Metilen ko‘kining mitoxondrial ta’sirlarini o‘lchash: kislorod, ATP va membrana potensiali

Aytaylik, laboratoriya nafas olishi buzilgan mitoxondriyalarga metilen ko‘kini qo‘shadi va kislorod iste’moli oshishini kuzatadi. Bunda bo‘yoq mitoxondrial funksiyani tikladi, deb yozish tabiiy tuyuladi. Ammo bu jumla noto‘g‘ri bo‘lishi mumkin. Kislorod oqimi, ATP sintezi va membrana potensiali uchta alohida tushunchadir. Ular bitta organellaga bog‘liq, xuddi zaxiralash, sinxronlash va ulashish bir bulut papkasiga bog‘liq bo‘lgani kabi: o‘zaro aloqador, ammo turli qoidalarga bo‘ysunadi. Birini boshqasi bilan adashtirsangiz, har bir o‘lchov texnik jihatdan to‘g‘ri bo‘lsa ham, talqin noto‘g‘ri chiqadi.

Metilen ko‘ki o‘zi o‘lchayotgan tizimda ishtirok etgani uchun bunday chalkashlik ehtimolini oshiradi. U zanjirning oldingi bosqichlarida elektronlarni qabul qilib, keyingi bosqichlariga uzatuvchi oksidlanish-qaytarilish sikllarida qatnashadi, energiyalangan mitoxondriyalarda to‘planadigan lipofil kation hisoblanadi va keng qo‘llaniladigan zondlar bilan bir xil spektral diapazonlarda yorug‘likni yutadigan hamda chiqaradigan to‘q ko‘k birikmadir. Bitta ko‘rsatkich bularning barchasini qamrab ololmaydi. Budapeshtdagi mitoxondrial tadqiqotlarda qo‘llangan ishonchli yondashuv — kislorod oqimi, ATP sintezi tezligi, membrana potensiali va vodorod peroksid ajralishini birgalikda o‘lchash, har bir bosqichda bo‘yoqqa xos nazoratlarni qo‘llashdir.

Respirometriya energiya chiqishini emas, kislorod oqimini o‘lchaydi

Yuqori aniqlikdagi respirometriya, Oroboros Oxygraph yoki Seahorse hujayradan tashqari oqim analizatorida bajarilishidan qat’i nazar, bitta narsani ko‘rsatadi: kislorod qanchalik tez qaytarilayotganini. U har bir elektron hisobiga qancha proton pompalanishini, gradientning qancha qismi saqlanishini yoki ATP sintaza undan foydalanganini ko‘rsatmaydi.

Atamalar muhim. Ajratilgan mitoxondriyalarda ADP siz substrat sizib chiqishga bog‘liq nafas olishni, to‘yintiruvchi miqdordagi ADP bilan substrat oksidlovchi fosforlanish quvvatini, ajratuvchi modda titrlanishi esa maksimal elektron uzatish quvvatini beradi. Butun hujayralarda Seahorse orqali aniqlanadigan mos ko‘rsatkichlar bazal nafas olish, oligomitsinga sezgir ATP bilan bog‘liq nafas olish, proton sizib chiqishi, FCCP bilan aniqlanadigan maksimal nafas olish hamda rotenon va antimitsinga chidamli nomitoxondrial kislorod iste’molidir. Seahorse natijalarini State 3 va State 4 deb atash preparat ta’minlay olmaydigan aniqlikni nazarda tutadi; buni Agilent Mito Stress Test tizimi ham aniq ko‘rsatadi.

Metilen ko‘ki ko‘proq kislorod ko‘proq energiya degani, degan intuitiv bog‘liqlikni buzadi. Ajratilgan miya mitoxondriyalari tadqiqotiga ko‘ra, dengiz cho‘chqasi miyasidan ajratilgan mitoxondriyalarda 100 nM dan 1 uM gacha bo‘yoq glutamat bilan malat, suksinat va alfa-glitserofosfat substratlarida tinch holatdagi kislorod iste’molini oshirgan; alfa-glitserofosfatda o‘sish taxminan 64 foiz bo‘lgan. Biroq sog‘lom mitoxondriyalarda ADP bilan rag‘batlantirilgan nafas olish deyarli o‘zgarmagan. Sizib chiqishga bog‘liq nafas olish oshib, ADP bilan rag‘batlantirilgan oqim o‘zgarmagani uchun hisoblangan nafas olish nazorati nisbati pasayadi. Bu pasayish bo‘yoq mitoxondriyalarni shikastlaganini anglatmaydi. U bo‘yoq normal nafas olishga qo‘shimcha ravishda kislorod sarflaydigan oksidlanish-qaytarilish siklini qo‘shganini bildiradi. Faqat o‘sishni qayd etadigan metilen ko‘ki kislorod iste’moli tahlili haqiqiy kimyoviy jarayonni o‘lchagan bo‘ladi, ammo energiyaning saqlanishi haqida hech narsa demaydi.

