DNA ۋە RNA نى مېتىلېن كۆكى بىلەن بوياش: گېل ۋە پەردىدىكى قوللىنىشلار

بىر ئوقۇغۇچى ئاگاروزا گېلىدا ئېلېكتروفورېز ئېلىپ بېرىپ، ئۇنى مېتىلېن كۆكى بىلەن بويايدۇ، ئەمما روشەن بەلباغ كۆرۈنۈشى كېرەك بولغان يەردە ھېچنېمە كۆرمەيدۇ. يېنىدىكى خىزمەت ئورنىدا، دوكتورلۇقتىن كېيىنكى بىر تەتقىقاتچى ئوخشاش كۆك بويىغۇچ بوتۇلكىسىنى ئىشلىتىپ Northern پەردىسىنى بويايدۇ ۋە ئۈچ مىنۇتتا ئېنىق رىبوسومىلىق بەلباغلارغا ئېرىشىدۇ. ئوقۇغۇچى گېل تەجرىبىسى مەغلۇپ بولدى، دەپ يەكۈن چىقىرىدۇ. گېل تەجرىبىسى مەغلۇپ بولمىغان. بۇ ئىككى ۋەزىپە ئوخشىمايدۇ؛ ئوخشاش بويىغۇچ ئۇلارغا ئوخشىمىغان سەزگۈرلۈك، ئوخشىمىغان تەگلىك رەڭ ۋە كېيىنكى باسقۇچلارغا ئائىت ئوخشىمىغان قائىدىلەر بىلەن جاۋاب بېرىدۇ.

مېتىلېن كۆكى بىلەن DNA بوياش ۋە مېتىلېن كۆكى بىلەن RNA بوياشنىڭ خىمىيەسى ئوخشاش، ئەمما مەقسىتى ئوخشىمايدۇ. گېلدا، بويىغۇچ تۆشۈكچىلىك ماترىتسا ئىچىدە قانچىلىك نۇكلېئىك كىسلاتا بارلىقىنى كۆرسىتىدۇ. پەردىدە بولسا، يۆتكەشنىڭ مۇۋەپپەقىيەتلىك بولغان-بولمىغانلىقىنى ۋە يوللارغا ئەۋرىشكىنىڭ تەكشى يۈكلەنگەن-يۈكلەنمىگەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ. بۇ پەرق ئايدىڭلاشقاندىن كېيىن، تەرتىپلەر، بايقاش چەكلىرى ۋە ماسلىشىش چەكلىرىمۇ چۈشىنىشلىك بولىدۇ.

قىسقا جاۋاب

مېتىلېن كۆكى تەكشى قۇرۇلمىلىق كاتىئونلۇق بويىغۇچ بولۇپ، فوسفاتقا بولغان ئېلېكتروستاتىك تارتىشىش، بازا جۈپلىرى ئارىسىغا قىستۇرۇلۇش ۋە كىچىك ئوقۇر بىلەن باغلىنىشنىڭ بىرلەشمە تەسىرى ئارقىلىق نۇكلېئىك كىسلاتالارغا كاۋالېنتسىز، قايتۇرغىلى بولىدىغان شەكىلدە باغلىنىدۇ. مۇھىم نۇقتا دەل مۇشۇ قايتۇرغىلى بولۇش ئالاھىدىلىكىدۇر. بەلباغلارنى بوياپ كۆرۈنەرلىك نۇردا كۆرۈش، سۈرەتكە خاتىرىلەش، ئاندىن كلونلاش، گىبرىدلاشتۇرۇش ياكى قايتا پروبا تەكشۈرۈشى ئۈچۈن رەڭسىزلەندۈرۈش ياكى تازىلاش مۇمكىن.

