Metilen ko‘ki bilan oddiy bo‘yash va Gram usulida bo‘yash: har bir usul nimani isbotlay oladi

Talaba E. coli deb belgilangan kulturadan surtma tayyorlaydi, uni bir daqiqaga metilen ko‘ki bilan qoplaydi, chayadi va moyli immersion obyektiv orqali kuzatadi. Ko‘rish maydonini ko‘k tayoqchalar qoplagan. Laboratoriya hisobotida: “E. coli sifatida aniqlangan Gram-manfiy tayoqchalar”, deb yozilgan. Kuzatuv to‘g‘ri. Ammo bu preparat bunday xulosaga asos bermaydi.

Xato texnikada emas, tushunchada. Talaba oddiy bo‘yashni differensial sinovdek qabul qilgan. Oddiy bo‘yash va Gram usulida bo‘yash turli savollarga javob beradi, chunki ular turli bo‘yash tamoyillariga asoslanadi. Biri: qanday shakl mavjud, deb so‘raydi. Ikkinchisi: sinov ta’sirida hujayra devori o‘zini qanday tutadi, deb so‘raydi. Bu ikkalasini adashtirsangiz, to‘g‘ri bo‘yalgan preparat ham asossiz hisobotga olib keladi.

Ushbu taqqoslash ikki usulni alohida ko‘rib chiqadi, har bir natija qanday xulosaga asos bo‘lishini ko‘rsatadi va talabalar eng ko‘p beradigan ikki savolga javob beradi: metilen ko‘kini Gram usulida bo‘yashda ishlatish mumkinmi va E. coli ni metilen ko‘ki bilan bo‘yash aslida nimani ko‘rsatadi.

Qisqa javob

Metilen ko‘ki bilan oddiy bo‘yash bo‘yaladigan barcha hujayralarni bir xil ko‘k rangga bo‘yaydi. Shu sababli u morfologiyani (tayoqchalar, sharsimon hujayralar, spirallar) va joylashuvni (yakka, juft, zanjirlar) ko‘rsatadi, ammo Gram toifasi haqida hech qanday ma’lumot bermaydi. Gram usulida bo‘yashga yod, rangsizlantirish bosqichi va qarshi bo‘yoq qo‘shiladi. Shu orqali bakteriyalar qobiqlarining bo‘yoqni qanday saqlab qolishiga qarab Gram-musbat (binafsha) va Gram-manfiy (pushti yoki qizil) guruhlarga ajratiladi. Metilen ko‘kidan keyingi ko‘k tayoqchalar “tayoqchasimon hujayralar mavjud” degani. To‘liq Gram ketma-ketligidan keyingi pushti tayoqchalar esa “Gram-manfiy tayoqchalar mavjud” degani. Ikkinchi xulosa kuchliroq, chunki jarayonda qo‘shimcha sinov o‘tkazilgan.

Ushbu maqola mansub bo‘lgan bir bo‘yoqli bakterial usullarning kengroq guruhini ko‘rish uchun mikroskopik bo‘yash atlasiga qarang.

Oddiy bo‘yash: bitta bo‘yoq, bitta savol

Metilen ko‘ki asosli (kationli) bo‘yoqdir. Uning rangli ioni musbat zaryadga ega va hujayradagi manfiy zaryadlangan tuzilmalarga, jumladan nuklein kislotalar va yuzadagi kislotali guruhlarga bog‘lanadi. Natijada hujayralar och fonda ko‘k ko‘rinadi. OpenStax bo‘yash haqidagi bobida ushbu musbat bo‘yash tamoyilini tushuntiradi. Bo‘yoq kationining o‘zi metilen ko‘ki kimyosi bo‘yicha ma’lumotnomada batafsil tavsiflangan kichik, yassi fenotiazin ionidir; xlorid qarshi ioni rang bermaydi.

Standart o‘quv protokoli ataylab sodda tuzilgan: yupqa surtma tayyorlash, havoda quritish, issiqlik bilan fiksatsiya qilish, taxminan bir daqiqaga 1% atrofidagi suvli metilen ko‘ki eritmasi bilan qoplash, suv bilan ehtiyotkorlik bilan chayish, shimuvchi qog‘oz bilan quritish va moyli immersiyada tekshirish. LibreTexts o‘quv protokolida aynan shu 1% li, bir daqiqalik variant berilgan, ayrim laboratoriyalar vaqtni uzaytirishi ham qayd etilgan. Bo‘yoqni mustahkamlovchi modda yo‘q, rangsizlantiruvchi yo‘q, ikkinchi bo‘yoq yo‘q. Asosiy jihat ham shu. Faqat bitta bo‘yoq ishlatilsa va u tanlab olib tashlanmasa, bo‘yoqni bog‘lagan har bir hujayra oxirida bir xil rangda bo‘ladi.

