Metilen ko‘ki tajribalarida kislorodning reaktiv shakllarini o‘lchash

Ikki laboratoriya o‘zlari metilen ko‘kining antioksidant tajribasi deb ataydigan tajribani o‘tkazadi. Biri bo‘yoq kislorodning reaktiv shakllarini kamaytirishini bildiradi. Ikkinchisi esa ularni hosil qilishini bildiradi. Ikkalasi ham aniq doza–javob egri chiziqlarini ko‘rsatadi. Ikkalasi ham natijalarini halol bayon qiladi. Farq firibgarlik yoki malakasizlikda emas. Gap shundaki, ikki guruh turli yoritish sharoitida, turli savollarga javob beradigan zondlar yordamida turli narsalarni o‘lchagan, keyin esa ikkala javobni ham bir xil so‘z bilan ifodalagan: ROS.

Metilen ko‘kini aniq o‘lchash qiyin, chunki bu molekula kuzatishi kerak bo‘lgan kimyoviy jarayonning o‘zida qatnashadi. Qorong‘ida u donorlar va akseptorlar o‘rtasida elektronlarni tashiydi va yana siklni takrorlashga tayyor holda boshlang‘ich shakliga qaytadi. Yorug‘likda u fotosensibilizatorga aylanib, qo‘zg‘algan triplet holatiga o‘tadi; bu holatdan kislorodga energiya berib singlet kislorod hosil qilishi yoki elektronlarni uzatib radikallar va vodorod peroksid hosil qilishi mumkin. Bu tizimga kiritilgan har qanday zond bo‘yoqning o‘zi ta’sirida oksidlanishi, qaytarilishi, rangsizlanishi yoki optik jihatdan niqoblanishi mumkin. Shu sababli har qanday ROS ko‘rsatkichiga oid birinchi savol hech qachon sonning qiymati haqida bo‘lmaydi. Savol tahlil aslida nimani aniqlashi va bo‘yoq tahlilga qanday ta’sir qilishi haqida bo‘ladi.

Amplex Red: kalibrlangan vodorod peroksid tahlili

Metilen ko‘ki va Amplex Red kombinatsiyasi to‘g‘ri tashkil etilganda, ushbu adabiyotlarda eng asosli juftlik hisoblanadi. Kimyoviy mexanizm o‘ziga xos: xren peroksidazasi vodorod peroksiddan foydalanib, Amplex substratini taxminan birga bir stexiometrik nisbatda fluoressent mahsulot — rezorufinga oksidlaydi. Namunadagi peroksid detektorda fluoressensiya signaliga aylanadi. ROSning odatiy guruhidagi boshqa hech bir shakl bu reaksiyani bevosita yuzaga keltirmaydi.

Hal qiluvchi afzallik — kalibrlash. Sinchkov tadqiqotchi miqdori ma’lum peroksid standartlarini ayni buferda, bir xil peroksidaza va substrat konsentratsiyalarida, bir xil inkubatsiya vaqti hamda optik sozlamalar bilan tekshiradi, so‘ng namunalarni shu egri chiziqqa nisbatan baholaydi. Ushbu usulga asos bo‘lgan ajratib olingan miya mitoxondriyalari tadqiqotida mualliflar aynan shunday yo‘l tutgan: har bir tajriba oxirida ma’lum miqdorda peroksid qo‘shgan va natijalarni ixtiyoriy fluoressensiya birliklarida emas, balki oqsilning har milligrammiga bir daqiqada to‘g‘ri keladigan pikomollar bilan ifodalangan tezlik sifatida keltirgan. Yorug‘lanishni o‘lchovga aylantiradigan narsa shu.

Ushbu tadqiqotdagi uchta jihatni takrorlashga arziydi. Birinchidan, mualliflar signalni peroksidni parchalovchi katalaza bilan tekshirgan. Katalaza qo‘shilganda metilen ko‘ki yuzaga keltirgan fluoressensiya ortishi to‘xtagan; bu signal optik artefakt emas, peroksidga bog‘liq ekanini tasdiqlagan. Ikkinchidan, ular qo‘zg‘atuvchi nurni zatvor bilan to‘sib, namunalar odatdagi yorug‘lik dozasining sakkizdan bir qismini oladigan qilib yoritish ta’sirini bevosita tekshirgan; signal esa atigi to‘qqiz foizga kamaygan. Ular qayd etgan peroksidning to‘qson foizdan ko‘prog‘i o‘lchash paytidagi yorug‘likdan mustaqil bo‘lgan. Uchinchidan, ular peroksidning yo‘qotilishini elektrod yordamida alohida o‘lchab, bo‘yoq ham uning hosil bo‘lishini oshirishini, ham chiqarib tashlanishini sekinlashtirishini aniqlagan. Faqat yakuniy fluoressensiyani qayd etadigan zond bu ikki ta’sirni bir-biridan ajrata olmagan bo‘lardi.

