Maqola
Metilen ko‘ki va azot oksidi: NOS, cGMP va qon tomir signalizatsiyasi
Savol oddiy tuyuladi: metilen ko‘ki azot oksidini ingibirlaydimi? Laboratoriyada bu savol to‘rtta alohida savolga bo‘linadi va har biri boshqa tajriba orqali tekshiriladi. Ularni chalkashtirish metilen ko‘ki va azot oksidi haqidagi matnlar ishonchli ohangda yozilsa-da, noaniq bo‘lib qolishining asosiy sababidir.
Azot oksidi signalini to‘rtta bo‘g‘indan iborat zanjir deb tasavvur qiling. Azot oksidi sintazasini hosil qilish uchun gen transkripsiya qilinadi. Ferment argininni azot oksidiga aylantiradi. Gaz boshqa bir modda bilan reaksiyaga kirishishidan oldin o‘z nishoniga diffuziya orqali yetib boradi. Eruvchan guanilat siklaza uni aniqlab, siklik GMP hosil qiladi. Metilen ko‘kining har bir bo‘g‘inga ta’siri haqida ilmiy ishlar chop etilgan, ammo dalillar turli tajriba tizimlari, turli konsentratsiyalar va turli izoformalardan olingan. Bir bo‘g‘indagi natija boshqa bo‘g‘inga ta’sirni isbotlamaydi.
Asosiy zanjirning sodda izohi
Qon tomir devorida odatiy ketma-ketlik quyidagicha kechadi. Bir qo‘zg‘atuvchi endoteliy hujayrasiga ta’sir qiladi. eNOS yoki NOS3 deb ataladigan endotelial azot oksidi sintazasi azot oksidining kichik bir impulsini hosil qiladi. Gaz qo‘shni silliq mushak hujayrasiga diffuziya orqali o‘tadi, eruvchan guanilat siklazaning qaytarilgan temirli gemiga bog‘lanadi va GTP ning siklik GMP ga aylanishini tezlashtiradi. Siklik GMP proteinkinaza G ni faollashtiradi, kalsiyning boshqarilishi o‘zgaradi va mushak bo‘shashadi.
Alohida ko‘rib chiqishga arziydigan ikkinchi zanjir ham bor. Infeksiya yoki sitokinlar ta’siri paytida hujayralar boshqa fermentni — induksiyalanuvchi azot oksidi sintazasi, ya’ni iNOS ni, shuningdek NOS2 deb ataladigan fermentni — hosil qilish uchun transkripsiyani amalga oshiradi. U eNOS ga qaraganda kattaroq va uzoqroq davom etuvchi azot oksidi oqimlarini hosil qiladi. Uchinchi izoforma — neyronal NOS yoki nNOS — yana boshqa sharoitga tegishli. Maqolada izoforma ko‘rsatilmasdan azot oksidi sintazasi deyilsa, to‘xtab, aynan qaysi biri o‘lchanganini tekshiring. Metilen ko‘kining elektronlarni qanday ko‘chirishi haqidagi umumiy sharh redoks nishonlari uchun ham shu fikrni ta’kidlaydi: vositachi o‘z-o‘zidan hech narsa qilmaydi, natijani esa har ikki uchdagi hamkor belgilaydi.
O‘lchangan siklik GMP ham fermentni bevosita tekshirish natijasi emas, balki bir nechta jarayonni birlashtiruvchi ko‘rsatkichdir. Uning darajasi siklaza tomonidan sintezlanish va fosfodiesterazalar, ayniqsa qon tomir silliq mushagidagi PDE5 tomonidan parchalanish o‘rtasidagi farqni aks ettiradi. Shuning uchun siklik GMP ning pasayishi detektorga kamroq signal yetib borganini anglatadi. Bu o‘z-o‘zidan qaysi bo‘g‘in ishlamay qolganini ko‘rsatmaydi.
1-bo‘g‘in: kamroq iNOS fermenti hosil bo‘ladi
Bakterial lipopolisaxarid, interferon gamma yoki ikkalasi bilan qo‘zg‘atilgan sichqon makrofaglarida metilen ko‘ki iNOS oqsilining kutilgan ortishini oldini olgan va makrofaglardagi transkripsiya tajribalarida iNOS matritsali RNK sini kuchli darajada bostirgan. Muhim jihat — nimalar o‘zgarmaganidir. I kappa B alfa ingibitorining parchalanishi, NF kappa B va STAT1 ning fosforillanishi hamda ushbu omillarning yadroga ko‘chishi asosan saqlanib qolgan. Ularning DNK ga bog‘lanishi esa kamaygan; xromatin immunopretsipitatsiyasi iNOS promotoriga kamroq bog‘langanini ko‘rsatib, buni tasdiqlagan.