E. coli uchun kutiladigan ko‘rinish — yakka, juft yoki kichik guruhlarda joylashgan ko‘k tayoqchalar (batsillalar). Ko‘k rang bo‘yoqdan keladi. Tayoqchasimon shakl esa organizmning xususiyatidir. Ammo bu birikma organizmni aniqlamaydi, chunki ko‘plab turlar tayoqchasimon bo‘ladi va ko‘plab tayoqchalar oddiy bo‘yashda ko‘k rangga kiradi. ATCC mikrobiologik kulturalar bo‘yicha qo‘llanmasida natija faqat morfologiya bilan cheklanishini aniq ko‘rsatadi. To‘g‘ri hisobot: “ko‘k batsillalar kuzatildi”. Shakl va joylashuvdan tashqari har qanday xulosa uchun qo‘shimcha dalil kerak.

Gram usulida bo‘yash: to‘rtta reagent, xususiyatni tekshiruvchi bitta sinov

Gram usulida bo‘yash differensial bo‘yashdir. Unda barcha hujayralar bir xil ketma-ketlikdan o‘tkaziladi va qaysilari birinchi bo‘yoqni saqlab qolishi, qaysilari esa yo‘qotishi kuzatiladi. Amerika Mikrobiologiya Jamiyatining Gram usulida bo‘yash protokollari standart to‘rt bosqichli tartibni belgilaydi: kristall binafsha (birlamchi bo‘yoq), Gram yodi (bo‘yoqni mustahkamlovchi modda), spirt yoki aseton-spirt (rangsizlantiruvchi), so‘ng safranin (qarshi bo‘yoq).

Standart o‘quv modeli bu farqni hujayra qobig‘ining tuzilishi orqali tushuntiradi. Gram-musbat hujayralarda qalin peptidoglikan devor bo‘lib, u spirt bilan yuvish paytida suvsizlanadi va kristall binafsha–yod kompleksini saqlab qoladi. Gram-manfiy hujayralarda yupqa peptidoglikan qatlami hamda lipidlarga boy tashqi membrana mavjud. Rangsizlantiruvchi bu membranani buzadi, shuning uchun kompleks yuvilib chiqadi va hujayralar keyin safraninni qabul qiladi. NCBI Bookshelf dagi Gram usulida bo‘yash sharhi hujayra devoriga asoslangan shu izohni beradi. Mutaxassislar to‘liq fizik-kimyoviy jarayon faqat devor qalinligiga bog‘liq bo‘lmay, murakkabroq ekanini qo‘shimcha qiladilar. Ammo laboratoriyada talqin qilish uchun kuzatiladigan xususiyatga asoslangan qoida amal qiladi: binafsha — saqlab qolgan, pushti — yo‘qotgan va keyin qarshi bo‘yoq bilan bo‘yalgan.

Tushuntiruvchi tasvirlar. Usullarni taqqoslash uchun uslublashtirilgan chizmalar, kamera orqali olingan mikrofotografiyalar emas. Tamoyilni o‘rgatish uchun ranglar soddalashtirilgan: oddiy bo‘yashda bitta rang, Gram usulida rangsizlantirishdan keyin ikkita rang.

Metilen ko‘kini Gram usulida bo‘yashda ishlatish mumkinmi

Bu savolni ikki xil tushunish mumkin va ularga turlicha javob berish kerak.

Birinchi talqin: metilen ko‘ki bilan bir marta qoplash butun Gram ketma-ketligining o‘rnini bosa oladimi? Yo‘q. Yod, rangsizlantiruvchi va qarshi bo‘yoqsiz differensial bosqich bo‘lmaydi, demak, Gram toifasi tekshirilmaydi. Faqat metilen ko‘kidan keyingi ko‘k maydon, hatto idish Gram reagentlari yonida turgan bo‘lsa ham, oddiy bo‘yash natijasidir. Uni Gram natijasi sifatida qayd etmang.

Ikkinchi talqin: metilen ko‘ki 4-bosqichda qarshi bo‘yoq sifatida safranin o‘rnini bosa oladimi? Vazifasi jihatidan u rangsizlantirilgan hujayralarni bo‘yashi mumkin. Darslikdagi mashq bunday almashtirishdan keyin Gram-musbat hujayralar binafsha, Gram-manfiy hujayralar esa ko‘k bo‘lishini ko‘rsatadi. Bu mantiqan to‘g‘ri, chunki to‘g‘ri rangsizlantirilgan Gram-manfiy hujayralar deyarli rangsiz bo‘ladi va boshqa kationli bo‘yoqni qabul qiladi. Ammo bu standart protokol emas. ASM protokollarida safranin ko‘rsatilgan; ayrim variantlarda asosli fuksin kabi tan olingan muqobillar bor, lekin metilen ko‘ki emas. Amaliy kamchilik ham mavjud: ko‘kni binafshadan ajratish pushtini binafshadan ajratishga qaraganda qiyinroq, ayniqsa yangi boshlovchilar uchun va mikroskop lampalari kuchsizlanganida. O‘quv ishlarida va natijasi muhim bo‘lgan har qanday holatda protokolingizda ko‘rsatilgan qarshi bo‘yoqni, odatda safraninni ishlating. Metilen ko‘ki bilan qarshi bo‘yashni esa standartga teng usul emas, namoyish varianti deb qabul qiling.

