Метилен зәңгәрлегенең митохондрияләргә тәэсирен үлчәү: кислород, ATP һәм мембрана потенциалы

Әйтик, лаборатория сулышы бозылган митохондрияләргә метилен зәңгәрлеге өсти һәм кислород куллануның артуын күзәтә. Моннан соң буяу митохондрияләрнең эшчәнлеген торгызды дип язасы килә. Әмма бу җөмлә ялгыш булырга мөмкин. Кислород агымы, ATP синтезы һәм мембрана потенциалы — өч аерым төшенчә. Алар бер үк органеллага карый, нәкъ резерв күчермә ясау, синхронлаштыру һәм уртак куллану бер үк болыт папкасына караган кебек: үзара бәйләнгәннәр, әмма төрле кагыйдәләргә буйсыналар. Берсен икенчесе белән бутасаң, һәр үлчәү техник яктан дөрес булганда да нәтиҗәне аңлату ялгыш була.

Метилен зәңгәрлеге мондый буталу ихтималын арттыра, чөнки ул үзе үлчәнә торган системада катнаша. Ул — чылбырның алдагы өлешендә электроннарны кабул итеп, соңрак өлешендә аларны тапшыручы редокс-цикл катнашучысы, энергияләнгән митохондрияләрдә тупланучы липофиль катион һәм киң кулланыла торган зондлар белән бер үк спектраль диапазоннарда яктылык йотучы һәм чыгаручы куе зәңгәр кушылма. Бер генә күрсәткеч бу катлаулылыкны чагылдыра алмый. Будапештта үткәрелгән митохондрия тикшеренүләрендә күрсәтелгән ышанычлы алым — һәр адымда буяуга хас контрольләр кулланып, кислород агымын, ATP синтезы тизлеген, мембрана потенциалын һәм водород пероксиды бүленеп чыгуын бергә үлчәү.

Респирометрия энергия җитештерүне түгел, кислород агымын үлчи

Югары аерымлау сәләтле респирометрия, Oroboros Oxygraph яки Seahorse күзәнәктән тыш агым анализаторы белән башкарылсынмы, бер нәрсәне күрсәтә: кислород никадәр тиз кайтарыла. Ул бер электронга ничә протон күчерелгәнен, градиентның никадәр сакланганын яки ATP-синтазаның аннан файдаланганын күрсәтми.

Терминнар мөһим. Аерып алынган митохондрияләрдә ADP булмаган субстрат протоннар агып чыгуына бәйле сулышны, туендыручы күләмдәге ADP белән субстрат оксидлаштыручы фосфорлаштыру куәтен, ә аеру агенты белән титрлау электрон күчерүнең максималь куәтен күрсәтә. Бөтен күзәнәкләрдә Seahorse белән үлчәнә торган тиңдәш күрсәткечләр — базаль сулыш, олигомицинга сизгер ATP белән бәйле сулыш, протоннар агып чыгуы, FCCP ярдәмендә билгеләнгән максималь сулыш һәм ротенон белән антимицинга чыдам митохондрияләрдән тыш кислород куллану. Seahorse нәтиҗәләрен State 3 һәм State 4 дип атау әлеге препарат тәэмин итә алмаган төгәллекне күздә тота; моны Agilent Mito Stress Test схемасы ачык күрсәтә.

Метилен зәңгәрлеге күбрәк кислород белән күбрәк энергия арасындагы интуитив бәйләнешне өзә. Аерып алынган баш мие митохондрияләре тикшеренүе буенча, диңгез дуңгызының аерып алынган баш мие митохондрияләрендә 100 nM алып 1 uM кадәр буяу глутамат белән малат, сукцинат һәм альфа-глицерофосфат субстратлары булганда тыныч хәлдәге кислород куллануны арттырган; альфа-глицерофосфат белән арту якынча 64 процент булган. Әмма сәламәт митохондрияләрдә ADP белән стимуллаштырылган сулыш асылда үзгәрмәгән. Агып чыгуга бәйле сулыш арткан, ә ADP белән стимуллаштырылган агым үзгәрешсез калганга, исәпләнгән сулыш контроле коэффициенты кими. Бу кимү буяу митохондрияләрне зарарлаган дигән сүз түгел. Ул буяуның гадәти сулышка өстәп кислород кулланучы редокс-цикл барлыкка китерүен аңлата. Кислород куллануның артуын гына хәбәр иткән метилен зәңгәрлеге анализы чын химик процессны үлчәгән, әмма энергиянең саклануы турында берни дә әйтмәгән була.

Торгызу тәҗрибәләре шул ук аерманы зуррак масштабта күрсәтә. I комплекс блокланган очракта кислород агымы якынча өч тапкыр торгызылган, ә ATP синтезы — якынча 1.5 тапкыр гына. Электродка күбрәк кислород барып җиткән. Аның кечерәк өлеше ATP җитештерүгә киткән. Оксидлаштыручы фосфорлаштыруның яхшыруы турындагы теләсә нинди нәтиҗә өчен ATP ягын да исәпкә алырга кирәк; иң яхшысы — бүлүченең ничек билгеләнүен күрсәтеп, нәтиҗәне ATPның кислородка нисбәте рәвешендә бирү.

