Yangi metilen ko‘ki va retikulotsitlarni bo‘yash: alohida bo‘yoq va tirik hujayralar usuli

Talaba retikulotsitlarni sanashga tayyorlanadi, metilen ko‘kiga buyurtma beradi, uni qon bilan aralashtiradi va deyarli hech narsa ko‘rmaydi. Uning kursdoshi yangi metilen ko‘ki deb yorliqlangan idishdagi bo‘yoqdan foydalanadi va eritrotsitlarning bir qismi ichida aniq ko‘k ipchalarni ko‘radi. Birinchi talaba ikkinchi idishdagi bo‘yoq yangiroq yoki konsentratsiyasi yuqoriroq deb o‘ylaydi. Aslida, ikkalasi ham emas. Unda boshqa molekula bor.

Bu sohadagi chalkashliklarning aksariyati aynan shu tushunchaviy xatodan kelib chiqadi. Nomi yangi metilen ko‘ki metilen ko‘kining takomillashtirilgan partiyasi degan taassurot uyg‘otadi. Kimyoviy jihatdan esa unday emas. Yangi metilen ko‘ki N — o‘z Colour Index raqami, o‘z o‘rinbosar guruhlar joylashuvi va gematologiyada o‘z standartlashtirilgan vazifasiga ega alohida fenotiazin bo‘yog‘i. Bu farq aniq bo‘lgach, usulning qolgan jihatlari — nega bo‘yash vaqtida hujayralar tirik bo‘lishi kerakligi, nima retikulotsit hisoblanishi, Geynts tanachalarining o‘rni va brilliant krezil ko‘ki qachon qo‘llanishi — tushunarli bo‘ladi.

Qisqa javob

Gematologik reagent bo‘lgan yangi metilen ko‘ki N odatda PubChem’ning yangi metilen ko‘ki haqidagi yozuvida Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formulasi C18H22ClN3S sifatida ko‘rsatiladi. Oddiy metilen ko‘ki esa PubChem’dagi yozuvida metiltioniniy xlorid, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formulasi C16H18ClN3S sifatida berilgan. Tuzilish jihatidan yangi metilen ko‘kida halqaga birikkan ikkita metil guruhi va etilamino yon zanjirlari mavjud; metilen ko‘kida esa dimetilamino guruhlari bor. Bu farq bo‘yash xususiyatlarini o‘zgartiradi. Gematologiya darsliklarida oddiy metilen ko‘ki retikulotsitlarni nisbatan sust bo‘yashi, yangi metilen ko‘ki esa ularni to‘qroq va bir tekisroq bo‘yashi qayd etiladi. Bu taqqoslash ScienceDirect’ning yangi metilen ko‘ki haqidagi mavzusida umumlashtirilgan.

Ha, yangi metilen ko‘ki supravital bo‘yoqdir. Supravital bo‘yash — tirik hujayralarni organizmdan ajratib olgandan keyin va fiksatsiyadan oldin bo‘yash demakdir; bu ta’rif NCBI’ning supravital bo‘yash tamoyillari haqidagi sharhida berilgan. Yangi metilen ko‘ki ham, brilliant krezil ko‘ki ham shu toifaga kiradi, CLSI retikulotsit standarti esa yangi metilen ko‘kini aynan supravital bo‘yoq sifatida qamrab oladi. Talabalar ba’zan bu usulni fiksatsiyalangan surtmalarni Romanovskiy usulida bo‘yash bilan bir toifaga qo‘yadilar. Bu yerda bunday tasavvur noto‘g‘ri. Avval fiksatsiya qilinsa, usul ishlamaydi.

O‘xshash bo‘yoq nomlarini farqlamoqchi bo‘lgan o‘quvchilar uchun metil ko‘ki va metilen ko‘ki farqi anionli triarilmetan bo‘yog‘i bilan kationli fenotiazinlar oilasi o‘rtasidagi boshqa, yanada kengroq chalkashlikni yoritadi. Laboratoriyada bo‘yash usullari sharhi supravital usullarni fiksatsiyalangan surtma usullari bilan birga ko‘rib chiqadi, qon hujayralari morfologiyasi bo‘yicha qo‘llanma esa retikulotsitlarni baholash kengroq differensial sanashda qanday o‘rin tutishini ko‘rsatadi.

Katalogga oid bir ogohlantirish: yangi metilen ko‘kining rux xloridli qo‘sh tuz shakli ham mavjud bo‘lib, uning raqami CAS 6586-05-6. Shuning uchun usullar bo‘limida faqat umumiy nom emas, balki tuz shakli va yetkazib beruvchi ham ko‘rsatilishi kerak.

