Nega metilen ko‘ki kislotaga chidamli bo‘yashda kontrast bo‘yoq sifatida ishlatiladi

Laboratoriya mutaxassisi bo‘yashning barcha bosqichlaridan o‘tgan balg‘am surtmasini tekshiradi. Ko‘k fonda qizil tayoqchalar yaqqol ko‘rinadi va natija kislotaga chidamli batsillalar kuzatilgani sifatida qayd etiladi. Ertasi kuni boshqa preparatda qizil tayoqchalarsiz bir tekis ko‘k maydon ko‘rinadi va u silga manfiy natija sifatida qayd etiladi. Bu ikki xulosadan biri preparat tasdiqlay oladiganidan ortiq narsani da’vo qiladi va bu birinchisi emas.

Chalkashlik tushunchaning o‘zida. Mutaxassis ko‘k bo‘yoqni aniqlash kimyosining bir qismi deb qabul qilgan, go‘yo metilen ko‘ki mikobakteriyalarni topishga yordam bergandek. Aslida bunday emas. Metilen ko‘ki buyum oynasiga tegadigan paytga kelib, sinov allaqachon tugagan bo‘ladi. Bo‘yoq natijani o‘qish mumkin bo‘lishi uchun faqat fonni bo‘yaydi. Ushbu maqolada kislotaga chidamli bo‘yashda metilen ko‘kining vazifasi, nega boshqa rang emas, aynan ko‘k rang tanlanishi va ko‘k fondagi qizil rang asosida qanday xulosa chiqarish mumkinligi tushuntiriladi.

Qisqa javob

Kislotaga chidamli bo‘yash uchta g‘oyaga asoslangan differensial sinovdir. Asosiy bo‘yoq — karbol fuksin — barcha hujayralarga, jumladan mumsimon qobiqli mikobakteriyalarga ham majburan kiritiladi. Rangsizlantiruvchi kislota-spirt oddiy hujayralardan qizil bo‘yoqni chiqarib tashlaydi, ammo kislotaga chidamli hujayralardan uni ajratib chiqara olmaydi. Keyin kontrast bo‘yoq — metilen ko‘ki — rangsizlantiruvchi bo‘yoqdan xalos qilgan barcha materialni bo‘yaydi. Natijada kislotaga chidamsiz hujayralar, xo‘jayin organizm hujayralari va qoldiqlar ko‘k ko‘rinadi, kislotaga chidamli batsillalar esa qizilligicha qoladi. Kontrast bo‘yoq ranglar orasidagi farqni ta’minlaydi. U hujayraning kislotaga chidamliligini belgilovchi kimyoviy jarayonda qatnashmaydi.

Har bir bosqichning vazifasi

Quyidagi sxema vazifalar taqsimotini ko‘rsatadi. Jarayonni tushunish uchun uni chapdan o‘ngga qarab o‘qing; pastki tasma esa har bir bo‘yash guruhi boshqa savolga javob berishini eslatadi.

Avval bo‘yoqning kirishi ta’minlanadi. Mikobakteriyalarning qobig‘i odatdagidan ancha gidrofob bo‘lgani uchun ular oddiy suvli bo‘yoqlarga qarshilik ko‘rsatadi, shu sababli protokol bo‘yoqning majburan kirishini ta’minlaydi. Ziehl-Neelsen usulida bug‘ hosil bo‘lguncha qizdirish tarkibida fenol bo‘lgan karbol fuksinni mumsimon devor orqali kiritadi. Kinyoun sovuq usulida issiqlik o‘rniga ancha kuchli asosiy bo‘yoq tarkibi qo‘llanadi, ayrim o‘zgartirilgan, qizdirishsiz variantlarda esa sirt-faol moddalar qo‘shiladi. Amerika mikrobiologiya jamiyatining kislotaga chidamli bo‘yash protokollarida ikkala tarkib yonma-yon keltirilgan va konsentratsiyalar farqi katta: qizdiriladigan usulda har 100 mL uchun taxminan 0.3 g asosli fuksin, sovuq usulda esa taxminan 4 g ishlatiladi.