قوش زەنجىرلىك DNA نى ئاگاروزا گېلىدا مېتىلېن كۆكى بىلەن بوياشتا، ئۆلچەملىك تېز رېتسېپ سۇدىكى 0.02 پىرسەنت w/v ‏(200 مىكروگرام/mL) بولۇپ، تەخمىنەن 15 مىنۇت بوياش ۋە تەخمىنەن 15 مىنۇت سۇدا رەڭسىزلەندۈرۈشتىن كېيىن، ئاق نۇر قۇتىسىدا كۆزىتىلىدۇ. پەردىلەرگە نىسبەتەن، كلاسسىك Northern بلوت رېتسېپى pH 5.2 ئەتراپىدىكى ناترىي ئاتسېتاتتا 0.02 دىن 0.04 پىرسەنتكىچە بويىغۇچ ئىشلىتىش؛ يۆتكەش ۋە مۇقىملاشتۇرۇشتىن كېيىن بىرنەچچە مىنۇت بوياش، ئاندىن سۇدا چايقاش ۋە گىبرىدلاشتۇرۇشتىن بۇرۇن تولۇق رەڭسىزلەندۈرۈشتىن ئىبارەت. سەزگۈرلۈكى ئوتتۇراھال: ياخشى شارائىتتا ھەر بىر گېل بەلبېغىدا نەچچە ئوندىن نەچچە يۈز نانوگرامغىچە، ئېھتىياتچان يېتەكچىلەردە بولسا 0.5 دىن 1 مىكروگرامغىچە دەپ كۆرسىتىلىدۇ. بۇ بايقاش چېكى ئېتىدىي برومىد ۋە SYBR بويىغۇچلىرىنىڭكىدىن بىرنەچچە چوڭلۇق دەرىجىسى يۇقىرى. پەردىلەردە يەككە ترانسكرىپت ئۈچۈن ئەمەلىي ئىشلىتىشكە بولىدىغان بىر بايقاش چېكى يوق، چۈنكى بۇ بوياش ئاساسلىقى مول مىقداردىكى رىبوسومىلىق RNA ۋە يۈكلەنگەن ئومۇمىي ماددىنى كۆرسىتىدۇ. پارچە سېتىلىدىغان تولۇقلىما مەھسۇلات ئېرىتمىسىنى بۇ ئىككى رېتسېپنىڭ ھېچقايسىسىغا ئالماشتۇرۇپ ئىشلەتمەڭ. دەلىللەنگەن ئۇسۇللار ئانالىتىك دەرىجىدىكى بويىغۇچ، تەركىبى ئېنىق بۇففېرلار ۋە RNA ئىشلىتىلگەندە RNase سىز شارائىتتا مەشغۇلات قىلىشنى ئاساس قىلىدۇ.

باغلىنىش قانداق يۈز بېرىدۇ ۋە قەيەردە خاتا چۈشەنچىگە يول ئاچىدۇ

پايدىلىق مودېل ئۈچ قىسىمدىن تەركىب تاپىدۇ. بىرىنچى، مۇسبەت زەرەتلىك ھالقا سىستېمىسى مەنپىي زەرەتلىك فوسفات ئاساسىي زەنجىرىگە تارتىلىدۇ. سپېكتروسكوپىيە تەتقىقاتلىرى تۇز مىقدارى تۆۋەن بولغاندا بۇ ئېلېكتروستاتىك تەسىرنىڭ ئۈستۈنلۈك قىلىدىغانلىقىنى بايقىغان؛ مودېللاش ۋە مولېكۇلا دىنامىكىسى بولسا قوش زەنجىرلىك DNA ئۈچۈن بازا جۈپلىرى ئارىسىغا قىستۇرۇلۇش ۋە كىچىك ئوقۇرغا باغلىنىشنى مۇقىم باغلىنىش شەكىللىرى دەپ كۆرسىتىدۇ. بۇ مېتىلېن كۆكىنىڭ DNA غا باغلىنىشى ھەققىدىكى بىر سپېكتروسكوپىيە تەتقىقاتىدا خۇلاسىلەنگەن. ئىككىنچى، GC غا بەلگىلىك مايىللىق بار؛ مېتىلېن كۆكىنىڭ قىستۇرۇلۇش مايىللىقى ھەققىدىكى تەتقىقاتتا مودېللاش CpG ۋە GpC قەدەملىرىنى ئەۋزەل كۆرسەتكەن، تەجرىبىلەر بولسا GC مول قوش زەنجىرلەرگە باغلىنىش مايىللىقىنى دوكلات قىلغان. ئەمما AT قوش زەنجىرلىرىمۇ باغلىنىدۇ. ئادەتتىكى بوياش تەرتىپ-خاس ئەمەس. ئۈچىنچى، يەككە زەنجىرلىك DNA ۋە RNA ئاساسلىقى ئېلېكتروستاتىك تەسىر، ئاشكارا بازىلار ۋە قوش زەنجىرلىك رايونلار بىلەن دۆۋىلىشىش ئارقىلىق باغلىنىدۇ. شۇڭا بوياش كۈچى ئۇزۇنلۇق، بازا تەرتىپى ۋە ئىككىلەمچى قۇرۇلمىغا قاراپ ئۆزگىرىدۇ.

