میتھیلین بلیو کے تجربات میں آکسیجن کی فعّال انواع کی پیمائش

دو تجربہ گاہیں ایسے تجربات کرتی ہیں جنہیں دونوں میتھیلین بلیو کی اینٹی آکسیڈنٹ خصوصیات کا تجربہ کہتی ہیں۔ ایک بتاتی ہے کہ یہ رنگ آکسیجن کی فعّال انواع کو دباتا ہے۔ دوسری بتاتی ہے کہ یہ انہیں پیدا کرتا ہے۔ دونوں خوراک اور ردعمل کے واضح منحنی خطوط دکھاتی ہیں۔ دونوں دیانت دار ہیں۔ فرق نہ دھوکے کا ہے، نہ نااہلی کا۔ اصل بات یہ ہے کہ دونوں گروہوں نے مختلف روشنی میں، ایسے پروبز کے ساتھ مختلف چیزیں ناپیں جو مختلف سوالات کے جواب دیتے ہیں، اور پھر دونوں جوابوں کو ایک ہی لفظ سے بیان کیا: ROS۔

میتھیلین بلیو کی درست پیمائش اس لیے مشکل ہے کہ یہ خود اس کیمیائی عمل میں شریک ہوتا ہے جس کا اسے مشاہدہ کرنا ہوتا ہے۔ اندھیرے میں یہ الیکٹران دینے والے اور قبول کرنے والے مادّوں کے درمیان الیکٹران منتقل کرتا ہے اور اپنی ابتدائی شکل میں واپس آ جاتا ہے، تاکہ یہ چکر دوبارہ چلا سکے۔ روشنی میں یہ ایک ضیائی حساس کار بن جاتا ہے اور ایک برانگیختہ ٹرپلٹ حالت تک پہنچتا ہے۔ اس حالت سے یہ آکسیجن کو توانائی دے کر سنگلٹ آکسیجن بنا سکتا ہے، یا الیکٹران منتقل کر کے ریڈیکلز اور ہائیڈروجن پرآکسائیڈ پیدا کر سکتا ہے۔ اس نظام میں شامل کوئی بھی پروب خود رنگ کے ہاتھوں آکسیڈائز، ریڈیوس یا بے رنگ ہو سکتا ہے، یا اس کا نوری سگنل چھپ سکتا ہے۔ اس لیے ROS کی کسی بھی پیمائش میں پہلا سوال کبھی یہ نہیں ہوتا کہ عدد کیا ہے۔ پہلا سوال یہ ہوتا ہے کہ جانچ حقیقتاً کس چیز کا پتا لگاتی ہے، اور رنگ اس جانچ پر کیا اثر ڈالتا ہے۔

Amplex Red: ہائیڈروجن پرآکسائیڈ کی کیلیبریٹ شدہ جانچ

میتھیلین بلیو اور Amplex Red کا امتزاج، اگر درست طریقے سے ترتیب دیا جائے، تو اس تحقیقی لٹریچر میں سب سے زیادہ قابلِ دفاع جوڑی ہے۔ اس کی کیمیا مخصوص ہے: ہارس ریڈش پرآکسیڈیز، ہائیڈروجن پرآکسائیڈ کی مدد سے Amplex سبسٹریٹ کو تقریباً ایک بہ ایک اسٹائکیومیٹری میں ایک فلوروسینٹ مصنوع، ریسوروفن، میں آکسیڈائز کرتا ہے۔ نمونے کی پرآکسائیڈ ڈٹیکٹر میں فلوروسینس کی صورت اختیار کرتی ہے۔ ROS کے روایتی خاندان کا کوئی اور رکن براہِ راست یہ تعامل نہیں چلاتا۔