Ikkinchi bosqich — farqlash. Odatda 97 mL 95 foizli etanolga 3 mL konsentrlangan xlorid kislota qo‘shib tayyorlanadigan kislota-spirt devori alohida qarshilik ko‘rsatmaydigan barcha hujayralardan qizil bo‘yoqni yuvib chiqaradi. Mikobakteriyalarga xos lipid qobig‘i butun bo‘lgan hujayralar bo‘yoqni saqlab qoladi. Butun usul aynan shu bosqichga tayanadi va quyida muhokama qilinganidek, u bajarish texnikasiga eng sezgir bosqichdir.

Oxirgi bosqich — kontrast yaratish. Endi buyum oynasida bo‘yoqdan xalos qilingan hujayralarning deyarli rangsiz fonida qizil kislotaga chidamli hujayralar bor. 0.3 foiz w/v metilen ko‘ki bu fonni qizildan imkon qadar farqli rangda yana ko‘rinadigan qiladi. Kontrast bo‘yash qisqa davom etadi: qizdiriladigan usulda odatda 20 dan 30 soniyagacha, ayrim sovuq usul variantlarida esa bir necha daqiqagacha. Bu vaqt bo‘yoqning o‘z xususiyatiga emas, protokolga bog‘liq.

Nega aynan shu bo‘yoq va nega ko‘k rang

Metilen ko‘ki kationli asosli bo‘yoqdir, ya’ni uning rangli ioni musbat zaryadga ega va rangsizlantirilgan bakteriyalar, xo‘jayin hujayralari hamda qoldiqlarning manfiy zaryadlangan sirtlariga birikadi. OpenStax mikrobiologiya darsligi bu zaryadlar o‘zaro ta’sirini asosli bo‘yoqlarning umumiy ishlash tamoyili sifatida tushuntiradi. Ammo bu vazifada metilen ko‘ki kimyoviy jihatdan yagona emas. Kristall binafsha va safranin ham asosli bo‘yoqlardir. Tanlov kimyoviy emas, optik sabablarga asoslangan.

Qizil tayoqchalar uchun kontrast rangli fon kerak, ko‘k esa yorug‘ maydonli mikroskopiya uchun qizilga eng foydali tarzda qarama-qarshi turadi. Safranin yaxshi kontrast bo‘yoq bo‘la olmaydi, chunki uning yakuniy pushti-qizil rangi saqlanib qolgan karbol fuksin rangiga juda yaqin bo‘lib, jarayon yaratgan farqni yo‘qqa chiqaradi. Kristall binafsha esa ingichka qizil batsillalar bilan e’tibor uchun raqobatlashadigan to‘q binafsha fon hosil qiladi. Vazifa kimyoviy ta’sir emas, kontrast ekanining eng kuchli dalili — bo‘yoqni almashtirish mumkinligidir: ayrim veterinariya va o‘zgartirilgan protokollarda malaxit yashili hamda brilliant yashili kabi yashil kontrast bo‘yoqlar ishlatiladi va sinov baribir ishlaydi, chunki aniq farqlanadigan har qanday rang shu vazifani bajaradi.

Bundan ikkita amaliy xulosa kelib chiqadi. Birinchidan, standart retsept pH ni o‘zgartirishni nazarda tutmaydi; ushbu oddiy suvli 0.3 foizli eritmani boshqa bo‘yash tamoyiliga tegishli Loefflerning metilen ko‘ki kabi ishqoriy tarkiblar bilan adashtirmang. Ikkinchidan, bo‘yoqni ortiqcha qo‘llash zarar keltiradi. Gistologiya adabiyotlarida haddan tashqari zich ko‘k fon kam sonli batsillalarni yashirishi mumkinligi alohida ta’kidlanadi. Shuning uchun buyum oynasini protokolda belgilanganidan uzoqroq bo‘yoq ostida qoldirish hech qanday foyda bermay, natijani o‘qishni qiyinlashtiradi.