بۇنىڭدىن ئىككى نەتىجە كېلىپ چىقىدۇ. باغلىنىش كاۋالېنتسىز بولغاچقا، بويىغۇچ يۇيۇلۇپ چىقىپ كېتىدۇ. پولىئاكرىلامىد بەلباغلىرى مەخسۇس مۇقىملاشتۇرۇلمىسا تېز سۇسلىشىدۇ؛ ئادەتتىكى بوياش ۋاقىتلىق بولغانلىقى ئۈچۈنلا مەخسۇس مەڭگۈلۈك مۇقىملاشتۇرۇش نۇسخىسى بار. بۇنى Soto ۋە Draper نىڭ PAGE گېللىرى ھەققىدىكى تەتقىقاتى چۈشەندۈرىدۇ. بويىغۇچ نۇرغا سەزگۈرلەشتۈرگۈچ بولغاچقا، ئوكسىگېن بار شارائىتتا بويالغان DNA نى ئۇزۇن مۇددەت كۈچلۈك نۇرغا تۇتۇش گۇئانىننى ئوكسىدلاپ، ئاخىرىدا زەنجىرلەردە ئۈزۈلۈش پەيدا قىلىشى مۇمكىن. بۇ مېخانىزم مېتىلېن كۆكى سەزگۈرلەشتۈرگەن گۇئانىن ئوكسىدلىنىشى ھەققىدىكى تەتقىقاتتا تەپسىلىي بايان قىلىنغان. ئاق نۇردا قىسقا ۋاقىت كۆزىتىش كلاسسىك ئېتىدىي برومىد خىزمەت تەرتىپلىرىدىكى ھەممىگە تونۇشلۇق UV زىيىنىدىن ساقلايدۇ؛ تەييارلاش مەقسىتىدە DNA نى قايتۇرۇۋېلىشتا بۇ ھەقىقىي ئەۋزەللىك. كۆرۈنەرلىك نۇر يۇمشاقراق، ئەمما زىيانسىز ئەمەس. DNA كلونلىنىدىغان بولسا، نۇرغا تۇتۇش ۋاقتىنى قىسقا قىلىڭ. بۇ ئاگاھلاندۇرۇشنىڭ ئارقىسىدىكى تېخىمۇ كەڭ فوتوخىمىيەنى بىلىش ئۈچۈن، مېتىلېن كۆكى فوتوخىمىيەسىدىكى ئىككى يول نى كۆرۈڭ. ئوكسىدلانغان شەكىلنىڭ نېمە ئۈچۈن باغلىنىدىغانلىقى، قايتۇرۇلغان شەكىلنىڭ بولسا نېمە ئۈچۈن باغلانمايدىغانلىقىنى چۈشەندۈرىدىغان ئوكسىدلىنىش-قايتۇرۇلۇش جۈپى ۋە زەرەت ھالەتلىرى ئۈچۈن، مېتىلېن كۆكىنىڭ قۇرۇلمىسى ۋە خۇسۇسىيەتلىرىنىڭ خىمىيەسى نى كۆرۈڭ.

بىرىنچى ۋەزىپە: گېل ئىچىدە بوياش

گېل بوياش بىر سوئالغا جاۋاب بېرىدۇ: بۇ بەلباغدا كۆز بىلەن كۆرگىلى بولغۇدەك يېتەرلىك نۇكلېئىك كىسلاتا بارمۇ؟ ئاگاروزادىكى قوش زەنجىرلىك DNA ئەڭ ياخشى تەتقىق قىلىنغان ئەھۋال. Flores ۋە خىزمەتداشلىرىنىڭ ئەسلى مېتىلېن كۆكى گېل ئۇسۇلى 1 پىرسەنتلىك ئاگاروزادا 0.02 پىرسەنتلىك تېز تەرتىپنى دەلىللىگەن ۋە ئۇنىڭدىن كېيىن DNA نى قايتۇرۇۋېلىش ۋە كلونلاشنىڭ مۇۋەپپەقىيەتلىك بولغانلىقىنى كۆرسەتكەن. ئوخشاش تەمىنلىگۈچى تەرتىپى IBI Scientific نىڭ مېتىلېن كۆكى مەھسۇلات بېتىدىمۇ بار؛ ئۇ يەردە 0.04 پىرسەنتلىك پەردە رېتسېپى بىلەن تېز گېل نۇسخىسى يانمۇيان كۆرسىتىلگەن.