اس کا فیصلہ کن فائدہ کیلیبریشن ہے۔ ایک محتاط محقق اسی بفر میں، پرآکسیڈیز اور سبسٹریٹ کے یکساں ارتکاز، یکساں انکیوبیشن وقت اور یکساں نوری ترتیبات کے ساتھ پرآکسائیڈ کے معلوم معیارات چلاتا ہے، پھر نمونوں کے نتائج کو اس منحنی خط سے موازنہ کر کے پڑھتا ہے۔ الگ کیے گئے دماغی مائٹوکانڈریا کے اس مطالعے میں، جس پر اس طریقے کی بنیاد ہے، مصنفین نے بالکل یہی کیا: ہر تجرباتی دور کے آخر میں پرآکسائیڈ کی معلوم مقداریں شامل کیں، اور نتائج کو من مانے فلوروسینس یونٹس کے بجائے فی ملی گرام پروٹین، فی منٹ پیکومول کی شرح کے طور پر بیان کیا۔ یہی عمل چمک کو پیمائش میں بدلتا ہے۔

اس مطالعے کی تین تفصیلات اپنانے کے قابل ہیں۔ پہلی، مصنفین نے کیٹالیز سے سگنل کی تصدیق کی، جو پرآکسائیڈ کو توڑ دیتا ہے۔ کیٹالیز شامل کرنے پر میتھیلین بلیو سے پیدا ہونے والا فلوروسینس کا اضافہ رک گیا، جس سے تصدیق ہوئی کہ سگنل پرآکسائیڈ کا تھا، نہ کہ کوئی نوری آرٹیفیکٹ۔ دوسری، انہوں نے برانگیختگی کی شعاع کو شٹر سے روک کر روشنی کا براہِ راست امتحان کیا، تاکہ نمونوں کو روشنی کی معمول کی مقدار کا آٹھواں حصہ ملے؛ سگنل صرف نو فیصد کم ہوا۔ ان کی رپورٹ کردہ پرآکسائیڈ کا نوے فیصد سے زیادہ حصہ پیمائش کی روشنی سے آزاد تھا۔ تیسری، انہوں نے ایک الیکٹروڈ سے پرآکسائیڈ کے خاتمے کو الگ ناپا اور پایا کہ رنگ نے اس کی پیداوار بھی بڑھائی اور اسے دور کرنے کا عمل بھی سست کیا۔ صرف خالص فلوروسینس بتانے والا پروب ان دونوں اثرات کو ایک ہی نتیجے میں ملا دیتا۔

اس جانچ میں اب بھی خرابی کے امکانات موجود ہیں، اور میتھیلین بلیو ان میں سے کئی کو نمایاں کر دیتا ہے۔ رنگ اسی سرخ خطے میں وسیع پیمانے پر روشنی جذب کرتا ہے جہاں ریسوروفن روشنی خارج کرتا ہے، اس لیے رنگ کے زیادہ ارتکاز پر نمونہ اندرونی فلٹر اثرات کے ذریعے اپنا ہی سگنل چھپا سکتا ہے۔ لہٰذا معیارات میں رنگ کا ارتکاز نمونوں جیسا ہی ہونا چاہیے۔ Amplex Red خود بھی روشنی سے آکسیڈائز ہو سکتا ہے، اور اس کی مصنوع ریسوروفن فوٹوریڈوکس چکر میں داخل ہو سکتی ہے، جو سپرآکسائیڈ اور پرآکسائیڈ پیدا کرتا ہے۔ یہ بات خاص طور پر اس وقت اہم ہوتی ہے جب تجربے میں کسی ضیائی حساس کار کو بھی روشن کیا جا رہا ہو۔ اس کا عملی حل یہ ہے کہ پہلے میتھیلین بلیو کے نمونوں کو روشنی دی جائے، پھر ان کے حصوں کی Amplex ری ایجنٹس کے ساتھ اندھیرے میں جانچ کی جائے، بجائے اس کے کہ رنگ اور پروب کو ایک ساتھ روشن کیا جائے۔ آخر میں، سپرآکسائیڈ ڈسمیوٹیز محض Amplex سگنل کو نہیں دباتا: سپرآکسائیڈ کو پرآکسائیڈ میں بدلنے سے سگنل بڑھ بھی سکتا ہے۔ فلوروسینس بڑھانے والا SOD کنٹرول ناکام نہیں ہوا۔ اس نے سپرآکسائیڈ کو تعامل کے پہلے مرحلے میں موجود نوع کے طور پر شناخت کیا ہے۔