Metilen ko‘kining boshqa bir bo‘yoqli variantlar bilan qanday taqqoslanishi haqidagi bog‘liq savol oddiy bakterial bo‘yash usullari taqqoslovida yoritilgan.

E. coli ni metilen ko‘ki bilan bo‘yash nimani isbotlaydi va nimani isbotlamaydi

E. coli Gram-manfiy tayoqchadir, ammo bu jumla bir necha usuldan olingan faktlarni birlashtiradi: morfologiya mikroskopiyadan, Gram reaksiyasi Gram usulida bo‘yashdan, organizmning kimligi esa kultura hamda biokimyoviy yoki molekulyar tekshiruvlardan aniqlanadi. Metilen ko‘ki bilan bo‘yalgan surtma faqat birinchi qismga hissa qo‘shadi. U bo‘yalgan namunada tayoqchasimon hujayralar borligini va ularning qanday joylashganini ko‘rsatadi. U Gram reaksiyasini aniqlamaydi, chunki rangsizlantirish sinovi o‘tkazilmagan. U turni ham aniqlamaydi, chunki bu ajratish qobiliyatida ko‘plab turlarning tayoqchalari bir-biriga o‘xshaydi.

Hisobotlarda odatda xato aynan shu yerda yuz beradi. Muallif oldindan ma’lum deb qabul qilingan ma’lumotni (“bu kultura E. coli bo‘lishi kerak, E. coli esa Gram-manfiy”) kuzatuv satriga kiritadi. Natijada preparat aslida faqat taxmin qilingan narsani tasdiqlayotgandek ko‘rinadi. Aniqroq hisobot bu ma’lumotlarni alohida beradi: “Metilen ko‘ki bilan oddiy bo‘yash: ko‘k batsillalar kuzatildi; faqat morfologiya, Gram toifasi tekshirilmagan”. Keyin, agar Gram usulida bo‘yash nazorat namunalari bilan to‘g‘ri bajarilgan bo‘lsa: “Gram usulida bo‘yash: pushti tayoqchalar, Gram-manfiy xususiyatga mos”. Turning kimligi keyinroq, faqat rangdan emas, identifikatsiya jarayonidan aniqlanadi.

Talqin qilish bo‘yicha amaliy qo‘llanma

Laboratoriya ishida shu qaror qoidasidan foydalaning. Agar barcha hujayralar bir xil rangda bo‘lsa va protokolda rangsizlantiruvchisiz bitta bo‘yoq ishlatilgan bo‘lsa, siz oddiy bo‘yashni bajargansiz. Shaklni, taxminiy o‘lchamni va joylashuvni qayd eting. Shu bilan cheklaning. Agar protokolda ma’lum musbat va manfiy nazorat namunalari bilan kristall binafsha, yod, rangsizlantiruvchi va qarshi bo‘yoq ishlatilgan bo‘lsa, siz Gram usulida bo‘yashni bajargansiz. Rang va morfologiyani birga qayd eting: zanjirlardagi binafsha kokklar, pushti tayoqchalar va hokazo.

Chalkashliklarning aksariyati uchta xatodan kelib chiqadi. Birinchisi — ko‘k tayoqchalarni E. coli tasdig‘i deb ortiqcha talqin qilish. Ikkinchisi — metilen ko‘ki bilan bo‘yalgan preparatni daftardagi “Gram usulida bo‘yash” sarlavhasi ostida qayd etish; keyingi o‘quvchilar buni noto‘g‘ri tushunadilar. Uchinchisi — qarshi bo‘yoqlarni o‘ylamay almashtirish, so‘ng laboratoriyalar orasidagi ranglarni xuddi ranglar to‘plami bir xil bo‘lgandek taqqoslash. Har bir xatoning yechimi bir xil: amalda bajarilgan usulning nomini ayting va faqat o‘sha usul tekshiradigan jihatlar haqida xulosa qiling.

Oddiy bo‘yash aynan kam narsaga da’vo qilgani uchun o‘z o‘rniga ega. U tez, kichik texnik og‘ishlarga chidamli va savol morfologiyaga oid bo‘lsa yetarli: biror narsa bormi va uning shakli qanday? Savol tasniflashga oid bo‘lsa, differensial sinovni bajaring. Ko‘k preparat hujayralar qanday ko‘rinishini aytadi. Binafsha yoki pushti preparat ularning devorlari qanday xususiyat ko‘rsatishini aytadi. Hech bir preparatning o‘zi turni aniqlab bermaydi.