalára sí ohun ìní àbùdá, pẹ̀lú ìfura sí àwọn ipa lórí sẹ́ẹ̀lì ìbímọ nínú SDS ethidium bromide ti Sigma-Aldrich, a sì sábà máa ń ya àwọn jélì àti ojútùú rẹ̀ sọ́tọ̀ gẹ́gẹ́ bí ìdọ̀tí kẹ́míkà tó léwu, gẹ́gẹ́ bí ìtọ́sọ́nà àwọ̀ ásíìdì núkléíkì ti Thermo Fisher ṣe sọ. Tẹ̀ lé SDS àti òfin ilé-iṣẹ́ fún méjèèjì. Pa àwọ̀ gbígbẹ mọ́ ní ibi gbígbẹ, kí àpò rẹ̀ sì wà ní títì dáadáa; tún àwọ̀ tí a ń lò lò kìkì bí ìlànà bá gbà á láyè; tọ́jú àwọn mẹ́ńbírénì tí a ti fi àwọ̀ sí ní gbígbẹ láàárín àwọn bébà àlẹ̀mọ́; kí o sì ya àwòrán àwọn jélì kí àwọn ìlà tó tàn ká.

Rántí gbólóhùn fún tábìlì iṣẹ́ yìí. Àwọn jélì ń dán bí a ṣe lè rí àpẹẹrẹ wò ní iye gíga lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ funfun. Àwọn mẹ́ńbírénì ń dán ìgbéwọlé àti iye tí a kó sí i wò kí probe tó ṣe iṣẹ́ tó ní agbára ìwárí gíga. Àwọ̀ kan ń ṣe iṣẹ́ méjèèjì, pẹ̀lú agbára ìwárí tí kò ga, ìsopọ̀ tí a lè tú ká, àti ètò àwọn ìgbésẹ̀ iṣẹ́ tí a gbọ́dọ̀ tẹ̀ lé ní pípé.