نیو میتھیلین بلیو اور ریٹیکیولوسائٹ کی رنگ آمیزی: ایک الگ رنگ اور زندہ خلیات کا طریقہ

ایک طالب علم ریٹیکیولوسائٹس کی گنتی کی تیاری کرتا ہے، میتھیلین بلیو منگواتا ہے، اسے خون میں ملاتا ہے، اور اسے تقریباً کچھ بھی دکھائی نہیں دیتا۔ ایک ہم جماعت نیو میتھیلین بلیو کے لیبل والی بوتل استعمال کرتا ہے اور کچھ سرخ خلیات کے اندر واضح نیلے ریشے دیکھتا ہے۔ پہلا طالب علم سمجھتا ہے کہ دوسری بوتل کا رنگ زیادہ تازہ یا زیادہ مرتکز ہے۔ دونوں باتیں غلط ہیں۔ اس میں ایک مختلف سالمہ موجود ہے۔

اس موضوع میں زیادہ تر الجھن کی بنیاد یہی تصوراتی غلطی ہے۔ نام سے لگتا ہے کہ نیو میتھیلین بلیو، میتھیلین بلیو کی بہتر کھیپ ہے۔ کیمیائی ساخت اس کے برعکس ہے۔ نیو میتھیلین بلیو N ایک الگ فینوتھیازین رنگ ہے، جس کا اپنا کلر انڈیکس نمبر، اپنی کیمیائی ساخت میں متبادل گروپوں کی ترتیب، اور علمِ امراضِ خون میں اپنا معیاری کردار ہے۔ یہ فرق واضح ہونے کے بعد طریقے کی باقی باتیں آسان ہو جاتی ہیں: رنگ آمیزی کے وقت خلیات کا زندہ ہونا کیوں ضروری ہے، کس خلیے کو ریٹیکیولوسائٹ شمار کیا جاتا ہے، ہائنز باڈیز کی کیا حیثیت ہے، اور بریلینٹ کریسل بلیو کب استعمال ہوتا ہے۔

مختصر جواب

علمِ امراضِ خون میں استعمال ہونے والا ری ایجنٹ نیو میتھیلین بلیو N عموماً نیو میتھیلین بلیو کے PubChem ریکارڈ میں بیسک بلیو 24، C.I. 52030، CAS 1934-16-3، فارمولا C18H22ClN3S کے طور پر شناخت کیا جاتا ہے۔ عام میتھیلین بلیو اپنے PubChem ریکارڈ میں میتھیل تھیونینیم کلورائیڈ، بیسک بلیو 9، C.I. 52015، CAS 61-73-4، فارمولا C16H18ClN3S ہے۔ ساخت کے لحاظ سے نیو میتھیلین بلیو کے حلقے پر دو میتھائل گروپ اور ایتھائل امینو ضمنی زنجیریں ہوتی ہیں، جبکہ میتھیلین بلیو میں ڈائی میتھائل امینو گروپ ہوتے ہیں۔ یہ فرق رنگ آمیزی کے رویے کو بدل دیتا ہے۔ علمِ امراضِ خون کی کتابیں عام میتھیلین بلیو کو ریٹیکیولوسائٹس کے لیے نسبتاً کمزور رنگ قرار دیتی ہیں، جبکہ نیو میتھیلین بلیو زیادہ گہری اور یکساں رنگ آمیزی کرتا ہے۔ اس موازنے کا خلاصہ ScienceDirect کے نیو میتھیلین بلیو سے متعلق موضوع میں موجود ہے۔

جی ہاں، نیو میتھیلین بلیو ایک سپراوائٹل رنگ ہے۔ سپراوائٹل رنگ آمیزی کا مطلب جسم سے نکالے جانے کے بعد اور تثبیت سے پہلے زندہ خلیات کی رنگ آمیزی کرنا ہے، جیسا کہ سپراوائٹل رنگ آمیزی کے اصولوں کے NCBI جائزے میں تعریف کی گئی ہے۔ نیو میتھیلین بلیو اور بریلینٹ کریسل بلیو دونوں اس زمرے میں آتے ہیں، اور CLSI کا ریٹیکیولوسائٹ معیار واضح طور پر نیو میتھیلین بلیو کو سپراوائٹل رنگ کے طور پر شامل کرتا ہے۔ طلبہ بعض اوقات اسے تثبیت شدہ اسمیرز کی رومانووسکی رنگ آمیزی کے ساتھ ایک ہی زمرے میں رکھ دیتے ہیں۔ یہاں یہ تصور درست نہیں۔ پہلے تثبیت کر دیں تو طریقہ کام کرنا بند کر دیتا ہے۔