Bu mavjud fermentning tezkor bloklanishi emas, balki ferment miqdori shakllanishidan oldingi bosqichda yuz beradigan gen boshqaruvi ta’siridir. Bu yallig‘lanish signalizatsiyasiga tegishli: oqsil paydo bo‘lishidan oldin transkripsiya omillari promotorga bog‘lanishi kerak. Bu tinch holatdagi qon tomirida doimiy ifodalanadigan eNOS haqida bevosita hech narsa demaydi va aynan shu chegaralarda tasvirlanishi lozim.
2-bo‘g‘in: mavjud NOS fermenti sekinroq ishlaydi
Kalamushlarda o‘tkazilgan tadqiqot boshqa darajani tekshirgan. Hushyor erkak kalamushlarga vena ichiga lipopolisaxarid yuborilgan, so‘ng uch soatdan keyin vena ichiga fiziologik eritma yoki har kg ga 3 mg metilen ko‘ki yuborilgan. Gipotalamusdagi NOS faolligi tadqiqotida gipotalamusning medial bazal qismidagi azot oksidi sintazasi faolligi nishonlangan argininning sitrullinga aylanishi orqali o‘lchangan. Stress va faqat fiziologik eritma birgalikda kalsiyga bog‘liq bo‘lmagan ma’lum faollikni yuzaga keltirgan, lipopolisaxarid esa uni nazorat darajasidan taxminan o‘n baravar oshirgan. Metilen ko‘ki induksiyalangan ikkala komponentni ham yo‘qotgan. Shu to‘qimada, shu dozada va shu vaqt nuqtasida kalsiyga bog‘liq doimiy faollik o‘zgarmagan.
Natijani aynan yozilganidek talqin qiling: o‘sha sharoitlarda o‘lchangan iNOS turidagi faollik bostirilgan. Bu gen ekspressiyasining o‘lchovi emas va eNOS yoki nNOS ga nisbatan iNOS uchun doimiy selektivlikning isboti ham emas. Tozalangan ferment bilan o‘tkazilgan ishlar bu ehtiyotkorlikni yanada kuchaytiradi. Tozalangan azot oksidi sintazasining bevosita tahlillarida metilen ko‘ki 30 mikromolyar konsentratsiyada sitrullin hosil bo‘lishini to‘liq bloklagan. Yarim ingibitsiya konsentratsiyasi superoksid dismutazasiz taxminan 5.3 mikromolyar, u mavjud bo‘lganda esa 9.2 mikromolyar bo‘lgan; bu tozalangan NOS va guanilat siklazani taqqoslash tadqiqotida qayd etilgan. Tozalangan nNOS bo‘yicha alohida tadqiqot fermentga bog‘langan gemning oksidlanishi ishtirok etishini ko‘rsatgan. Amaliy xulosa shuki, ajratilgan tizimlarda NOS ning bevosita ingibirlanishi haqiqatan kuzatiladi, ammo gipotalamus natijasidan metilen ko‘ki hamma joyda barcha doimiy NOS shakllariga ta’sir qilmaydi degan umumiy da’voni chiqarib bo‘lmaydi.
3-bo‘g‘in: azot oksidi yetib borishidan oldin yo‘qoladi
Siklik GMP ning pasayishini ferment bloklanishidan boshqa narsa ham izohlashi mumkinligini eng aniq ko‘rsatgan tajriba kulturada o‘stirilgan quyon o‘pka arteriyasi silliq mushak hujayralarida o‘tkazilgan. Tajriba tuzilmasida azot oksidi donorlari bevosita qo‘shilib, endogen NOS butunlay chetlab o‘tilgan. So‘ng qon tomir silliq mushagidagi superoksid tadqiqotida metilen ko‘ki siklik GMP javobini baribir bostiradimi, degan savol tekshirilgan.
