Яңа метилен зәңгәре һәм ретикулоцитларны буяу: аерым буягыч һәм тере күзәнәкләр ысулы

Студент ретикулоцитларны санарга әзерләнә, метилен зәңгәре заказ бирә, аны кан белән куша һәм диярлек бернәрсә дә күрми. Аның курсташы «яңа метилен зәңгәре» дип язылган шешәдән файдалана һәм эритроцитларның бер өлеше эчендә ачык зәңгәр җепселләр күрә. Беренче студент икенче шешәдәге буягыч яңарак яки куерак дип уйлый. Әмма ике фараз да дөрес түгел. Анда башка молекула бар.

Бу өлкәдәге күпчелек буталчыклыкның нигезендә шушы төшенчә хатасы ята. Атама яңа метилен зәңгәре метилен зәңгәренең яхшыртылган партиясе дигән тәэсир тудыра. Химия исә башкача күрсәтә. Яңа метилен зәңгәре N — үз Төс индексы номеры, үз алмаштыру схемасы һәм гематологиядә үз стандартлаштырылган роле булган аерым фенотиазин буягычы. Бу аерма аңлашылгач, ысулның калган өлеше дә — ни өчен буяганда күзәнәкләр тере булырга тиеш, нәрсә ретикулоцит дип санала, Гейнц тәнчекләре монда нинди урын тота һәм бриллиант крезил зәңгәре кайчан кулланыла — ачык була.

Кыска җавап

Гематология реагенты булган яңа метилен зәңгәре N гадәттә PubChem базасындагы яңа метилен зәңгәре язмасында Basic Blue 24 буларак билгеләнә: C.I. 52030, CAS 1934-16-3, формуласы C18H22ClN3S. Гадәти метилен зәңгәре — PubChem базасындагы язмасында метилтиониний хлориды, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, формуласы C16H18ClN3S. Төзелеше ягыннан яңа метилен зәңгәренең боҗрасында ике метил төркеме һәм этиламино ян чылбырлары бар, ә метилен зәңгәрендә диметиламино төркемнәре урнашкан. Бу аерма буяу үзенчәлекләрен үзгәртә. Гематология дәреслекләрендә гадәти метилен зәңгәре ретикулоцитларны чагыштырмача начар буяучы, ә яңа метилен зәңгәре куерак һәм тигезрәк буяучы дип тасвирлана; бу чагыштыру ScienceDirect сайтындагы яңа метилен зәңгәре турындагы бүлектә гомумиләштерелгән.

Әйе, яңа метилен зәңгәре — суправиталь буягыч. NCBI сайтындагы суправиталь буяу принципларына күзәтүдә билгеләнгәнчә, суправиталь буяу — тере күзәнәкләрне организмнан алганнан соң һәм фиксациягә кадәр буяу дигән сүз. Яңа метилен зәңгәре дә, бриллиант крезил зәңгәре дә шушы төркемгә керә, һәм CLSI ретикулоцитлар стандарты яңа метилен зәңгәрен нәкъ суправиталь буягыч буларак карый. Студентлар кайчак моны фиксацияләнгән мазокларны Романовский ысулы белән буяуга тиңли. Монда бу күзаллау дөрес түгел. Башта фиксация ясалса, ысул эшләми башлый.

Охшаш буягыч атамаларын чагыштыручылар өчен метил зәңгәре белән метилен зәңгәре арасындагы аерма анионлы триарилметан буягычы белән катионлы фенотиазиннар гаиләсе арасындагы башка һәм киңрәк буталчыклыкны аңлата. Лабораториядә буяу ысулларына күзәтү суправиталь эшнең фиксацияләнгән мазоклар ысуллары янында нинди урын тотуын күрсәтә, ә кан күзәнәкләре морфологиясе буенча белешмә ретикулоцитларны бәяләүнең киңрәк дифференциаль санаудагы урынын аңлата.

Каталогка кагылышлы бер искәрмә: яңа метилен зәңгәренең цинк хлориды белән икеләтә тоз формасы да бар, аның номеры — CAS 6586-05-6. Шуңа күрә ысуллар бүлегендә гомуми атаманы гына түгел, тоз формасын һәм тәэмин итүчене дә күрсәтергә кирәк.