Supravital bo‘yash aslida nima qiladi

Retikulotsit — yadrosini yo‘qotgan, ammo qoldiq ribosomal RNKni saqlab qolgan yosh eritrotsit. Bo‘yalmagan nam preparatda bu RNK ko‘rinmaydi. Supravital bo‘yoq tirik hujayraga kirib, ushbu RNKni cho‘ktiradi yoki ko‘k donachalar va ipchalar ko‘rinishida to‘playdi. Moyli immersiya ostida ko‘rinadigan retikulo-filamentoz material shudir. Demak, bu to‘r bo‘yalishni kutib turgan, oldindan shakllangan skelet emas, balki bo‘yash natijasida hosil bo‘lgan tuzilmadir. Shu sababli protokol o‘zgaruvchilari — bo‘yoq konsentratsiyasi, bufer, qon va bo‘yoq nisbati, harorat, vaqt — bo‘yoq nomi kabi muhim.

Amaliy jihatdan bu ishlarning qat’iy ketma-ketligini talab qiladi: avval antikoagulyantli qonni bo‘yoq bilan aralashtiring, inkubatsiya qiling, keyin surtmalar tayyorlab, ularni fiksatsiyasiz va qo‘shimcha bo‘yashsiz tekshiring. Bo‘yashdan oldingi fiksatsiya yoki xira ipchalarni berkitadigan qo‘shimcha bo‘yash sanash uchun zarur ma’lumotni yo‘qqa chiqaradi.

Yangi metilen ko‘ki bilan retikulotsitlarni bo‘yashning amaliy protokoli

Yagona universal tarkib mavjud emas, shuning uchun ishlatilgan tarkibni qayd eting. Hujjatlashtirilgan uchta variant ularning xilma-xilligini ko‘rsatadi.

Klassik Brecher turidagi usulda kaliy oksalatli, taxminan 0.5 foizli yangi metilen ko‘ki yaxshilab aralashtirilgan EDTAli qon bilan teng hajmlarda aralashtiriladi va xona haroratida taxminan 10 dan 15 daqiqagacha inkubatsiya qilinadi. Ehtiyotkorlik bilan qayta aralashtirilgach, yupqa ponasimon surtmalar tayyorlanadi, havoda quritiladi va fiksatsiyasiz 100x moyli immersiya obyektivi ostida tekshiriladi. NCBI’ning retikulotsitlarni sanash tartibi ushbu ish jarayonini va unda ishlatiladigan sanash ramkasini tavsiflaydi.

Dacie va Lewis variantida sitratli fiziologik eritmadagi 1.0 foizli yangi metilen ko‘ki ishlatiladi. U 2 dan 4 hajmgacha qon bilan aralashtirilib, surtma tayyorlashdan oldin 37 C haroratda 15 dan 20 daqiqagacha saqlanadi. CLSI H44 tartibini uyg‘unlashtirishning yaqinda qo‘llangan variantida pH 7.4 bo‘lgan fosfat buferli fiziologik eritmadagi pastroq, 0.1 foizli eritma ishlatilgan; inkubatsiya 20 C haroratda 10 daqiqa davom etgan va fiksatsiya qilinmagan. Bu 2026-yilgi NMB usulini uyg‘unlashtirish tadqiqotida bayon qilingan.

Sanash qoidalari barcha variantlar uchun bir xil. Hujayrada kamida ikkita alohida ko‘k bo‘yalgan donacha yoki ipcha bo‘lagi bo‘lsa, uni retikulotsit deb hisoblang; bu qoida yakka bo‘yoq cho‘kmasini hisobdan chiqaradi. Kundalik ishda kamida 1,000 eritrotsitni sanang va retikulotsitlar miqdorini foizda ko‘rsating. Foiz past bo‘lganda, statistik jihatdan ko‘proq hujayra sanash talab etiladi. CLSI H44 metodologiyasi sharhida retikulotsitlar miqdori 1 foizga yaqin bo‘lganda, sanashdagi o‘zgaruvchanlikni 5 foizga tushirish uchun taxminan 4,400 hujayra kerakligi qayd etilgan; bu De Gruyter’dagi CLSI H44 sharhida keltirilgan. Miller okulyar diski ko‘p sonli hujayralarni sanashni amaliy jihatdan qulaylashtiradi. Bo‘yoqni filtrlang yoki yangidan tayyorlang, chunki cho‘kma donador kiritmalarga o‘xshab ko‘rinadi.

Shu preparatdagi Geynts tanachalari

Xuddi shu supravital surtma Geynts tanachalarini ham ko‘rsatishi mumkin. Ular qoldiq RNK emas, balki oksidlangan va denaturatsiyalangan gemoglobin to‘plamlaridir. Yangi metilen ko‘ki preparatlarida ular ko‘pincha yakka va membrana yaqinida joylashgan yumaloq tanachalar ko‘rinishida bo‘ladi; retikulo-filamentoz materialga nisbatan ochroq ko‘k rangga bo‘yaladi. Fiksatsiya va qo‘shimcha bo‘yash jarayonida ular yaxshi saqlanmaydi, shuning uchun fiksatsiyalanmagan surtmani tekshiring. Yaqinda qo‘llangan protokolda 20 mikrolitr EDTAli qon 20 mikrolitr 1 foizli yangi metilen ko‘ki bilan aralashtirilgan va 15 daqiqa inkubatsiya qilingan; so‘ng 250 eritrotsit orasida Geynts tanachalari bor hujayralar sanalgan. Bu ushbu tartib bayon qilingan PMC tadqiqotida keltirilgan.