Uchta donor 1 dan 100 mikromolyargacha bo‘lgan konsentratsiyalarda tekshirilgan: S nitrozo L sistein, natriy nitroprussid va MPANO deb ataladigan barqaror deaminlangan analog. Ularning barchasi siklik GMP ni taxminan 1.5 baravardan 12 baravargacha oshirgan. 10 mikromolyar metilen ko‘ki dastlabki ikkitasining javobini 51 dan 100 foizgacha ingibirlagan, MPANO javobini esa o‘zgartirmagan. Agar metilen ko‘ki shunchaki siklazaning katalitik markazini bloklaganida, donorlar o‘rtasidagi bunday selektivlikni tushuntirish qiyin bo‘lardi, chunki uchalasi ham keyingi bosqichdagi bir xil fermentga ta’sir qiladi.
Keyin uchta nazorat mexanizmni superoksid bilan bog‘lagan. Birinchidan, ksantin va ksantin oksidaza yordamida hujayra tashqarisida superoksid hosil qilish ayni manzarani takrorlagan: CYSNO va nitroprussid ta’siri bloklangan, MPANO ta’siri esa saqlangan. Ikkinchidan, metilen ko‘ki silliq mushak hujayralarida doza va vaqtga bog‘liq superoksid hosil bo‘lishini keltirib chiqargan; bu sitoxrom c ning qaytarilishi orqali o‘lchangan. Uchinchidan, superoksid dismutaza ingibitsiyani to‘liq oldini olgan, katalaza esa bunday qilmagan. Bu o‘sha tajriba tizimida bevosita ta’sir qiluvchi kimyoviy zarracha vodorod peroksid emas, balki superoksid ekanini ko‘rsatadi.
Tajribaning birgalikda kultivatsiya qilingan variantini ham bayon qilish kerak, chunki u ta’sirning qayerda yuz berishini ko‘rsatadi. Qoplagich oynachalardagi endoteliy hujayralari qisqa muddat silliq mushak hujayralari bilan birgalikda kultivatsiya qilingan, natijada bazal sharoitda ajralgan endotelial omil silliq mushakdagi siklik GMP ni uch-sakkiz baravar oshirgan. Ikki hujayra guruhidan istalgan biriga oldindan metilen ko‘ki bilan ishlov berish bu signalni kamaytirgan, superoksid dismutaza esa endoteliyga oldindan ishlov berish ta’sirini qisman bartaraf etgan. Boshqacha aytganda, metilen ko‘ki silliq mushakdagi detektor hujayraning ichida ta’sir qilishi shart emas. U xabarchini yo‘lda yo‘qotish orqali signalni kamaytirishi mumkin. Metilen ko‘ki tadqiqotlarini o‘qish qo‘llanmasi buni umumiy qoida sifatida ko‘radi: molekulyar nishonni aytishdan oldin aralashuv qaysi bo‘limda amalga oshirilganini ko‘rsating.
Buni NOS ingibitsiyasi deb atash noto‘g‘ri bo‘ladi. Donorlar ishlashi uchun sintaza bosqichi talab etilmagan, lekin signal baribir pasaygan.
4-bo‘g‘in: detektorning o‘zi kamroq javob beradi
Eruvchan guanilat siklazaga bevosita ta’sirlar mavjud, ammo konsentratsiyalar muhim. Yuqorida keltirilgan tozalangan fermentlar taqqoslovida azot oksidi bilan qo‘zg‘atilgan siklazani yarim ingibirlash uchun taxminan 60 mikromolyar metilen ko‘ki talab etilgan, NOS ning yarim ingibitsiyasi esa taxminan 5 dan 9 mikromolyargacha kuzatilgan. Hatto 1 millimolyar konsentratsiya ham faqat qisman maksimal bloklanishga olib kelgan. Bu taxminan olti-o‘n bir baravar farqdir. Demak, past mikromolyar konsentratsiyadagi hujayra tajribasida siklik GMP kamayganini faqat siklik GMP ko‘rsatkichiga asoslanib, siklazaning selektiv ingibitsiyasi deb atab bo‘lmaydi.