DCFDA: آکسیڈیشن کا ایک غیر مخصوص اشاریہ

میتھیلین بلیو اور DCFDA کی جوڑی زیادہ تر الجھن کا باعث ہے۔ DCFH-DA ایک پیش رو مرکب ہے جو خلیے میں داخل کیا جاتا ہے۔ خلیے کے اندر ایسٹریز انزائم اس کے ایسیٹیٹ گروپس ہٹا دیتے ہیں، جس سے غیر فلوروسینٹ DCFH باقی رہتا ہے، اور DCFH کی آکسیڈیشن سے فلوروسینٹ DCF بنتا ہے۔ اسے آکسیڈائز کرنے والے مادّوں کی فہرست طویل ہے: ہائیڈروکسل ریڈیکلز، پرآکسیڈیز اور ہیم کے درمیانی مرکبات، نائٹروجن ڈائی آکسائیڈ، ہائپوکلورس ایسڈ، اور پرآکسی نائٹرائٹ سے بننے والے ریڈیکلز۔ اکیلی ہائیڈروجن پرآکسائیڈ اسے کسی کارآمد شرح سے براہِ راست آکسیڈائز نہیں کرتی؛ پرآکسائیڈ پر منحصر فلوروسینس کے لیے عموماً اس عمل میں آئرن، ہیم پروٹینز یا پرآکسیڈیز کی کیمیا درکار ہوتی ہے۔

وہ تنقید جس کا حوالہ ہر طریقۂ کار کے حصے میں ہونا چاہیے، کلیانارامن اور ان کے ساتھیوں کے اس تجزیے سے آتی ہے جس میں DCFH کو بطور پروب جانچا گیا تھا۔ اس کا خلاصہ دماغی مائٹوکانڈریا کے اس مطالعے میں دیا گیا ہے جس نے اسی وجہ سے DCFDA کو مسترد کیا۔ انہوں نے دکھایا کہ یہ رنگ آہستہ تعامل کرتا ہے، اس کی اسٹائکیومیٹری غیر متعین ہے، اس کی درست کیلیبریشن نہیں ہوتی، اور یہ غیر ROS مرکبات سے بھی تعامل کرتا ہے۔ پروب اس عمل کو بڑھاتا بھی ہے جسے وہ ناپتا ہے: DCFH کی ایک الیکٹران والی آکسیڈیشن سے DCF ریڈیکل بنتا ہے، جو آکسیجن کے ساتھ تعامل کر کے سپرآکسائیڈ بناتا ہے، اور یہ ڈسمیوٹیشن کے ذریعے مزید پرآکسائیڈ پیدا کرتا ہے۔ یوں پیمائش جزوی طور پر وہ کیمیا خود پیدا کرتی ہے جس کی وہ خبر دیتی ہے۔