Суправиталь буяу чынлыкта нәрсә эшли

Ретикулоцит — төшен югалткан, әмма калдык рибосомаль РНК сакланган яшь эритроцит. Буялмаган дымлы препаратта бу РНК күренми. Суправиталь буягыч тере күзәнәккә керә һәм әлеге РНКны зәңгәр гранулалар һәм җепселләр рәвешендә утырта яки туплый; майлы иммерсия астында күренә торган челтәрсыман-җепселле материал шушы була. Димәк, челтәр — буяу нәтиҗәсе, төс көтеп торган алдан әзер каркас түгел. Шуңа күрә протокол үзгәрешлеләре — буягыч концентрациясе, буфер, кан белән буягыч нисбәте, температура, вакыт — буягыч атамасы кадәр үк әһәмиятле.

Практик нәтиҗәсе — гамәлләрнең катгый тәртибе: башта антикоагулянтлы канны буягыч белән кушарга, инкубацияләргә, аннары мазоклар әзерләп, аларны фиксациясез һәм өстәмә буяусыз тикшерергә. Буяуга кадәр фиксацияләү яки тонык җепселләрне каплый торган өстәмә буяу санау өчен кирәкле мәгълүматны юкка чыгара.

Яңа метилен зәңгәре белән ретикулоцитларны буяу өчен эш протоколы

Бердәм универсаль состав юк, шуңа күрә кулланылган составны күрсәтегез. Документлаштырылган өч вариант бу төрлелекне күрсәтә.

Классик Brecher тибындагы процедурада калий оксалаты белән якынча 0.5 процентлы яңа метилен зәңгәре кулланыла. Аны яхшылап болгатылган EDTAлы кан белән тигез күләмнәрдә кушалар һәм бүлмә температурасында якынча 10–15 минут инкубациялиләр. Яңадан сак кына болгаткач, юка чөйсыман мазоклар әзерлиләр, һавада киптерәләр һәм фиксацияләмичә 100x майлы иммерсия объективы астында тикшерәләр. NCBI сайтындагы ретикулоцитларны санау процедурасы бу эш барышын һәм аның белән кулланыла торган санау рамкасын тасвирлый.

Dacie һәм Lewis вариантында цитратлы тоз эремәсендәге 1.0 процентлы яңа метилен зәңгәрен канның 2–4 күләме белән кушалар һәм мазок әзерләгәнче 37 C температурада 15–20 минут тоталар. CLSI H44 процедурасын күптән түгел бердәмләштереп гамәлгә ашырганда, pH 7.4 булган фосфат-буферлы тоз эремәсендәге сыеграк 0.1 процентлы эремә кулланылган; 20 C температурада 10 минут инкубацияләнгән һәм фиксация ясалмаган. Бу 2026 елгы NMB бердәмләштерү тикшеренүендә хәбәр ителә.

Санау кагыйдәләре барлык вариантлар өчен уртак. Күзәнәктә кимендә ике аерым зәңгәргә буялган гранула яки җепсел кисәге булса, аны ретикулоцит дип санагыз; бу ялгыз буягыч утырымын исәпкә алмаска мөмкинлек бирә. Көндәлек эштә кимендә 1,000 эритроцит санагыз һәм ретикулоцитларны процентларда күрсәтегез. Процентлар түбән булганда, статистика күбрәк күзәнәк санауны таләп итә. CLSI H44 методологиясенә күзәтүдә ретикулоцитлар якынча 1 процент булганда, санау вариациясен 5 процентка кадәр киметү өчен якынча 4,400 күзәнәк кирәклеге әйтелә; моны De Gruyter сайтындагы CLSI H44 күзәтүендә укырга мөмкин. Miller окуляр дискы күп күзәнәк санауны гамәли яктан уңайлы итә. Буягычны фильтрлагыз яки яңадан әзерләгез, чөнки утырым гранулалы кертемнәргә охшый.

Шул ук препараттагы Гейнц тәнчекләре

Шул ук суправиталь мазок Гейнц тәнчекләрен дә күрсәтә ала. Алар калдык РНК түгел, ә оксидлашкан һәм денатурацияләнгән гемоглобин тупланмалары. Яңа метилен зәңгәре белән әзерләнгән препаратларда алар түгәрәк тәнчекләр булып күренә, еш кына ялгыз һәм мембрана янында урнаша, челтәрсыман-җепселле материалга караганда ачыграк зәңгәр төскә буяла. Фиксация һәм өстәмә буяу вакытында алар начар саклана, шуңа күрә фиксацияләнмәгән мазокны тикшерегез. Күптән түгел кулланылган бер протоколда 20 микролитр EDTAлы канны 20 микролитр 1 процентлы яңа метилен зәңгәре белән кушып, 15 минут инкубацияләгәннәр һәм 250 эритроцит арасында Гейнц тәнчекләре булган күзәнәкләрне санаганнар; бу әлеге процедураны тасвирлаган PMC тикшеренүендә китерелә.