ئەمەلىي خىزمەت تەرتىپى:

1. گېلدا ئېلېكتروفورېزنى ئادەتتىكىدەك ئېلىپ بېرىڭ. ئۆزگەرتىلگەن ئۇسۇلنىڭ يۆتكەش ياكى ئايرىش ئىقتىدارى دەلىللەنمىگەن بولسا، ئېلېكتروفورېز جەريانىدا ئەمەس، ئۇنىڭدىن كېيىن بوياڭ.
2. دىسىتىللانغان سۇدىكى 0.02 پىرسەنت w/v مېتىلېن كۆكىگە چىلاپ، ئاستا تەۋرىتىپ تەخمىنەن 15 مىنۇت تۇتۇڭ.
3. سۇنى بىرنەچچە قېتىم ئالماشتۇرۇپ، ماترىتسا تەگلىك رەڭگى سۇسلاپ، بەلباغلار روشەن بولغۇچە، جەمئىي تەخمىنەن 15 مىنۇت رەڭسىزلەندۈرۈڭ.
4. ئاق نۇر يورۇتقۇچىدا دەرھال سۈرەتكە تارتىڭ.

ئاگاروزا بىلەن پولىئاكرىلامىدنىڭ ھەرىكىتى ئوخشىمايدۇ. ئاگاروزا بويىغۇچنى ماترىتسادا تۇتۇپ قالىدۇ، شۇڭا رەڭسىزلەندۈرۈش ئاستا باسقۇچ ھېسابلىنىدۇ. نېپىز پولىئاكرىلامىد گېللىرى تېز بويىلىدۇ، ئەمما بويىغۇچنىمۇ تېز يوقىتىدۇ؛ بۇ تەييارلاش مەقسىتىدە كېسىپ ئېلىشقا پايدىلىق، ئەمما ئارخىپ خاتىرىسىگە پايدىسىز. پولىئاكرىلامىدتىكى بىرىكتۈرۈلگەن ئولىگونۇكلېئوتىدلارنى، دەلىللەنگەن Current Protocols ئۇسلۇبىدىكى PAGE ئۇسۇللىرىغا ئەگىشىپ، ئوخشاش 0.02 پىرسەنتلىك رېتسېپ ۋە تەكرار سۇ يۇيۇش ئارقىلىق 20 دىن 30 مىنۇتقىچە ۋاقىتتا ئېنىقلىغىلى بولىدۇ. تەييارلاش مەقسىتىدىكى ئولىگونۇكلېئوتىدلار ئۈچۈن سۇيۇلدۇرۇلغان TBE دىكى 0.0002 پىرسەنت ئەتراپىدىكى ئىنتايىن سۇيۇق نۇسخىلارنى بىرنەچچە سائەت ئىشلىتىش دوكلات قىلىنغان، ئەمما بۇنىڭ دەلىل ئاساسى ئاجىزراق.

DNA بىلەن RNA نىڭ پەرقى مۇھىم. قوش زەنجىرلىك DNA ئەڭ كۈچلۈك قۇرۇلمىلىق باغلىنىشنى بېرىدۇ. RNA ۋە يەككە زەنجىرلىك DNA مۇ بويىلىدۇ، ئەمما ئاجىزراق ۋە ئالدىن مۆلچەرلەش قىيىنراق. فورمالدېھىدلىق ئاگاروزا RNA گېللىرىدە، كۆپىنچە تەجرىبىخانىلار گېل ئىچىدە كۆك بوياشنى ئاتلاپ، ئالدى بىلەن RNA نى پەردىگە يۆتكەيدۇ، ئاندىن ئۇ يەردە بويايدۇ. بۇنداق قىلىش گېلدىكى ئاجىز سىگنالنىڭ ئورنىغا پەردىدىكى ئېنىقراق سىگنال ۋە يۈكلەش خاتىرىسىنى بېرىدۇ.