ان باتوں میں سے کوئی بھی DCFDA کو بے کار نہیں بناتی۔ یہ اسے ابتدائی چھان بین کا ذریعہ بناتی ہیں، شناخت کا نہیں۔ DCF فلوروسینس میں اضافے کا مطلب ہے کہ آکسیڈنٹ پر منحصر پروب کی آکسیڈیشن بڑھی ہے۔ اس کا مطلب یہ نہیں کہ پرآکسائیڈ بڑھی، اور یقیناً یہ بھی نہیں کہ مجموعی ROS بڑھی، کیونکہ یہ ایسی مقدار ہے جسے کوئی ایک پروب نہیں ناپتا۔ میتھیلین بلیو پر پہلے ہونے والے کام میں، جو ایک مائیکرومولر سے زیادہ ارتکاز پر DCF کی آکسیڈیشن پر انحصار کرتا تھا، پروآکسیڈنٹ اثرات رپورٹ کیے گئے؛ جبکہ اسی دور کے دوسرے نظاموں میں پرآکسائیڈ سے پیدا ہونے والی خلیاتی موت کے خلاف تحفظ رپورٹ ہوا۔ مختلف ریڈوکس حالات میں ایک ہی رنگ کے لیے دونوں مشاہدات درست ہو سکتے ہیں، اور اکیلا DCF نتیجہ یہ نہیں بتا سکتا کہ سگنل کس آکسیڈنٹ سے آیا۔ دماغی مائٹوکانڈریا پر پہلے ہونے والے کام کی اہمیت یہ ہے کہ اس نے اس ابتدائی چھان بین کو پرآکسائیڈ کی کیلیبریٹ شدہ پیمائش سے بدل دیا اور اس اضافے کو براہِ راست ناپا: حتیٰ کہ ایک سو نینومولر رنگ نے بھی جانچے گئے ہر سبسٹریٹ اور تنفسی حالت میں پرآکسائیڈ کے اخراج کو کئی گنا بڑھایا۔

DCFDA میں میتھیلین بلیو سے مخصوص ایک اور دام بھی ہے۔ یہ رنگ گہرا رنگین اور ریڈوکس کے لحاظ سے فعّال ہے، اس لیے یہ فلوروسینس کو زائل کر سکتا ہے، خارج ہونے والی روشنی کو بجھا سکتا ہے، یا خلیاتی ROS سے آزاد ہو کر پروب کی کیمیا کو آکسیڈائز کر سکتا ہے۔ رنگ اور پروب پر مشتمل، مگر خلیات کے بغیر، ایک کنٹرول محض اختیاری آرائش نہیں ہے۔ یہی وہ تجربہ ہے جو بتاتا ہے کہ آیا رنگ پروب کے ساتھ براہِ راست تعامل کرتا ہے۔

اسپن ٹریپنگ اور آکسیجن کا استعمال: شناخت اور بہاؤ

جہاں فلوروسینٹ پروبز یہ بتاتے ہیں کہ کوئی آکسیڈائز ہونے والی چیز نمودار ہوئی، وہاں اسپن ٹریپس کے ساتھ الیکٹران اسپن ریزوننس اس چیز کی شناخت کے زیادہ قریب پہنچتا ہے۔ میتھیلین بلیو کی ضیائی کیمیا کے معروف مطالعے میں رنگ، ایسکوربیٹ اور روشنی سے بننے والے ایسکوربیٹ ریڈیکل کا پتا لگانے کے لیے ESR استعمال کیا گیا، پھر آکسیجن کے استعمال کے تجربات میں پرآکسائیڈ کی تشکیل اور اسپن ٹریپنگ کے تجربات میں آئرن کی اتپریرک کارروائی سے ہائیڈروکسل ریڈیکل کی تشکیل دکھائی گئی۔ ہر تکنیک نے اس سوال کا جواب دیا جو دوسری تکنیکیں نہیں دے سکتی تھیں: ESR نے ریڈیکل کی شناخت بتائی، آکسیجن کے استعمال نے کسی بھی فلوروسینٹ پروب سے آزاد تعامل کا بہاؤ بتایا، اور دونوں کے امتزاج نے دکھایا کہ اسی روشن کیے گئے نظام میں سنگلٹ آکسیجن اور ریڈیکل، دونوں کے راستے کام کر رہے تھے۔