Ике аерма ялгыш аңлатудан саклый. Беренчедән, метил шәмәхәсе һәм кристалл шәмәхәсе Гейнц тәнчекләрен яңа метилен зәңгәренә караганда көчлерәк буяй; бу ScienceDirect сайтындагы Гейнц тәнчекләре турындагы бүлектә билгеләнә. Яңа метилен зәңгәре ретикулоцитлар һәм Гейнц тәнчекләре бергә бәяләнгәндә уңайлы сайлау булып тора, әмма махсус Гейнц тәнчекләрен буяу өчен иң көчле буягыч түгел. Икенчедән, альфа-талассемия йөртүчелегендәге HbH кертемнәре суправиталь буяудан соң бөтен күзәнәк буйлап күпсанлы вак нокталар барлыкка китерә, ә классик Гейнц тәнчекләре азрак, эрерәк була һәм еш кына мембрана белән бәйле. Буягыч утырымы — аларга охшаган өченче күренеш: ул күзәнәкләрнең фокус яссылыгыннан читтә ята һәм күрү кырлары арасында үзгәрә.

Бриллиант крезил зәңгәре белән яңа метилен зәңгәрен чагыштыру

Ике буягыч та ретикулоцитлар өчен суправиталь буягыч булып тора, әмма стандартлаштыру аларның берсенә өстенлек бирә. Гематологиядә стандартлаштыру буенча халыкара совет белән берлектә эшләнгән һәм CLSI H44 стандарты битендә күрсәтелгән CLSI H44-A2 ретикулоцитлар ысулы EDTAлы канны яңа метилен зәңгәре белән буяуны кулдан башкарылучы чагыштыру ысулы итеп билгели. Классик гематология дәреслекләре күренешне бәяләүдә дә бер фикердә: яңа метилен зәңгәре җепселләрне куерак һәм тигезрәк буяй, ә бриллиант крезил зәңгәре партияләр һәм үрнәкләр арасында күбрәк үзгәрә.

Бу статуска ачыклык кертү кирәк. ICSH анализаторларны бәяләү буенча күрсәтмәсе яңа метилен зәңгәре белән кулдан башкарылган микроскопияне эталон чагыштыру алымы буларак кабул итә, әмма аны субъектив һәм чагыштырмача төгәллеге түбән дип атый; мөмкин булганда агым цитометриясенең эталон процедураларына өстенлек бирелә. 2022 елда 100 үрнәкне чагыштыруда, кулланылган анализаторга карата систематик тайпылыш бриллиант крезил зәңгәрендә яңа метилен зәңгәренә караганда түбәнрәк булган; бу PMC сайтындагы буяу ысулларын чагыштыруда хәбәр ителә. Студентлар өчен нигезле йомгак шундый: яңа метилен зәңгәрен стандартлаштырылган кулдан чагыштыру ысулы буларак кулланыгыз, җирле бриллиант крезил зәңгәре ысулын аңа яки автоматлаштырылган ысулга каршы тикшерегез һәм һәр ике очракта да кулдан башкарылган микроскопиядә нәтиҗәләрнең таралышы киңрәк булачагын көтегез. Элеккеге стандартлаштыру әдәбиятында коммерция буягыч партияләре төрле булганга, чистартылган Azure B химик яктан чистарак альтернатива буларак та тәкъдим ителгән; бу Marshallның Azure B турындагы тикшеренүендә карала һәм ни өчен реагентның чисталык дәрәҗәсе ысуллар турында фикер алышуларда әле дә телгә алынуын аңлата.

Гадәти хаталардан саклану

Уңышсыз препаратларның күпчелеге дүрт хатага бәйле. Яңа метилен зәңгәре N урынына гадәти метилен зәңгәре заказ бирү техника аркасында түгел, ә химик үзенчәлекләр аркасында зәгыйфь буялуга китерә. Бәяләүгә кадәр фиксацияләү яки өстәмә буяу суправиталь сигналны бетерә. Буягыч утырымын гранулалар итеп санау нәтиҗәне арттыра; ике гранула кагыйдәсе һәм фильтрланган буягыч моны булдырмый. Ретикулоцитлар проценты түбән булганда артык аз күзәнәк санау тыштан төгәл күренгән, әмма ышаныч чикләре киң булган сан бирә. Һәр хатаның бер үк билгесе бар: реагент этабында ук билгеләнгән нәтиҗә өчен микроскопист микроскопны гаепли.