ئىككىنچى ۋەزىپە: پەردىدە بوياش

پەردە بوياش باشقا بىر سوئالغا جاۋاب بېرىدۇ: يۆتكەش مۇۋەپپەقىيەتلىك بولدىمۇ ۋە يوللارنى سېلىشتۇرغىلى بولامدۇ؟ كلاسسىك قوللىنىش Herrin ۋە Schmidt نىڭ قايتۇرغىلى بولىدىغان Northern بلوت بوياش ئۇسۇلىدۇر. ئەسلىدە pH 5.0 بولغان 50 mM ناترىي ئاتسېتاتتىكى 0.04 پىرسەنت بويىغۇچ بىلەن 2 دىن 3 مىنۇتقىچە بوياپ، سۇدا چايقايتتى؛ گىبرىدلاشتۇرۇشتىن بۇرۇن SSPE دىكى سۇيۇلدۇرۇلغان SDS بىلەن بويىغۇچنى چىقىرىۋەتكىلى بولاتتى.

كەڭ قوللىنىلىدىغان زامانىۋى نۇسخىسى تۆۋەندىكىچە:

1. RNA ياكى دېناتۇراتسىيەلەنگەن DNA نى نىلون ياكى نىتروسېللۇلوزاغا يۆتكەڭ، ئاندىن بوياش جەريانىدا ئەۋرىشكە يوقاپ كەتمەسلىكى ئۈچۈن UV بىلەن ئۆزئارا باغلاش ياكى قىزىتىش ئارقىلىق مۇقىملاشتۇرۇڭ.
2. ئىختىيارىي، ئەمما كۆپ قوللىنىلىدىغان باسقۇچ: پەردىنى 5 پىرسەنت ئاتسېتىك كىسلاتادا تەخمىنەن 15 مىنۇت نەمدەڭ.
3. pH 5.2 ئەتراپىدىكى 0.3 دىن 0.5 M غىچە ناترىي ئاتسېتاتتىكى 0.02 دىن 0.04 پىرسەنتكىچە مېتىلېن كۆكىدە 5 دىن 10 مىنۇتقىچە بوياڭ.
4. سۇدا چايقاپ، 5 دىن 15 مىنۇتقىچە رەڭسىزلەندۈرۈڭ، سۈرەتكە خاتىرىلەڭ، ئاندىن گىبرىدلاشتۇرۇشتىن بۇرۇن قالدۇق بويىغۇچنى چىقىرىۋېتىڭ.

Northern خىزمىتىدە ئاساسلىقى مۇسبەت زەرەتلىك نىلون ئىشلىتىلىدۇ. نىتروسېللۇلوزامۇ ئوخشاش ئاتسېتىك كىسلاتا ۋە ئاتسېتات خىزمەت تەرتىپى بىلەن ئىشلەيدۇ. سۈرەت يۆتكەشنى دەلىللەش، 28S ۋە 18S بەلباغلىرىنى (ياكى باكتېرىيە RNA سى ئۈچۈن 23S ۋە 16S نى) سېلىشتۇرۇش، ئۆلچەم پەلەمپەيلىرى ۋە ئۆلچەم ئەۋرىشكىلىرىنى بەلگىلەش، شۇنداقلا ئومۇمىي RNA مىقدارىنى تەخمىنىي نورماللاشتۇرۇش خاتىرىسىنى ساقلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. ئېلان قىلىنغان Northern ئۇسۇللىرى يۈكلەشنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن بويالغان رىبوسومىلىق بەلباغلارنى مىقدارلاشتۇرىدۇ؛ بۇنىڭ ئىچىدە مېتىلېن كۆكى بىلەن بويالغان رىبوسومىلىق بەلباغلارنى نورماللاشتۇرۇشقا ئىشلەتكەن سۈتچىلىك ئىلمى تەتقىقاتىمۇ بار. Southern پەردىلىرىنىمۇ ئوخشاش ئۇسۇلدا كۆرگىلى بولىدۇ، ئەمما بۇ بويىغۇچ Northern دىكى يۈكلەش ۋە يۆتكەشنى تەكشۈرۈشتە تېخىمۇ كۆپ ئىشلىتىلگەن. Southern DNA يۆتكەشتىن بۇرۇن دېناتۇراتسىيەلىنىدىغان بولغاچقا، گېل سەزگۈرلۈكىگە ئائىت سانلارنى ئۇنىڭغا بىۋاسىتە قوللانغىلى بولمايدۇ.