ملتے جلتے رنگوں کے ناموں کو سمجھنے والے قارئین کے لیے، میتھائل بلیو اور میتھیلین بلیو کا موازنہ ایک اینیونی ٹرائی ایرائل میتھین رنگ اور کیٹیونی فینوتھیازین خاندان کے درمیان ایک مختلف اور بڑی الجھن کو واضح کرتا ہے۔ تجربہ گاہ میں رنگ آمیزی کا جائزہ تثبیت شدہ اسمیرز کے طریقوں کے ساتھ سپراوائٹل کام کا مقام واضح کرتا ہے، اور خون کے خلیات کی شکلیات کی رہنما تحریر بتاتی ہے کہ خون کے مختلف خلیات کے وسیع تر امتیازی جائزے میں ریٹیکیولوسائٹس کی جانچ کہاں آتی ہے۔

کیٹلاگ سے متعلق ایک احتیاط: نیو میتھیلین بلیو کی زنک کلورائیڈ والی ایک الگ دوہرے نمک کی شکل CAS 6586-05-6 کے تحت موجود ہے۔ اس لیے طریقۂ کار کے حصے میں صرف عام نام کے بجائے نمکی شکل اور فراہم کنندہ کا نام بھی دینا چاہیے۔

سپراوائٹل رنگ آمیزی دراصل کیا کرتی ہے

ریٹیکیولوسائٹ ایک نوخیز سرخ خلیہ ہے جو اپنا مرکزہ کھو چکا ہوتا ہے، لیکن اس میں رائبوسومی RNA کی باقیات موجود ہوتی ہیں۔ بغیر رنگ آمیزی کے مرطوب نمونے میں یہ RNA دکھائی نہیں دیتا۔ سپراوائٹل رنگ زندہ خلیے میں داخل ہوتا ہے اور اس RNA کو رسوب یا تجمع کی صورت میں نیلے ذرات اور ریشوں میں بدل دیتا ہے۔ یہی جالی دار ریشے دار مادہ روغنی عدسے سے دکھائی دیتا ہے۔ لہٰذا یہ جال رنگ آمیزی کے نتیجے میں بنتا ہے، یہ پہلے سے موجود کوئی ڈھانچا نہیں جو صرف رنگ کا منتظر ہو۔ اسی لیے پروٹوکول کے متغیرات، یعنی رنگ کا ارتکاز، بفر، خون اور رنگ کا تناسب، درجہ حرارت اور وقت، رنگ کے نام جتنے ہی اہم ہیں۔

عملی نتیجہ یہ ہے کہ کام کی ترتیب سختی سے مقرر ہے: پہلے مانعِ انعقاد کے ساتھ لیے گئے خون کو رنگ میں ملائیں، انکیوبیٹ کریں، پھر اسمیرز بنائیں اور تثبیت اور ثانوی رنگ آمیزی کے بغیر ان کا معائنہ کریں۔ رنگ آمیزی سے پہلے تثبیت، یا ایسی ثانوی رنگ آمیزی جو مدھم ریشوں کو چھپا دے، اس معلومات کو ختم کر دیتی ہے جس پر گنتی منحصر ہوتی ہے۔

نیو میتھیلین بلیو کے ساتھ ریٹیکیولوسائٹس کا عملی پروٹوکول

کوئی ایک عالمگیر ترکیب موجود نہیں، اس لیے استعمال کی گئی ترکیب درج کریں۔ تین دستاویزی صورتیں اس تنوع کو ظاہر کرتی ہیں۔

روایتی بریخر طرز کا طریقہ پوٹاشیم آکسالیٹ کے ساتھ تقریباً 0.5 percent نیو میتھیلین بلیو استعمال کرتا ہے۔ اسے اچھی طرح ملائے گئے EDTA خون کے برابر حجم میں ملایا جاتا ہے، اور کمرے کے درجہ حرارت پر تقریباً 10 سے 15 minutes تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ آہستگی سے دوبارہ ملانے کے بعد باریک، پچر نما اسمیرز تیار کیے جاتے ہیں، ہوا میں خشک کیے جاتے ہیں، اور تثبیت کے بغیر 100x روغنی آبجیکٹو عدسے سے دیکھے جاتے ہیں۔ ریٹیکیولوسائٹس کی گنتی کا NCBI طریقہ اس عملی ترتیب اور اس کے ساتھ استعمال ہونے والے گنتی کے فریم کو بیان کرتا ہے۔