Sinovni mumkin qiladigan devor kimyosi

Kislota-spirtning farqlash xususiyati mikobakteriya qobig‘iga bog‘liq. Uning tuzilmaviy asosi mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan kompleksidir: peptidoglikan arabinogalaktanga birikkan, arabinogalaktanning tashqi uchlarida esa juda uzun zanjirli mikol kislotalari joylashgan. Ular lipidlarga boy, o‘tkazuvchanligi juda past tashqi mikomembranani hosil qiladi. Mikobakteriyalarning tashqi membranasi haqidagi sharhda bu tuzilish batafsil bayon qilingan. To‘siq har ikki yo‘nalishda ham ishlaydi. U bo‘yoqning kirishiga qarshilik ko‘rsatadi, shu sababli bo‘yoqni kiritish uchun issiqlik yoki kuchaytirilgan asosiy bo‘yoq kerak bo‘ladi. U bo‘yoqning chiqarilishiga ham qarshilik ko‘rsatadi, shu sababli karbol fuksin ichkariga kirgach, kislota-spirt uni olib tashlay olmaydi. Oddiy bakteriyalarda bunday qobiq yo‘q va ular bo‘yoqni yo‘qotadi. Demak, kislotaga chidamlilikni fuksinning mikol kislotasiga kimyoviy birikishi emas, lipid to‘sig‘i bilan bog‘liq hodisa sifatida tushunish to‘g‘riroq.

Bu kimyo keng uchraydigan bir jumboqni ham tushuntiradi: mikobakteriyalar Gram usulida yomon va beqaror bo‘yaladi, ba’zan xira, donador shakllar yoki bo‘yalmagan sharpasimon hujayralar ko‘rinishida namoyon bo‘ladi. Ularning gidrofob devori kristall binafshaning kirishini cheklaydi. Kislotaga chidamli bo‘yash o‘zgartirilgan Gram bo‘yash usuli emas. U devorning boshqa xususiyatiga asoslangan alohida differensial tamoyildir; oddiy bo‘yash va Gram bo‘yashni taqqoslash maqolasida qolgan ikki usulning tamoyillari ko‘rsatilgan.

Uchta usul, uchta savol

Bakteriyalarni bitta bo‘yoq bilan bo‘yash usullarining kengroq doirasi uchun mikroskopik bo‘yash atlasiga qarang.

Ko‘k fondagi qizil rang nimani isbotlay olmaydi

Qizil tayoqchalar mikroorganizmlar kislota-spirt ta’siridan keyin ham karbol fuksinni saqlab qolganini anglatadi. Bu topilma Mycobacterium tuberculosis ga mos keladi, ammo CDC ning sil diagnostikasi bo‘yicha yo‘riqnomasida boshqa mikobakteriyalar ham kislotaga chidamli ekani aniq qayd etilgan. Shuning uchun turni aniqlash rangga emas, kultura va nuklein kislota tekshiruvlariga asoslanishi kerak.

Texnik xatolar asosan ikki yuvish bosqichida yuz beradi. Yetarlicha rangsizlantirmaslik fon materialini qizil qoldirib, noto‘g‘ri musbat talqinlarga olib keladi. Ortiqcha rangsizlantirish kuchsiz saqlangan asosiy bo‘yoqni chiqarib tashlaydi va noto‘g‘ri manfiy natijalarga sabab bo‘lishi mumkin. Kontrast bo‘yoqni haddan tashqari ko‘p qo‘llash kam sonli batsillalarni ko‘k fon ichida yashiradi. Qalin surtmalar, cho‘kmaga tushgan reagentlar va ifloslangan yuvish suvi ham o‘z artefaktlarini qo‘shadi.

Texnika qanchalik puxta bo‘lmasin, sezgirlik mikroorganizmlar miqdori bilan chegaralanadi. An’anaviy surtma mikroskopiyasi uchun balg‘amning har millilitrida taxminan 5,000 dan 10,000 tagacha batsilla bo‘lishi kerak. CDC ning oldingi dalillar sharhlarida kultura bilan tasdiqlangan o‘pka sili holatlarida surtma sezgirligi taxminan 45 dan 80 foizgacha deb ko‘rsatilgan. Shu sababli manfiy surtma hech qachon silni istisno qilmaydi. Amaldagi CDC yo‘riqnomasi har bir surtma bilan birga kultura tekshiruvini ham saqlab qoladi va o‘pka sili taxmin qilinsa hamda natija bemorni boshqarishni o‘zgartiradigan bo‘lsa, kamida bitta nafas yo‘llari namunasida nuklein kislota amplifikatsiyasi sinovini tavsiya qiladi.