Funksiyani tiklash tajribalari ham shu tafovutni kattaroq miqyosda ko‘rsatadi. I kompleks bloklanganda kislorod oqimi taxminan uch baravar, ATP sintezi esa atigi taxminan 1.5 baravar tiklangan. Elektrodga ko‘proq kislorod yetib kelgan. Uning kamroq qismi ATP hosil bo‘lishiga xizmat qilgan. Oksidlovchi fosforlanish yaxshilangani haqidagi har qanday xulosa ATP bo‘yicha natijalarni ham talab qiladi; eng yaxshisi, ular kislorodga nisbatan ATP nisbati shaklida berilishi va maxrajni ifodalash konvensiyasi ko‘rsatilishi kerak.

ATP tahlillari sintez tezligini o‘lchaydi; uni umumiy miqdor bilan almashtirib bo‘lmaydi

ATP tahlili boshqa savolga javob beradi: vaqt birligida qancha ATP hosil bo‘ladi. Kinetik o‘lchov — daqiqalar davomida kuzatiladigan o‘t qo‘ng‘izi lyutsiferazasi lyuminessensiyasi yoki 340 nm da o‘qiladigan geksokinaza bilan glyukoza-6-fosfat degidrogenazaning bog‘langan tahlili — tezlikni beradi. Bitta yakuniy nuqtada o‘lchangan umumiy ATP esa miqdorni beradi; u sintez va iste’mol o‘rtasidagi farqni aks ettiradi va o‘z-o‘zicha oksidlovchi fosforlanish haqida kam ma’lumot beradi.

Budapesht guruhi adenilat kinaza faolligi bostirilgan holda bog‘langan fermentativ usuldan foydalangan va 1 dan 2 uM gacha metilen ko‘ki rotenon hamda antimitsin bilan ishlov berilgan mitoxondriyalarda ATP ishlab chiqarilishini mo‘tadil, ammo statistik ahamiyatli darajada oshirganini aniqlagan. Bu haqiqiy, lekin qisman tiklanishdir. TEGDMA toksikligi tadqiqoti boshqa modelda ham shunga o‘xshash natija bergan: 5 mM stomatologik monomer TEGDMA I kompleks bilan bog‘liq nafas olishni taxminan 286 dan 28 oqim birligigacha tushirgan, 2 uM bo‘yoq esa uni taxminan 86 gacha tiklagan.

Rangli oksidlanish-qaytarilish birikmasi bilan ishlaganda ikkita nazorat majburiydir. Birinchidan, o‘lchangan ATP sintezining qancha qismi ATP sintazaga bog‘liqligini aniqlash uchun oligomitsin qo‘llang. Ikkinchidan, ma’lum miqdordagi ATP, to‘liq reagent aralashmasi va aynan tajribada qo‘llangan bo‘yoq konsentratsiyalari bilan hujayrasiz qo‘shimcha kiritish va qayta aniqlash sinovini bajaring; kamida 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM va 2 uM ni tekshiring. Bo‘yoq chiqarilgan yorug‘likni yutishi, signal beruvchi fermentni ingibitsiyalashi yoki reagentning oksidlanish-qaytarilish kimyosini o‘zgartirishi mumkin. Umumiy lyutsiferaza tahlili bo‘yicha tavsiyalar aynan shu turdagi xalaqitlar uchun biokimyoviy qarshi tekshiruvlarni tavsiya qiladi. So‘nish odatda yuqori konsentratsiyalarda kuchliroq bo‘lishi sababli 1 uM da artefaktlar yo‘q, deb o‘ylamang.

Membrana potensiali zondlari oqimni emas, bo‘yoq taqsimlanishini o‘lchaydi

Safranin O, TMRM va TMRE, rodamin 123 hamda JC-1 — barchasi membranadan o‘ta oladigan kationlardir. Ular elektrokimyoviy muvozanatga muvofiq manfiy zaryadlangan matriksda to‘planadi. Shu sababli umumiy fluoressensiya zondning joylashuvi orqali potensialni bilvosita aks ettiradi. Ularning hech biri ATP yoki elektron oqimini o‘lchamaydi.