بايقاش چېكى ۋە تەگلىك رەڭ: كۆك بويىغۇچنىڭ ئاجىز تەرەپلىرى

تۆۋەندىكى سېلىشتۇرۇش مەقسەتلىك ھالدا تەخمىنىي بېرىلگەن. بويىغۇچنىڭ ئۈنۈمى گېل پىرسەنتى، بەلباغ كەڭلىكى، ئوپتىكا ۋە رەڭسىزلەندۈرۈشنى قانچىلىك ئىزچىل ئېلىپ بېرىشقا باغلىق. ھەر بىر ساننى ئېنىق ئۆلچەم ئەمەس، چوڭلۇق دەرىجىسى دەپ قاراڭ.

تەگلىك رەڭنى كونترول قىلىش ئوتتۇراھال سىگنالنىڭ ئىشلىتىشكە يارايدىغان-يارىمايدىغانلىقىنى بەلگىلەيدۇ. ئەركىن بويىغۇچنىڭ رەڭگى ئىنتايىن كۈچلۈك، شۇڭا سېلىشتۇرما روشەنلىك باغلانغان بويىغۇچنى چىقىرىۋەتمەي، باغلانمىغان بويىغۇچنى يوقىتىشتىن كېلىدۇ. تېخىمۇ قويۇق بويىغۇچ سەزگۈرلۈكنى ناھايىتى ئاز ھالدا ئاشۇرىدۇ. ئۇ ئاساسلىقى رەڭسىزلەندۈرۈش ۋاقتىنى ئۇزارتىدۇ. دەل ئىشلىتىلىدىغان گېل، پەردە ۋە كامېرادا بىر قاتار سۇيۇلدۇرۇش ئەۋرىشكىلىرىنى سىناڭ، پەقەت جۇغلانما رەڭ قويۇقلۇقى كىرگۈزۈلگەن مىقدارغا نىسبەتەن مۇۋاپىق نىسبەتتە ساقلىنىدىغان دائىرىنى ئىشلىتىڭ. مېتىلېن كۆكى يېرىم مىقدارلىق يۈكلەش نورماللاشتۇرۇشىنى قوللايدۇ. ئۇ كەڭ دىنامىكىلىق دائىرىگە ئىگە مىقدارلىق ئانالىز ئەمەس، چۈنكى پەردە سىغىمى، يۆتكەش ئۈنۈمى، تويۇنۇش ۋە رەڭسىزلەندۈرۈش يولدىن يولغا ئۆزگىرىدۇ.

ماسلىشىش چەكلىرى: بوياشتىن كېيىن نېمىلەر ئىشلىگىلى بولىدۇ

كۆك بوياشتىن كېيىن كلونلاشنىڭ مۇمكىنلىكى كۆرسىتىلگەن. Flores ۋە خىزمەتداشلىرى بويالغان ئاگاروزا بەلباغلىرىنى كېسىپ ئېلىپ، DNA نى قايتۇرۇۋالغان، ئاندىن ئۇنى ئۇلاپ، ھۈجەيرىگە كىرگۈزگەن؛ ئۇلار ئېتىدىي برومىد ۋە UV ئىشلىتىلگەندىن كېيىنكىگە قارىغاندا تېخىمۇ ياخشى كلونلاش نەتىجىسىنى دوكلات قىلغان. بۇنىڭ مۇمكىن سەۋەبى بويىغۇچنىڭ ئۆزىدىن كەلگەن پايدا ئەمەس، بەلكى نۇر زىيىنىنىڭ ئازلىقىدۇر. ئاق نۇرغا تۇتۇشنى قىسقا قىلىڭ ۋە قايتۇرۇۋېلىنغان DNA نى ئادەتتىكى گېلدىن ئېلىپ تازىلاش باسقۇچىدىن ئۆتكۈزۈڭ.

PCR ۋە تەرتىپ ئوقۇشقا ئائىت دەلىللەر ئازراق. قالدۇق بويىغۇچ نۇكلېئىك كىسلاتالارغا باغلىنىدۇ، شۇڭا فېرمېنتلىق باسقۇچلاردىن بۇرۇن رەڭسىزلەندۈرۈپ تازىلاڭ. كۆك گېلدىن مۇۋاپىق ساپلاشتۇرۇلغان DNA نىڭ ئىشلەيدىغانلىقى كۈتۈلىدۇ، ئەمما ئوخشىمىغان پولىمېرازالار ۋە تەرتىپ ئوقۇش خىمىيەلىرىنىڭ بىۋاسىتە بىللە كىرگەن قالدۇق بويىغۇچقا بەرداشلىق مىقدارى ياخشى ئۆلچەنمىگەن. بۇنى پەرەز قىلىۋالماڭ.