ڈیسی اور لیوس کی صورت میں سائٹریٹ سالین میں 1.0 percent نیو میتھیلین بلیو استعمال کیا جاتا ہے۔ اسے خون کے 2 سے 4 حجم کے ساتھ ملا کر اسمیر بنانے سے پہلے 37 C پر 15 سے 20 minutes تک رکھا جاتا ہے۔ CLSI H44 طریقے کو ہم آہنگ کرنے کی ایک حالیہ عملی صورت میں pH 7.4 پر فاسفیٹ بفرڈ سالین میں اس سے کم ارتکاز والا 0.1 percent محلول استعمال کیا گیا، جسے 20 C پر 10 minutes تک انکیوبیٹ کیا گیا اور تثبیت نہیں کی گئی۔ یہ تفصیلات 2026 کے NMB ہم آہنگی مطالعے میں درج ہیں۔

گنتی کے اصول تمام صورتوں میں مشترک ہیں۔ کسی خلیے کو ریٹیکیولوسائٹ تب شمار کریں جب اس میں کم از کم دو الگ نیلے رنگ پذیر ذرات یا ریشوں کے ٹکڑے موجود ہوں۔ اس شرط سے رنگ کے کسی اکیلے جمع شدہ ذرے کو شمار کرنے سے بچا جاتا ہے۔ معمول کے کام میں کم از کم 1,000 سرخ خلیات گنیں اور ریٹیکیولوسائٹس کو فیصد کے طور پر درج کریں۔ کم فیصد پر شماریاتی اعتبار سے زیادہ خلیات گننا ضروری ہوتا ہے۔ CLSI H44 طریقۂ کار کا ایک جائزہ بتاتا ہے کہ تقریباً 1 percent ریٹیکیولوسائٹس کی سطح پر گنتی کے تغیر کو 5 percent تک لانے کے لیے تقریباً 4,400 خلیات درکار ہوتے ہیں۔ یہ بات De Gruyter پر CLSI H44 کے جائزے میں درج ہے۔ ملر آکیولر ڈسک بڑی تعداد میں گنتی کو عملی بناتی ہے۔ رنگ کو فلٹر کریں یا تازہ تیار کریں، کیونکہ رسوب خلیے کے اندر موجود دانے دار اجسام جیسا دکھائی دے سکتا ہے۔

اسی نمونے میں ہائنز باڈیز

اسی سپراوائٹل اسمیر میں ہائنز باڈیز بھی ظاہر ہو سکتی ہیں۔ یہ باقی ماندہ RNA کے بجائے آکسیڈائز شدہ اور اپنی اصل ساخت کھو چکے ہیموگلوبن کے تجمعات ہوتی ہیں۔ نیو میتھیلین بلیو کے نمونوں میں یہ گول اجسام کی صورت میں دکھائی دیتی ہیں، اکثر اکیلی اور جھلی کے قریب ہوتی ہیں، اور جالی دار ریشے دار مادے کے مقابلے میں ہلکے نیلے رنگ میں رنگ پذیر ہوتی ہیں۔ تثبیت اور ثانوی رنگ آمیزی کے دوران یہ اچھی طرح برقرار نہیں رہتیں، اس لیے بغیر تثبیت والا اسمیر دیکھیں۔ ایک حالیہ پروٹوکول میں 20 microliters EDTA خون کے ساتھ 20 microliters مقدار میں 1 percent نیو میتھیلین بلیو اور 15 minutes کی انکیوبیشن استعمال کی گئی۔ اس میں 250 سرخ خلیات میں ہائنز باڈیز رکھنے والے خلیات کی تعداد متعین کی گئی، جیسا کہ اس طریقے کو بیان کرنے والے PMC مطالعے میں درج ہے۔

دو فرق غلط تشریح سے بچاتے ہیں۔ پہلا، میتھائل وائلٹ اور کرسٹل وائلٹ، نیو میتھیلین بلیو کے مقابلے میں ہائنز باڈیز کو زیادہ گہرے رنگ میں رنگتے ہیں، جیسا کہ ScienceDirect کے ہائنز باڈیز سے متعلق موضوع میں بتایا گیا ہے۔ جب ریٹیکیولوسائٹس اور ہائنز باڈیز کو ایک ساتھ جانچا جائے تو نیو میتھیلین بلیو ایک سہل انتخاب ہے، لیکن صرف ہائنز باڈیز کے لیے یہ سب سے زیادہ مؤثر رنگ نہیں۔ دوسرا، الفا تھیلیسیمیا ٹریٹ میں HbH کے اندرونِ خلیہ اجسام سپراوائٹل رنگ آمیزی کے بعد خلیے بھر میں متعدد باریک نقطوں کی صورت میں ظاہر ہوتے ہیں، جبکہ روایتی ہائنز باڈیز تعداد میں کم، جسامت میں بڑی اور اکثر جھلی سے وابستہ ہوتی ہیں۔ رنگ کا جمع شدہ مادہ تیسری مشابہ صورت ہے: یہ خلیات کے فوکل مستوی سے باہر ہوتا ہے اور مختلف خوردبینی میدانوں میں بدلتا رہتا ہے۔