Har bir zond uchun mosroq preparat bor. Safranin O ajratilgan mitoxondriyalar va membranasi o‘tkazuvchan qilingan hujayralar uchun mos keladi; odatda taxminan 2 uM da, qo‘zg‘atish to‘lqin uzunligi taxminan 495 nm va emissiya to‘lqin uzunligi taxminan 585 nm bo‘lganda ishlatiladi. U so‘nish rejimida ishlaydi, bunda zondning to‘planishi umumiy fluoressensiyani o‘zgartiradi. TMRM va TMRE butun hujayralarda past nanomolyar yuklashda, so‘nishsiz rejimda mos keladi; bunda depolyarizatsiya bo‘yoqni chiqaradi va mitoxondrial fluoressensiya pasayadi. Yuqori yuklashda o‘z-o‘zini so‘ndirish sababli signal yo‘nalishi teskari aylanishi mumkin. JC-1 qulay yashil-qizil nisbatini beradi, ammo yuklash va mitoxondrial massaga bog‘liq; shu sababli miqdoriy ishlar uchun u puxta nazorat qilinadigan TMRM dan zaifroq. Bu afzalliklar va cheklovlar keng qo‘llaniladigan mitoxondrial membrana potensiali zondlari sharhida umumlashtirilgan.

Metilen ko‘ki aynan ishchi konsentratsiyalarda optik xalaqit beradi. Uning taxminan 600 dan 665 nm gacha bo‘lgan yutilish diapazonlari qizil zondlarning emissiyasi bilan ustma-ust tushadi. Shu bois ichki filtr effektlari, so‘nish va qo‘zg‘atuvchi yorug‘likning yutilishi ehtimoli mavjud. Bo‘yoq, shuningdek, ikkinchi lipofil kation bo‘lib, uning taqsimlanishi ham o‘lchanayotgan potensial bilan o‘zgaradi. Bunga qarshi chora — mustaqil takroriy o‘lchovlar va bo‘sh namunalar: faqat zond, faqat bo‘yoq, zond bilan bo‘yoqning har bir konsentratsiyasi, nol etalon sifatida FCCP bilan to‘liq depolyarizatsiya va, imkon bo‘lsa, optik jihatdan farqli ikkinchi zond. III kompleksni chetlab o‘tish tadqiqoti bunga namuna bo‘lgan: antimitsin va miksotiazol bilan ingibitsiyalashdan keyin membrana potensialining tiklanishi safranin O va TMRM bilan qayta o‘lchanib, sifat jihatidan bir xil tiklanish kuzatilgan. Bitta optik signal vositasi — ishora. Ikkita mustaqil signal vositasi — dalil.

Uch xil preparat, uch xil savol

Ajratilgan mitoxondriyalar, membranasi o‘tkazuvchan qilingan hujayralar va butun hujayralar bitta tahlilning o‘zaro almashtiriladigan sezgirlik sozlamalari emas. Ular turli ishlash tamoyillariga ega alohida tushunchalardir.

Ajratilgan mitoxondriyalar elektron tashish zanjiri, ichki membrana va matriks mexanizmlarini saqlaydi, plazmatik membrana, sitozol va tarmoq tuzilmasi esa olib tashlanadi. Maqsad ham shu: substratlar, ADP, ingibitorlar va bo‘yoq konsentratsiyalari aniq belgilangan bo‘ladi, shuning uchun muayyan yo‘lni aniqlash mumkin. Buning evaziga tabiiy substrat ta’minoti, signal uzatish va energiyaga talab yo‘qoladi.

Membranasi o‘tkazuvchan qilingan hujayralarda mitoxondriyalar hujayra tuzilmasining katta qismi ichida qoladi, tashqaridan berilgan substratlar va ADP esa ochilgan plazmatik membranadan o‘tadi. Ular hujayra sharoitida substrat yo‘lidagi nuqsonni aniqlash uchun to‘g‘ri vositadir. O‘tkazuvchanlikni haddan tashqari oshirish tashqi membranani shikastlaydi, sitozoldagi boshqaruv komponentlari esa yuvilib ketadi.

Butun hujayralar hamma narsani saqlaydi: plazmatik membrana to‘sig‘i, sitozoldagi qaytaruvchilar, endogen substrat transporti, mitoxondrial tarmoq va ATP ga talab. Ular fiziologiyaga eng yaqin va mexanizmni ajratib ko‘rsatishdan eng uzoqdir, chunki bo‘yoqning hujayraga kirishi, qaytarilishi va alohida bo‘limlarda to‘planishi mitoxondriyalarga yetib boradigan samarali ta’sirni birgalikda belgilaydi.

TEGDMA tadqiqotida uchala daraja ham ataylab qo‘llangan: oksidlanish va potensialni bo‘yoq yordamida tiklash uchun ajratilgan miya mitoxondriyalari; nuqsonni asosan I kompleks bilan bog‘liq substrat oksidlanishida aniqlash uchun membranasi o‘tkazuvchan qilingan tish pulpasi ildiz hujayralari; bostirilgan kislorod iste’moliga 2 uM bo‘yoqning fiziologik umumiy ta’sirini aniqlash uchun esa butun ildiz hujayralari. Turli preparatlardagi mitoxondrial ko‘rsatkichlarni solishtirayotgan o‘quvchilar uchun metilen ko‘kining elektronlarni nafas olish zanjiri bo‘ylab qanday uzatishi haqidagi qo‘shimcha maqola yo‘llarning asosini tushuntiradi, metilen ko‘ki bilan nafas olish tadqiqotlarini talqin qilish qo‘llanmasi esa konsentratsiya va ingibitorlarni qo‘llash mantiqini yoritadi.