بلوت گىبرىدلاشتۇرۇشى تەرتىپ قاتتىق ساقلانغاندا ماس كېلىدۇ: يۆتكەش، مۇقىملاشتۇرۇش، بوياش، خاتىرىلەش، رەڭسىزلەندۈرۈش، گىبرىدلاشتۇرۇش. بۇ Herrin ۋە Schmidt لايىھەلىگەن تەرتىپ. يۆتكەشتىن بۇرۇن بوياش ياكى رەڭسىزلەندۈرۈشنى ئاتلاپ ئۆتۈش باشقا بىر ئۇسۇل بولۇپ، ئۆزىگە خاس دەلىللەشنى تەلەپ قىلىدۇ. بويىغۇچ چىقىرىۋېتىلگەندىن كېيىن، ئۆلچەملىك پروبىنى چىقىرىۋېتىش ۋە قايتا پروبا تەكشۈرۈشى ئادەتتىكىدەك داۋاملىشىدۇ. ئوخشاش بويىغۇچ ئائىلىسى بىلەن ھۈجەيرە دەرىجىسىدە بوياش ۋە مۇقىملاشتۇرۇلغان يۇپقا ئەۋرىشكە قەۋىتىنىڭ ئۇسۇلىنى نېمە ئۈچۈن تىرىك ھۈجەيرە ئۇسۇللىرىغا كۆچۈرگىلى بولمايدىغانلىقى ھەققىدە، مىكروسكوپىيە بوياش ئەتلىسى نى كۆرۈڭ.

مەڭگۈلۈك مۇقىملاشتۇرۇش نۇسخىسى ئىشلىتىلمىسە، بەلباغ كېسىپ ئېلىش تەييارلاش مەقسىتىدىكى ئاگاروزا ۋە كۆك بويىغۇچ بىلەن ئورنى ئېنىقلانغان PAGE ئولىگونۇكلېئوتىدلىرى ئۈچۈن ئىشلەيدۇ. قايتۇرغىلى بولىدىغان باغلانغۇچى ئۈچۈن رەڭسىزلەندۈرۈشتىن كېيىن ئېلېكتر ئارقىلىق چىقىرىۋېلىش خىمىيە جەھەتتىن مۇمكىن، ئەمما مېتىلېن كۆكىگە خاس، كونترول قىلىنغان ھوسۇل سانلىق مەلۇماتلىرى ئاز. چىقىرىۋالغاندىن كېيىن تۇزسىزلاندۇرۇڭ ياكى چۆكتۈرۈڭ.

قايتا-قايتا كۆرۈلىدىغان مەسىلىلەر

سۇس گېل بەلباغلىرى ئادەتتە رەڭ ئارقىلىق بايقايدىغان بويىغۇچ ئۈچۈن ماسسىنىڭ بەك ئاز ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ، بولۇپمۇ قىسقا يەككە زەنجىرلىك ياكى RNA نىشانلىرىدا. كۆپرەك يۈكلەڭ، يېڭى بويىغۇچ ئىشلىتىڭ، قويۇقلۇقنى ئاشۇرۇشتىن بۇرۇن بوياش ۋاقتىنى ئۇزارتىڭ ۋە رەڭسىزلەندۈرۈشنى بالدۇرراق توختىتىڭ. سېلىشتۇرما روشەنلىكى يوق، پۈتۈنلەي كۆك گېل ئادەتتە ھەددىدىن زىيادە بوياش ياكى سۇنى يېتەرلىك ئالماشتۇرماسلىقنى كۆرسىتىدۇ. PAGE بەلباغلىرىنىڭ سۇسلىشىشى بوياشنىڭ مەغلۇپ بولۇشى ئەمەس، بەلكى كۈتۈلىدىغان خىمىيەلىك ھادىسە. تېز سۈرەتكە تارتىڭ. پەردىدىكى تەكشى بولمىغان تەگلىك رەڭ قاتلىنىش، كۆپۈك، بارماق ئىزى، تەكشى بولمىغان تەۋرىتىش ياكى بىر قىسمىلا يۆتكىلىشتىن دېرەك بېرىدۇ. گىبرىدلاشتۇرۇش كونترول ئەۋرىشكىسى بولمىسا، بۇنى يۈكلەش تەڭسىزلىكى دەپ چۈشەنمەڭ. يېيىلىپ كەتكەن ئاجىز رىبوسومىلىق ئەندىزە پارچىلىنىشنى كۆرسىتىشى مۇمكىن، ئەمما تولۇق بولمىغان يۆتكەش، ئومۇمىي RNA نىڭ بەك ئاز بولۇشى (ئادەتتىكى يوللاردا بىرنەچچە مىكروگرامدىن نەچچە ئون مىكروگرامغىچە بولىدۇ) ياكى ھەددىدىن زىيادە رەڭسىزلەندۈرۈشتىنمۇ بولۇشى مۇمكىن. بويىغۇچ مول مىقداردىكى رىبوسومىلىق RNA نى كۆرسىتىدۇ. ئۇ مەلۇم بىر ترانسكرىپتنى كۆرسەتمەيدۇ. بۇ ۋەزىپە پروبىغا تەۋە.