Keyingi redoks tadqiqoti yana bir ehtiyotkorlik sababini qo‘shgan: metilen ko‘ki azot oksidi bilan faollashtirilgan siklazani gem temirining havoda oddiy oksidlanishidan farq qiluvchi mexanizm orqali faolsizlantirgan. Demak, detektorning ishlashi buzilishi mumkin, ammo kimyoviy mexanizm hali to‘liq aniqlanmagan. Konsentratsiyalar o‘rtasidagi farq esa past mikromolyar ta’sirlarda avvalo superoksid va NOS ta’sirlarini istisno qilish zarurligini anglatadi. Fosfodiesterazani nazorat qilish ham aynan shu yerga tegishli. Parchalanish o‘lchanmagan yoki bloklanmagan bo‘lsa, siklik GMP to‘planishining kamayishi kamroq sintez, tezroq parchalanish yoki ikkalasi bilan ham izohlanishi mumkin.
Nega buni qon bosimi haqidagi bitta da’voga qisqartirib bo‘lmaydi
Har bir bo‘g‘in boshqa tizimda aniqlangan. Makrofagdagi transkripsiya gipotalamusdagi ferment faolligi emas. Lipopolisaxariddan keyingi gipotalamus faolligi tinch holatdagi endotelial tonus emas. Birgalikdagi kulturada bazal sharoitda ajralgan endotelial omil agonist bilan qo‘zg‘atilgan tomir kengayishi emas. 10 mikromolyar metilen ko‘ki ta’siridagi kulturada o‘stirilgan o‘pka arteriyasi hujayralari inson qon aylanish tizimi emas. Ularning barchasini metilen ko‘ki azot oksidini bloklab qon bosimini oshiradi kabi bitta gapga birlashtirish nazorat tajribalari saqlab qolish uchun tuzilgan aynan o‘sha farqlarni yo‘qqa chiqaradi.
Uchta tekshiruv izohning aniqligini saqlaydi. Birinchidan, izoformani ko‘rsating: tinch holatdagi qon tomir tonusi uchun eNOS, induksiyalangan yallig‘lanish oqimi uchun iNOS, neyronal va ayrim tozalangan ferment sharoitlari uchun nNOS. Ikkinchidan, azot oksidi signali qanday yetkazilganini ko‘rsating: endogen sintez, bazal endotelial ajralish yoki CYSNO, nitroprussid yoxud MPANO kabi muayyan donor orqali. Chunki barqaror donor metilen ko‘ki ta’siriga chidamli bo‘lgan, beqaror donorlar esa bunday bo‘lmagan. Uchinchidan, konsentratsiyani va ta’sirni bartaraf etuvchi nazoratni ko‘rsating: superoksid dismutaza yordamida ta’sirning bartaraf etilishi superoksid ishtirokini ko‘rsatadi; katalazaning samarasizligi o‘sha tizimda vodorod peroksid ishtirokiga qarshi dalil beradi; ksantin oksidaza bilan ta’sirni takrorlash bu mexanizmning yetarli ekanini ko‘rsatadi; tozalangan ferment tahlillari esa katalizga bevosita ta’sirlarni yo‘ldagi yo‘qotishlardan ajratadi.
Qisqa xulosa shunday. Metilen ko‘kini selektiv siklaza blokatori emas, balki azot oksididan siklik GMP ga o‘tuvchi signalizatsiyaning bir nechta nuqtasiga ta’sir qiluvchi modda sifatida ko‘rish to‘g‘riroq. Tajriba tizimi va konsentratsiyaga qarab, u iNOS transkripsiya omillarining bog‘lanishini kamaytirishi, NOS fermentlarini bevosita ingibirlashi, superoksid hosil qilish orqali mavjud azot oksidi miqdorini kamaytirishi va azot oksidi bilan faollashtirilgan siklaza faoliyatini buzishi mumkin. Qon tomir tadqiqotlarida siklik GMP signalizatsiyasining roli va hujayra tahlillarida ishlatiladigan azot oksidi donorlarini taqqoslash ushbu yo‘nalishlarning bittadan tarmog‘ini batafsilroq yoritadi. Redoks ta’sirlarini fermentga ta’sirlardan ajratish usullari esa nega bu adabiyotlarda superoksid dismutaza, katalaza va barqaror donor nazorati birgalikda tez-tez uchrashini tushuntiradi.
Metilen ko‘kidan keyingi past siklik GMP qiymati zanjir uzilganini ko‘rsatadi. Qaysi bo‘g‘in uzilganini faqat nazorat tajribalari aniqlaydi.