Tahlilda baribir xatolik yuzaga kelishi mumkin bo‘lgan holatlar bor va metilen ko‘ki ularning bir nechtasini yuzaga chiqaradi. Bo‘yoq rezorufin nur chiqaradigan qizil sohada keng diapazonda yorug‘likni yutadi, shuning uchun bo‘yoq konsentratsiyasi yuqori bo‘lganda namuna ichki filtr effektlari orqali o‘z signalini niqoblashi mumkin. Shu sababli standartlardagi bo‘yoq konsentratsiyasi namunalardagidek bo‘lishi kerak. Amplex Red o‘z-o‘zidan ham fotooksidlanishi mumkin, uning mahsuloti rezorufin esa superoksid va peroksid hosil qiladigan fotoredoks sikllariga kirishishi mumkin; tajribada fotosensibilizator ham yoritilayotgan bo‘lsa, bu juda muhim. Amaliy yechim — bo‘yoq va zondni birga yoritish o‘rniga avval metilen ko‘ki namunalarini nurlantirish, keyin ularning alikvotalarini Amplex reagentlari bilan qorong‘ida tahlil qilish. Nihoyat, superoksid dismutaza Amplex signalini shunchaki bostirmaydi: superoksidni peroksidga aylantirish signalni oshirishi mumkin. Fluoressensiyani oshirgan SOD nazorati muvaffaqiyatsiz bo‘lgan emas. U jarayonning oldingi bosqichida superoksid borligini aniqlagan.

DCFDA: nospetsifik oksidlanish indikatori

Metilen ko‘ki va DCFDA juftligi chalkashliklarning aksariyatiga sabab bo‘ladi. DCFH-DA hujayraga kiritiladigan prekursor hisoblanadi. Hujayra ichidagi esterazalar uning asetat guruhlarini ajratib, fluoressensiya bermaydigan DCFHni qoldiradi; DCFH oksidlanganda esa fluoressent DCF hosil bo‘ladi. Uni oksidlaydigan moddalar ro‘yxati uzun: gidroksil radikallari, peroksidaza va gemning oraliq mahsulotlari, azot dioksidi, gipoxlorit kislota va peroksinitritdan hosil bo‘lgan radikallar. Vodorod peroksidning o‘zi uni bevosita amaliy jihatdan ahamiyatli tezlikda oksidlamaydi; peroksidga bog‘liq fluoressensiya uchun odatda jarayonda temir, gem oqsillari yoki peroksidaza kimyosi qatnashishi kerak.

Har bir usullar bo‘limida keltirilishi lozim bo‘lgan tanqid Kalyanaraman va hamkasblarining DCFHni zond sifatida tahlil qilishiga asoslanadi va aynan shu sababli DCFDAni rad etgan miya mitoxondriyalari tadqiqotida umumlashtirilgan. Ular bo‘yoq sekin, stexiometriyasi tavsiflanmagan holda, ishonchli kalibrlashsiz va ROSga kirmaydigan birikmalar bilan ham reaksiyaga kirishishini ko‘rsatgan. Zond o‘zi o‘lchayotgan jarayonni ham kuchaytiradi: DCFHning bir elektronli oksidlanishi DCF radikalini hosil qiladi; u kislorod bilan reaksiyaga kirishib superoksid hosil qiladi, superoksid esa dismutatsiya orqali qo‘shimcha peroksidga aylanadi. Ko‘rsatkich o‘zi qayd etayotgan kimyoviy jarayonni qisman o‘zi yuzaga keltiradi.