ئاشۇرۇۋەتمەي بايان قىلىنغان بىخەتەرلىك ۋە بىر تەرەپ قىلىش

مېتىلېن كۆكىنى بىر تەرەپ قىلىش ئېتىدىي برومىدقا قارىغاندا ئاددىيراق، ئەمما ئۇ زىيانسىز ئەمەس. MilliporeSigma نىڭ نۆۋەتتىكى بىخەتەرلىك سانلىق مەلۇمات جەدۋىلى بۇ بويىغۇچنى ئېغىز ئارقىلىق جىددىي زەھەرلىكلىكنىڭ 4-تۈرىگە كىرگۈزۈپ، يۇتۇۋالسا زىيانلىق دەپ بەلگىلىگەن؛ Sigma-Aldrich نىڭ مېتىلېن كۆكى SDS ى بويىچە، ئۇ تەستىقلانغان تاشلاندۇق بىر تەرەپ قىلىش يولى ئارقىلىق تاشلىنىشى كېرەك. ئېتىدىي برومىدنىڭ گېن زەھەرلىكلىكىگە ئائىت ئاگاھلاندۇرۇشلىرى تېخىمۇ كۈچلۈك؛ ئۇنىڭ Sigma-Aldrich ئېتىدىي برومىد SDS ىدا جىنسىي ھۈجەيرىلەرگە بولغان گۇمانلىق تەسىرلەرمۇ بار. Thermo Fisher نىڭ نۇكلېئىك كىسلاتا بويىغۇچ يېتەكچىسىدە كۆرسىتىلگەندەك، ئۇنىڭ گېللىرى ۋە ئېرىتمىلىرى ئادەتتە خەتەرلىك خىمىيەلىك تاشلاندۇق سۈپىتىدە ئايرىم يىغىلىدۇ. ھەر ئىككىسى ئۈچۈن SDS ۋە ئورگان قائىدىلىرىگە ئەمەل قىلىڭ. قۇرۇق بويىغۇچنى مەھكەم يېپىپ، قۇرۇق ساقلاڭ؛ ئىشلىتىش ئېرىتمىسىنى پەقەت تەرتىپ رۇخسەت قىلغاندىلا قايتا ئىشلىتىڭ؛ بويالغان پەردىلەرنى سۈزگۈچ ۋاراقلىرى ئارىسىدا قۇرۇق ساقلاڭ؛ گېللارنى بەلباغلار تارقىلىپ كېتىشتىن بۇرۇن سۈرەتكە تارتىڭ.

تەجرىبىخانا ئۈستىلىدىكى بۇ قىسقا سۆزنى ئېسىڭىزدە تۇتۇڭ. گېللار ئاق نۇردا يۇقىرى يۈك مىقدارىدىكى كۆرۈنۈشچانلىقنى تەكشۈرىدۇ. پەردىلەر بولسا پروبا سەزگۈر تەكشۈرۈشنى قىلىشتىن بۇرۇن يۆتكەش ۋە يۈكلەشنى تەكشۈرىدۇ. بىر بويىغۇچ ھەر ئىككىسىگە خىزمەت قىلىدۇ، ئەمما سەزگۈرلۈكى ئوتتۇراھال، باغلىنىشى قايتۇرغىلى بولىدىغان بولۇپ، مەشغۇلات تەرتىپى قاتتىق ساقلىنىشى كېرەك.