1984 کا یہ نتیجہ آج بھی ایک انتباہ کی طرح پڑھا جاتا ہے۔ روشنی اور ایک ریڈیوسنگ ایجنٹ کی موجودگی میں رنگ نے پرآکسائیڈ پیدا کی، اور آئرن موجود ہونے پر نظام نے ہائیڈروکسل ریڈیکل پیدا کیا، جو اس مجموعے کی سب سے زیادہ فعّال نوع ہے۔ مصنفین نے اسے آنکھ میں موجود ایسکوربیٹ سے جوڑا اور آنکھوں میں اس کے بے احتیاط استعمال پر سوال اٹھایا۔ آج کے قارئین کو حالات پر توجہ دینی چاہیے: روشنی کے ساتھ ریڈیوسنگ مادّہ اور آئرن۔ ان میں سے کوئی ایک ہٹا دیں تو یہ راستہ کمزور پڑ جاتا ہے یا ختم ہو جاتا ہے۔

آکسیجن الیکٹروڈز کی اہمیت مختلف وجہ سے ہے۔ کلارک قسم کا الیکٹروڈ آکسیجن کی خالص کھپت ناپتا ہے، جس سے ثابت ہوتا ہے کہ رنگ کے زیرِ اثر ریڈوکس کیمیا سالماتی آکسیجن استعمال کر رہی ہے، اور ایسی حرکی معلومات ملتی ہیں جنہیں کوئی فلوروسینس آرٹیفیکٹ جعلی طور پر پیدا نہیں کر سکتا۔ یہ مصنوع کی شناخت نہیں کرتا۔ پرآکسائیڈ، سپرآکسائیڈ اور پانی کی تشکیل، اور سنگلٹ آکسیجن کا زوال، سب آکسیجن استعمال کرتے ہیں۔ شناخت کے بغیر بہاؤ اتنا ہی نامکمل ہے جتنی بہاؤ کے بغیر شناخت؛ اسی لیے مضبوط تحقیقی مقالات الیکٹروڈ کے ساتھ پرآکسائیڈ کی کیلیبریٹ شدہ جانچ یا کسی ٹریپ کو استعمال کرتے ہیں۔

اینٹی آکسیڈنٹ نتائج میں تضاد کیوں ہوتا ہے

ان تینوں پیمائشوں کو ساتھ رکھیں تو میتھیلین بلیو کے لٹریچر میں نظر آنے والے تضادات، طریقوں کے فرق اور تین حیاتیاتی حقائق سے واضح ہو جاتے ہیں۔

پہلا، یہ رنگ الیکٹران منتقل کرنے والا بھی ہے اور پرآکسائیڈ کا ذریعہ بھی۔ الیکٹرانوں کو ان تنفسی مقامات سے دوسری طرف موڑ کر، جہاں بصورتِ دیگر آکسیجن سپرآکسائیڈ بن جاتی، یہ ایک ROS کو کم کر سکتا ہے؛ جبکہ اس کی ریڈیوس شدہ شکل آکسیجن کو براہِ راست پرآکسائیڈ میں ریڈیوس کر کے دوسری ROS کو بڑھاتی ہے۔ اس لیے مائٹوکانڈریا کی ریڈوکس کیمیا اور اس میں بائی پاس کے کردار کا مطالعہ کرنے والی تجربہ گاہ کو پروب کے لحاظ سے مختلف جوابوں کی توقع رکھنی چاہیے: اسی کیویٹ میں سپرآکسائیڈ کے لیے حساس پیمائش کم ہوتی ہے، جبکہ پرآکسائیڈ کی پیمائش بڑھتی ہے۔