Bularning hech biri DCFDAni foydasiz qilmaydi. U aniq identifikatsiya vositasi emas, balki skrining vositasi ekanini anglatadi. DCF fluoressensiyasining ortishi oksidlovchilarga bog‘liq zond oksidlanishi kuchayganini bildiradi. Bu peroksid ko‘payganini anglatmaydi va, albatta, umumiy ROS ko‘payganini ham anglatmaydi: bunday miqdorni hech bir yakka zond o‘lchamaydi. Metilen ko‘ki bo‘yicha avvalgi ishlarda bir mikromolyardan yuqori konsentratsiyalarda DCF oksidlanishiga tayanilib, prooksidant ta’sirlar qayd etilgan; ayni davrdagi boshqa tizimlarda esa peroksid sababli yuzaga keladigan hujayra o‘limidan himoyalanish kuzatilgan. Turli redoks sharoitlarida ayni bo‘yoq uchun ikkala kuzatuv ham to‘g‘ri bo‘lishi mumkin, DCF natijasining o‘zi esa signalga qaysi oksidlovchi sabab bo‘lganini ayta olmaydi. Miya mitoxondriyalari bo‘yicha avvalgi ishning ahamiyati shundaki, u bu skriningni kalibrlangan peroksid o‘lchovi bilan almashtirgan va peroksid yuklamasini bevosita aniqlagan: hatto yuz nanomolyar bo‘yoq ham sinovdan o‘tkazilgan barcha substratlar va nafas olish holatlarida peroksid ajralishini bir necha barobar oshirgan.

DCFDAda metilen ko‘kiga xos yana bir xatolik manbai bor. Bo‘yoq kuchli rangga ega va redoks-faol, shuning uchun hujayradagi ROSdan mustaqil ravishda fluoressensiyani so‘ndirishi, emissiyani kamaytirishi yoki zondni oksidlashi mumkin. Bo‘yoq va zond bor, ammo hujayralar yo‘q bo‘lgan hujayrasiz nazorat shunchaki ixtiyoriy qo‘shimcha emas. Bu bo‘yoq zond bilan o‘zaro ta’sirlashadimi yoki yo‘qmi, shuni ko‘rsatadigan tajribadir.

Spin tutib olish va kislorod yutilishi: kimyoviy tur va oqim

Fluoressent zondlar oksidlanishga moyil biror narsa paydo bo‘lganini ko‘rsatsa, spin tutuvchi reagentlar bilan elektron spin rezonansi uning aynan nima ekaniga yaqinroq javob beradi. Metilen ko‘ki fotokimyosiga oid klassik tadqiqotda bo‘yoq, askorbat va yorug‘likdan hosil bo‘lgan askorbat radikalini aniqlash uchun ESR qo‘llanilgan, so‘ng kislorod yutilishi tajribalarida peroksid hosil bo‘lishi va spin tutib olish tajribalarida temir katalizlaydigan gidroksil radikali hosil bo‘lishi ko‘rsatilgan. Har bir usul boshqalari javob bera olmagan savolga javob bergan: ESR radikalning kimyoviy turini aniqlagan, kislorod yutilishi har qanday fluoressent zonddan mustaqil ravishda reaksiya oqimini ko‘rsatgan, ularning birgalikdagi natijasi esa ayni yoritilgan tizimda ham singlet kislorod, ham radikal yo‘llari ishlayotganini ko‘rsatgan.

1984 yilgi bu natija hanuz ogohlantirishdek qabul qilinadi. Yoritish va qaytaruvchi modda mavjud bo‘lganda bo‘yoq peroksid hosil qilgan, temir mavjud bo‘lganda esa tizim ushbu guruhdagi eng reaktiv shakl — gidroksil radikalini hosil qilgan. Mualliflar buni ko‘zdagi askorbat bilan bog‘lab, oftalmologiyada ehtiyotsiz qo‘llashni shubha ostiga olgan. Hozirgi o‘quvchilar sharoitlarga e’tibor berishi kerak: yorug‘lik, qaytaruvchi modda va temir. Ulardan istalgan birini olib tashlasangiz, bu yo‘l susayadi yoki yo‘qoladi.

Kislorod elektrodlari boshqa jihatdan o‘z o‘rniga ega. Klark turidagi elektrod kislorodning sof sarfini o‘lchaydi; bu bo‘yoq orqali kechadigan redoks kimyosi molekulyar kislorodni sarflayotganini tasdiqlaydi va hech qanday fluoressensiya artefakti soxtalashtira olmaydigan kinetikani beradi. U mahsulotni aniqlamaydi. Peroksid, superoksid va suv hosil bo‘lishi hamda singlet kislorodning so‘nishi — bularning barchasida kislorod sarflanadi. Kimyoviy tur aniqlanmagan oqim ham, oqim aniqlanmagan kimyoviy tur ham to‘liq ma’lumot bermaydi; shu sababli puxta maqolalarda elektrod kalibrlangan peroksid tahlili yoki tutuvchi reagent bilan birga qo‘llanadi.

Nima uchun antioksidant natijalar bir-biriga zid keladi

Uchta ko‘rsatkichni yonma-yon qo‘ysak, metilen ko‘ki haqidagi adabiyotlarda ko‘rinadigan ziddiyatlar usullardagi farqlar va uchta biologik fakt bilan izohlanadi.