Ikki farq noto‘g‘ri talqin qilishning oldini oladi. Birinchidan, metil binafsha va kristall binafsha Geynts tanachalarini yangi metilen ko‘kiga qaraganda kuchliroq bo‘yaydi; bu ScienceDirect’ning Geynts tanachalari haqidagi mavzusida qayd etilgan. Yangi metilen ko‘ki retikulotsitlar va Geynts tanachalari birgalikda baholanganda qulay tanlovdir, ammo aynan Geynts tanachalari uchun eng kuchli bo‘yoq emas. Ikkinchidan, alfa-talassemiya tashuvchiligidagi HbH kiritmalari supravital bo‘yashdan keyin hujayra bo‘ylab ko‘plab mayda nuqtalar hosil qiladi, klassik Geynts tanachalari esa kamroq, kattaroq va ko‘pincha membrana bilan bog‘liq bo‘ladi. Bo‘yoq cho‘kmasi ularga o‘xshab ko‘rinadigan uchinchi holatdir: u hujayralarning fokus tekisligidan tashqarida yotadi va turli ko‘rish maydonlarida farqlanadi.

Brilliant krezil ko‘ki va yangi metilen ko‘ki farqi

Har ikkala bo‘yoq ham retikulotsitlar uchun supravital bo‘yoqdir, ammo standartlashtirish ulardan biriga ustunlik beradi. Gematologiyada standartlashtirish bo‘yicha xalqaro kengash bilan birgalikda ishlab chiqilgan va CLSI H44 standarti sahifasida keltirilgan CLSI H44-A2 retikulotsit usuli EDTAli qonni yangi metilen ko‘ki bilan bo‘yashni qo‘lda bajariladigan qiyosiy usul sifatida belgilaydi. Klassik gematologiya ta’limi ham ko‘rinish bo‘yicha shu fikrni tasdiqlaydi: yangi metilen ko‘ki ipchalarni to‘qroq va bir tekisroq bo‘yaydi, brilliant krezil ko‘kida esa partiyalar va namunalar orasidagi farq kattaroq bo‘ladi.

Bu maqomga izoh kerak. ICSH analizatorlarni baholash qo‘llanmasi yangi metilen ko‘ki bilan qo‘lda bajariladigan mikroskopiyani etalon qiyoslash yondashuvi sifatida qabul qiladi, ammo uni subyektiv va nisbatan noaniq deb baholaydi; imkoniyat bo‘lsa, oqim sitometriyasiga asoslangan etalon tartiblar afzal ko‘riladi. 2022-yilda 100 namuna taqqoslangan tadqiqotda ishlatilgan analizatorga nisbatan sistematik og‘ish yangi metilen ko‘kiga qaraganda brilliant krezil ko‘kida pastroq bo‘lgan; bu PMC’dagi bo‘yash usullari taqqoslovida bayon qilingan. Talabalar uchun asosli xulosa shunday: yangi metilen ko‘kidan standartlashtirilgan qo‘lda bajariladigan qiyoslash usuli sifatida foydalaning, har qanday mahalliy brilliant krezil ko‘ki usulini unga yoki avtomatlashtirilgan usulga nisbatan tekshiring va har ikkala holatda ham qo‘lda bajariladigan mikroskopiya natijalarida kattaroq tarqoqlikni kuting. Avvalgi standartlashtirish adabiyotlarida ham tijoriy bo‘yoq partiyalari o‘zgaruvchan bo‘lgani sababli, tozalangan Azure B kimyoviy jihatdan tozaroq muqobil sifatida tavsiya etilgan. Bu Marshall’ning Azure B haqidagi tadqiqotida keltirilgan va usullar muhokamasida reagentning tozalik darajasi nega hanuz tilga olinishini tushuntiradi.

Odatdagi xatolardan saqlanish

Muvaffaqiyatsiz preparatlarning aksariyatiga to‘rtta xato sabab bo‘ladi. Yangi metilen ko‘ki N o‘rniga oddiy metilen ko‘kiga buyurtma berish texnika emas, kimyoviy xususiyatlar sababli sust bo‘yalishga olib keladi. Tekshirishdan oldin fiksatsiya yoki qo‘shimcha bo‘yash supravital signalni yo‘qotadi. Bo‘yoq cho‘kmasini donacha deb sanash natijani sun’iy oshiradi; ikki donacha qoidasi va filtrlangan bo‘yoq buning oldini oladi. Retikulotsitlar foizi past bo‘lganda juda kam hujayra sanash aniq ko‘rinadigan, ammo ishonch chegaralari keng bo‘lgan sonni beradi. Har bir xatoda bir xil holat kuzatiladi: mikroskopchi reagent bosqichida belgilangan natija uchun mikroskopni ayblaydi.