Amaliy ish tasdiqlangan protokollarga tayanishi kerak

O‘quv maqsadidagi tavsiflar, jumladan ushbu maqola ham, klinik ishni bajarishga ruxsat bermaydi. Laboratoriyadagi amaliy ishda amaldagi CDC, APHL yoki CLSI hujjatlariga mos keladigan, laboratoriyada validatsiyadan o‘tgan standart operatsion tartibga amal qiling; CDC ning Stacks arxivida saqlanadigan kislotaga chidamli bo‘yash bo‘yicha ma’lumotnomasi bunday tartiblarda reagentlar va natijani o‘qish mezonlari qanday belgilanishini ko‘rsatadi. Sil namunalarini tekshirishda biologik xavfni cheklovchi sharoitlar zarur: surtmalar biologik xavfsizlik shkafida tayyorlanadi, chunki tayyorlash jarayonida aerozollar va sachramalar hosil bo‘ladi. CDC laboratoriya xavfsizligi yo‘riqnomasida hatto issiqlik bilan fiksatsiya qilingan surtmalar ham tirik sil batsillalarini saqlashi mumkinligi va ularga hali ham ifloslangan material sifatida munosabatda bo‘lish kerakligi aytiladi. CDC Jamoat salomatligi tasvirlar kutubxonasidagi M. leprae ni tekshirish uchun karbol fuksin va metilen ko‘ki bilan bo‘yalgan surtma haqidagi yozuv usulning qo‘llanish doirasi sil bilan cheklanmasligini eslatadi: kislotaga chidamli mikroorganizmlar izlanadigan barcha holatlarda ko‘k fondagi qizil kontrast xizmat qiladi, sinchiklab o‘qilgan manfiy natija ham qayd etishga arziydigan natijadir.

Tayyor preparatni o‘qish

Kontrast bo‘yoqning foydasi dastlabki ko‘rikda namoyon bo‘ladi. Mikroskopist kichik kattalashtirishda ko‘zdan kechirar ekan, avval ko‘k fon yordamida surtma sifatini baholaydi: hujayralar bir tekis taqsimlanganmi, fokuslash uchun butun xo‘jayin hujayralari bormi, ko‘p cho‘kma yo‘qmi. Keyin qizil gumonli obyektlar e’tiborni tortadi, chunki preparatda ulardan boshqa hech narsa qizil emas. Tasdiqlash moyli immersiyada amalga oshiriladi; unda haqiqiy batsillalar bir xil ko‘rinishdagi bo‘yoq qoldiqlari emas, kutilgan ingichka, ba’zan biroz egilgan yoki donador tayoqchalar sifatida ko‘rinadi.

Fonning bo‘yalishi hisobotdagi ifodalarni ham belgilaydi. Qizil batsillalar bor preparat kislotaga chidamli batsillalar kuzatilgani sifatida qayd etiladi, ko‘pincha laboratoriya shkalasi bo‘yicha yarim miqdoriy daraja ham ko‘rsatiladi. Qizil mikroorganizmlar yo‘q preparat kislotaga chidamli batsillalar kuzatilmagani sifatida qayd etiladi, hech qachon silga manfiy deb emas. Bu farq muhim: ko‘k maydon bo‘yash ishlaganini, hujayralar kontrast bo‘yoqni qabul qilganini va optika yetarli bo‘lganini ko‘rsatadi, lekin aniqlash chegarasidan past miqdordagi mikroorganizmlar haqida hech narsa bildirmaydi. Qizil obyektlarsiz ko‘k maydon — preparatga oid haqiqiy natija, bemor haqida yakuniy hukm emas.

Vazifalar taqsimotini yodda tutsangiz, hisobotni to‘g‘ri ifodalash osonlashadi. Karbol fuksin gumonli obyektlarni ajratib ko‘rsatadi. Kislota-spirt sinovni bajaradi. Metilen ko‘ki esa faqat javobni o‘qiladigan qiladi: qizil rang bo‘yoq kislota ta’siriga qaramay saqlanganini, ko‘k rang esa u yo‘qotilganini bildiradi. Qolgan hamma narsa — tur, mikroorganizmlar miqdori va klinik ma’no — preparatdan tashqaridagi tekshiruvlardan olinadi.