دوسرا، کم مقدار میں پرآکسائیڈ صرف نقصان نہیں، ایک سگنل بھی ہے۔ پہلے کام کے بعد ہونے والے چوہے کے دماغی مائٹوکانڈریا کے مطالعے میں محض پچاس نینومولر رنگ سے پرآکسائیڈ کی پیداوار، جبکہ علاجی سطحوں پر مائٹوکانڈریائی DNA میں نقصان نہ ہونے کا مشاہدہ ہوا، اور پیشگی استعمال کے بعد روٹینون سے پیدا ہونے والے نقصان کے خلاف تحفظ بھی ملا۔ صرف ایک سو مائیکرومولر پر، جو علاجی حد سے بہت زیادہ ہے، رنگ نے DNA کے منتخب ٹکڑوں کو نقصان پہنچایا؛ اور سرخ روشنی کے ساتھ بیس مائیکرومولر رنگ نے ایسی سنگلٹ آکسیجن پیدا کی جس نے جانچے گئے تمام ٹکڑوں کو نقصان پہنچایا۔ مجوزہ طریقۂ عمل ہارمیسس پر مبنی ہے: پرآکسائیڈ کی ہلکی پیداوار Nrf2 سے وابستہ اینٹی آکسیڈنٹ دفاع اور مائٹوکانڈریا کی حیاتی تشکیل کو متحرک کرتی ہے، اس لیے قلیل مدتی پروآکسیڈنٹ نتیجہ، طویل مدتی اینٹی آکسیڈنٹ نتیجے سے پہلے آتا ہے۔ ایک گھنٹے پر پڑھی گئی جانچ اور ایک دن پر پڑھی گئی جانچ میں اختلاف ہو سکتا ہے، کیونکہ اس دوران حیاتیاتی صورتِ حال بدل چکی ہوتی ہے۔

تیسرا، روشنی طے کرتی ہے کہ کون سا سالمہ موجود بھی ہے۔ روشنی رنگ سے میتھائل گروپس ہٹا کر اسے Azure B اور متعلقہ مصنوعات کی طرف بدلتی ہے، اور ڈش کے اوپر خوردبین کا لیمپ ہی اسے ضیائی طور پر حساس بنانے کے لیے کافی ہے۔ اندھیرے اور روشنی میں کیے گئے تجربات مختلف تجربات ہیں، اور کسی بھی پروٹوکول کے روشنی اور رنگ کو سنبھالنے کے کنٹرولز والے حصے میں انہیں اسی طرح برتنا چاہیے۔

کنٹرولز کا کم از کم مجموعہ، اور کسی بھی دعوے کو کیسے پڑھیں

ذیل کا موازنہ اس مضمون کا اصل حوالہ جاتی مواد ہے۔ میتھیلین بلیو سے متعلق ROS کا کوئی بھی نتیجہ قبول کرنے سے پہلے دیکھیں کہ مصنفین نے کون سی قطار پوری کی اور کون سی چھوڑ دی۔

اس سے پڑھنے کا ایک عملی اصول نکلتا ہے۔ پرآکسیڈیز کے ساتھ، کیلیبریٹ شدہ اور کیٹالیز سے تصدیق شدہ Amplex جانچ، پرآکسائیڈ کے بارے میں ثبوت ہے۔ DCFDA پروب کی غیر مخصوص آکسیڈیشن کا ثبوت ہے، اس سے زیادہ کچھ نہیں۔ ریڈیکلز کو ختم کرنے والے مادّوں کے کنٹرولز کے ساتھ اسپن ٹریپنگ، ریڈیکل کی شناخت کا ثبوت ہے۔ آکسیجن کا استعمال، بہاؤ کا ثبوت ہے۔ کوئی جملہ اپنی جانچ کی تائید سے بڑھ کر دعویٰ کرے تو، خواہ وہ کتنے ہی اعتماد سے لکھا گیا ہو، وہ پروب کے بارے میں جملہ ہے، رنگ کے بارے میں نہیں۔ مقدار پر انحصار اور ہارمیسس کی حد، مائٹوکانڈریا میں الیکٹرانوں کے بہاؤ، رنگے ہوئے نمونوں میں جانچ کی مداخلت، اور خوردبینی روشنی کے آرٹیفیکٹس سے متعلق مباحث ان نکات میں سے ہر ایک کو آگے بڑھاتے ہیں، اور ہر نکتہ اپنے عارضی حوالہ کی جگہ اصل حوالہ آنے کے بعد بھی درست رہتا ہے۔