Oksidlanish-qaytarilish faol bo‘yoq talab qiladigan nazoratlar

Oksidlanish-qaytarilish sikllarida qatnashadigan modda oddiy ingibitorga qaraganda ko‘proq nazoratni talab qiladi, chunki bo‘yoqning o‘ziga xos kimyosi biologik jarayonlarga o‘xshab ko‘rinishi mumkin.

Respirometriyada signal siljishini aniqlash uchun faqat buferli kamera, biologik materialsiz bufer va bo‘yoqli kamera, bo‘yoq bilan tahlilda mavjud har qanday hujayradan tashqari qaytaruvchi modda hamda butun hujayralardagi nomitoxondrial kislorod iste’molini aniqlash uchun yakunda rotenon va antimitsin qo‘llang. Qaytarilgan bo‘yoq elektronlarni kislorodga uzatib, vodorod peroksid hosil qilgan holda qayta oksidlanishini unutmang. Shuning uchun elektron donorsiz faqat bo‘yoqdan iborat bo‘sh namuna NADH yoki NADPH mavjud bo‘lganda yuzaga keladigan hujayrasiz kislorod sarfini kam baholaydi.

Vodorod peroksid uchun noselektiv DCFDA bo‘yoqlari o‘rniga kalibrlangan Amplex UltraRed va xren peroksidazasini afzal ko‘ring, katalaza bilan tekshiring hamda yoritishga bog‘liqlikni sinang, chunki bo‘yoq fotosensibilizatordir. Miya mitoxondriyalari tadqiqotida atigi 100 nM bo‘yoqda peroksid yuklamasi to‘rt baravardan ko‘proq oshgani, uning yo‘qotilishi esa sekinlashgani aniqlangan; peroksid superoksid oraliq bosqichisiz, bevosita qaytarilgan bo‘yoqdan hosil bo‘lgan. Zond tanlash va yorug‘lik nazoratlari tafsilotlari bo‘yoq bilan tajribalarda reaktiv kislorod turlarini o‘lchash haqidagi qo‘shimcha maqolada berilgan. Peroksid qachon signal, qachon esa yuklama sifatida ta’sir qilishi haqidagi kengroq masala hujayraning oksidlanish-qaytarilish muvozanati va antioksidant xususiyatlar haqidagi da’volar mavzusi bilan birga yoritilgan.

Yo‘l haqidagi xulosalar uchun III kompleksning ikkala ingibitor bog‘lanish joyini tekshiring: Qi joyida antimitsin A va Qo joyida miksotiazol, shuningdek, sianid bilan IV kompleksdagi yakuniy bosqichni tekshiring. Sichqon miyasi bo‘yicha oldingi tadqiqotda bo‘yoq rotenon bilan bloklangan nafas olishni tiklagani, ammo antimitsin bilan bloklanganini tiklamagani qayd etilgan. Keyingi uch turdagi organizmni qamrab olgan tadqiqot esa ikkala ingibitor bilan ham qisman tiklanish va sitoxrom c ning bevosita qaytarilishiga dalil topgan. Chetlab o‘tishni uzil-kesil tasdiqlangan emas, balki yangi ma’lumotlarga mos keladigan mexanizm deb qarang, chunki bo‘yoq konsentratsiyasi, ingibitor bog‘lanish joyi, substrat holati va bo‘yoq taqsimlanishi kuzatiladigan yo‘lni o‘zgartiradi.

Tahlil tanlash matritsasi

O‘lchovga qarab savol tanlash uchun emas, savolga qarab o‘lchov tanlash uchun ushbu jadvaldan foydalaning.

Eng kamida ishonchli xulosa uchun bir xil bo‘yoq konsentratsiyalari — 100 nM, 300 nM, 1 uM va 2 uM — bilan sizib chiqish, ADP, oligomitsin va ajratuvchi modda sharoitlarida kislorod oqimini, ATP sintezi tezligini, imkon qadar ikkita zond bilan membrana potensialini hamda katalaza va hujayrasiz nazoratlar bilan kalibrlangan peroksid ajralishini o‘lchash kerak. O‘zaro bog‘langan to‘plamni taqdim eting: kislorod oqimi, ATP tezligi, kislorodga nisbatan ATP, potensial va peroksid. Bu sonlarning istalgan bittasi alohida olinganda, hali ma’nosi aniqlanmagan o‘lchov bo‘lib qoladi.