Birinchidan, bo‘yoq ham elektron tashuvchi, ham peroksid manbaidir. U elektronlarni kislorod aks holda superoksidga aylanishi mumkin bo‘lgan nafas olish markazlaridan boshqa tomonga yo‘naltirib, bir ROS shaklini kamaytirishi mumkin; ayni paytda uning qaytarilgan shakli kislorodni bevosita peroksidga qaytarib, boshqa shaklni oshiradi. Shu sababli mitoxondrial redoks kimyosi va bo‘yoqning aylanma yo‘l yaratish roli bilan ishlayotgan laboratoriya zondga bog‘liq javoblarni kutishi kerak: ayni kyuvetada superoksidga sezgir ko‘rsatkich pasayadi, peroksid ko‘rsatkichi esa oshadi.

Ikkinchidan, peroksid past dozalarda faqat zarar emas, balki signaldir. Avvalgi ishning davomi bo‘lgan sichqon miyasi mitoxondriyalari tadqiqotida terapevtik darajalarda mitoxondrial DNK shikastlanishisiz, hatto ellik nanomolyar bo‘yoqdan ham peroksid hosil bo‘lishi aniqlangan; oldindan ishlov berilganda rotenon sababli yuzaga keladigan shikastlanishdan himoyalanish kuzatilgan. Faqat terapevtik diapazondan ancha yuqori bo‘lgan yuz mikromolyarda bo‘yoq ayrim DNK fragmentlarini shikastlagan, qizil yorug‘lik va yigirma mikromolyar bo‘yoq esa sinovdan o‘tkazilgan barcha fragmentlarni shikastlagan singlet kislorod hosil qilgan. Taklif etilgan mexanizm gormezisga asoslangan: peroksidning yengil darajada hosil bo‘lishi Nrf2 bilan bog‘liq antioksidant himoya mexanizmlari va mitoxondrial biogenezni ishga tushiradi, shuning uchun qisqa muddatli prooksidant ko‘rsatkich uzoqroq muddatli antioksidant natijadan oldin keladi. Bir soatdan keyin o‘qilgan tahlil bilan bir kundan keyin o‘qilgan tahlil bir-biriga mos kelmasligi mumkin, chunki ular orasida biologik holat o‘zgargan.

Uchinchidan, qaysi molekula mavjud bo‘lishini ham yorug‘lik belgilaydi. Yoritish bo‘yoqni demetillab, Azure B va unga yaqin mahsulotlar tomon o‘zgartiradi; idish ustidagi mikroskop chirog‘ining o‘zi ham uni fotosensibilizatsiyalash uchun yetarli. Qorong‘ida va yorug‘likda o‘tkazilgan tajribalar — turli tajribalar, va har qanday protokolning yoritish va bo‘yoq bilan ishlash nazoratlari bo‘limida ular shunday ko‘rib chiqilishi kerak.

Minimal nazoratlar to‘plami va har qanday da’voni qanday talqin qilish kerak

Quyidagi taqqoslash ushbu maqola uchun tayyorlangan asl ma’lumotnoma materialidir. Metilen ko‘kiga oid har qanday ROS natijasini qabul qilishdan oldin mualliflar qaysi qatorni bajargani va qaysisini o‘tkazib yuborganini tekshiring.

Bundan amaliy talqin qoidasi kelib chiqadi. Peroksidaza bilan qo‘llangan, kalibrlangan va katalaza bilan tekshirilgan Amplex peroksid haqida dalil beradi. DCFDA nospetsifik zond oksidlanishi haqida dalil beradi, xolos. Radikallarni tutuvchi moddalar bilan nazorat qilingan spin tutib olish radikalning kimyoviy turi haqida dalil beradi. Kislorod yutilishi oqim haqida dalil beradi. Tahlil tasdiqlay oladiganidan ko‘proq narsani da’vo qiladigan jumla, qanchalik ishonch bilan yozilgan bo‘lmasin, bo‘yoq haqida emas, zond haqida gapiradi. Dozaga bog‘liqlik va gormetik diapazon, mitoxondrial elektron oqimi, bo‘yalgan namunalarda tahlilga xalaqit beruvchi ta’sirlar hamda mikroskopik yoritish artefaktlari haqidagi tegishli muhokamalar ushbu fikrlarning har birini kengaytiradi; vaqtinchalik havolasi almashtirilgandan keyin ham ularning har biri o‘z kuchini saqlaydi.