بریلینٹ کریسل بلیو اور نیو میتھیلین بلیو کا موازنہ

دونوں رنگ ریٹیکیولوسائٹس کے لیے سپراوائٹل رنگ ہیں، لیکن معیار بندی میں ان میں سے ایک کو ترجیح حاصل ہے۔ CLSI H44-A2 ریٹیکیولوسائٹ طریقہ، جو علمِ امراضِ خون میں معیار بندی کی بین الاقوامی کونسل کے ساتھ مشترکہ طور پر تیار کیا گیا اور CLSI H44 معیار کے صفحے پر درج ہے، EDTA خون کی نیو میتھیلین بلیو سے رنگ آمیزی کو دستی تقابلی طریقہ مقرر کرتا ہے۔ علمِ امراضِ خون کی روایتی تعلیم ظاہری نتائج کے بارے میں بھی یہی بتاتی ہے: نیو میتھیلین بلیو ریشوں کو زیادہ گہرا اور یکساں رنگ دیتا ہے، جبکہ بریلینٹ کریسل بلیو میں مختلف کھیپوں اور نمونوں کے درمیان زیادہ فرق ہوتا ہے۔

اس حیثیت کے ساتھ ایک وضاحت ضروری ہے۔ تجزیاتی آلات کی جانچ کے لیے ICSH رہنما اصول دستی نیو میتھیلین بلیو خوردبینی معائنے کو حوالہ جاتی موازنے کے طریقے کے طور پر قبول کرتے ہیں، لیکن اسے مشاہدہ کرنے والے کے فیصلے پر منحصر اور نسبتاً کم دقیق قرار دیتے ہیں۔ جہاں دستیاب ہوں، وہاں فلو سائٹومیٹری کے حوالہ جاتی طریقوں کو ترجیح دی جاتی ہے۔ 2022 میں 100 نمونوں کے موازنے میں استعمال شدہ تجزیاتی آلے کے مقابلے میں بریلینٹ کریسل بلیو کے نتائج میں نیو میتھیلین بلیو کی نسبت کم منظم انحراف ملا۔ یہ نتیجہ رنگ آمیزی کے طریقوں کے PMC موازنے میں درج ہے۔ طلبہ کے لیے قابلِ دفاع خلاصہ یہ ہے: نیو میتھیلین بلیو کو معیاری دستی تقابلی طریقے کے طور پر استعمال کریں، کسی بھی مقامی بریلینٹ کریسل بلیو طریقے کو اس کے یا خودکار طریقے کے مقابلے میں تصدیق کریں، اور دونوں صورتوں میں دستی خوردبینی معائنے سے نتائج میں زیادہ پھیلاؤ کی توقع رکھیں۔ معیار بندی کے پرانے لٹریچر نے صاف شدہ Azure B کو کیمیائی لحاظ سے زیادہ خالص متبادل کے طور پر بھی تجویز کیا تھا، کیونکہ تجارتی رنگوں کی کھیپیں مختلف ہوتی تھیں۔ یہ بات Azure B پر مارشل کے مطالعے میں درج ہے، اور اسی سے واضح ہوتا ہے کہ طریقۂ کار کی بحث میں ری ایجنٹ کا گریڈ اب بھی کیوں زیرِ بحث آتا ہے۔

عام غلطیوں سے بچنا

زیادہ تر ناکام نمونوں کی وجہ چار غلطیاں ہوتی ہیں۔ نیو میتھیلین بلیو N کے بجائے عام میتھیلین بلیو منگوانے سے کیمیائی فرق کی وجہ سے رنگ آمیزی کمزور ہوتی ہے، تکنیک کی وجہ سے نہیں۔ معائنے سے پہلے تثبیت یا ثانوی رنگ آمیزی سپراوائٹل نشان کو ختم کر دیتی ہے۔ رنگ کے رسوب کو ذرات سمجھ کر گننے سے نتیجہ بڑھ جاتا ہے، جس سے دو ذرات کا اصول اور فلٹر کیا ہوا رنگ بچاتے ہیں۔ ریٹیکیولوسائٹس کے کم فیصد پر بہت کم خلیات گننے سے ایسا عدد حاصل ہوتا ہے جو بظاہر دقیق لگتا ہے، لیکن اس کے اعتماد کی حدود وسیع ہوتی ہیں۔ ہر غلطی کی ایک ہی علامت ہے: خوردبین سے معائنہ کرنے والا اس نتیجے کا ذمہ دار خوردبین کو سمجھتا ہے جس کا تعین ری ایجنٹ کے مرحلے میں ہو چکا تھا۔