ATP анализлары синтез тизлеген үлчи, аны ATP күләме алыштыра алмый

ATP анализы башка сорауга җавап бирә: вакыт берәмлегенә күпме ATP барлыкка килә. Кинетик күрсәткеч — берничә минут дәвамында күзәтелгән яктырткыч коңгыз люциферазасының люминесценциясе яки 340 nm дулкын озынлыгында укыла торган гексокиназа белән глюкоза-6-фосфатдегидрогеназаның бәйләнгән анализы — тизлекне бирә. Соңгы ноктада гомуми ATPны бер тапкыр үлчәү исә аның күләмен күрсәтә; бу күләм синтез белән куллану аермасын чагылдыра һәм үзе генә оксидлаштыручы фосфорлаштыру турында аз мәгълүмат бирә.

Будапешт төркеме аденилаткиназа активлыгын бастырып, бәйләнгән ферментатив ысул кулланган һәм 1 алып 2 uM кадәр метилен зәңгәрлегенең ротенон һәм антимицин белән эшкәртелгән митохондрияләрдә ATP җитештерүне аз гына, әмма статистик яктан әһәмиятле дәрәҗәдә арттыруын ачыклаган. Бу — чын торгызу, әмма ул өлешчә генә. TEGDMA токсиклылыгы тикшеренүе башка модельдә дә шундый ук нәтиҗәгә килгән: 5 mM стоматологик TEGDMA мономеры I комплекс белән бәйле сулышны якынча 286 агым берәмлегеннән 28 кадәр төшергән, ә 2 uM буяу аны якынча 86 кадәр торгызган.

Төсле редокс-кушылма белән эшләгәндә ике контроль мәҗбүри. Беренчедән, үлчәнгән ATP синтезының күпме өлеше ATP-синтазага бәйле икәнен билгеләү өчен олигомицин кулланыгыз. Икенчедән, билгеле күләмдәге ATP, тулы реагент катнашмасы һәм нәкъ тәҗрибәдә кулланылган буяу концентрацияләре белән күзәнәксез мохиттә өстәлгән ATPның кире үлчәнүен тикшерегез; ким дигәндә 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM һәм 2 uM концентрацияләрен кулланыгыз. Буяу чыгарылган яктылыкны йота, сигнал бирүче ферментны тоткарлый яки реагентның редокс-химиясен үзгәртә ала. Гомуми люцифераза анализы буенча күрсәтмәләр нәкъ шушы төр комачаулау өчен биохимик өстәмә контроль тикшерүләр тәкъдим итә. Сүндерү гадәттә югарырак концентрацияләрдә көчлерәк булганга гына, 1 uM концентрациясендә артефактлар юк дип уйламагыз.

Мембрана потенциалы зондлары агымны түгел, буяуның таралышын үлчи

Сафранин O, TMRM һәм TMRE, родамин 123 һәм JC-1 — барысы да мембрана аша үтә ала торган катионнар. Алар электрохимик тигезләнешкә ярашлы рәвештә тискәре корылган матрикста туплана, шуңа күрә гомуми флуоресценция зондның кайда урнашуы аша потенциалны турыдан-туры түгел, ә читләтеп күрсәтә. Аларның берсе дә ATPны яки электрон агымын үлчәми.

Һәр зонд өчен аеруча уңай препарат бар. Сафранин O аерып алынган митохондрияләр һәм мембранасы үткәрүчән ителгән күзәнәкләр өчен яраклы; гадәттә ул якынча 2 uM концентрациясендә, якынча 495 nm кузгату һәм 585 nm нур чыгару дулкын озынлыкларында кулланыла. Ул сүндерү режимында эшли: зондның йотылуы гомуми флуоресценцияне үзгәртә. TMRM һәм TMRE бөтен күзәнәкләр өчен аз наномоляр йөкләнештә, сүндерүсез режимда яраклы; бу режимда деполяризация буяуны чыгара һәм митохондрия флуоресценциясе кими. Югары йөкләнештә үз-үзен сүндерү аркасында сигнал юнәлеше кирегә әйләнергә мөмкин. JC-1 яшел сигналның кызыл сигналга уңайлы нисбәтен бирә, әмма йөкләнешкә һәм митохондрияләр массасына бәйле; шуңа күрә сан ягыннан бәяләү өчен ул җентекләп контрольдә тотылган TMRMнан начаррак. Бу өстенлекләр һәм чикләүләр киң кулланыла торган митохондрия мембранасы потенциалы зондлары күзәтүендә тасвирланган.

Метилен зәңгәрлеге нәкъ эш концентрацияләрендә оптик комачаулау тудыра. Аның якынча 600 алып 665 nm кадәрге йоту диапазоннары кызыл зондларның нур чыгару диапазоны белән каплана, шуңа күрә эчке фильтр эффектлары, сүндерү һәм кузгатучы яктылыкны йоту — барысы да мөмкин. Буяу шулай ук икенче липофиль катион булып тора, һәм аның үз таралышы да үлчәнә торган потенциалга бәйле рәвештә үзгәрә. Моңа каршы чара — бәйсез кабат үлчәүләр һәм буш контрольләр: зонд кына, буяу гына, зонд белән буяуның һәр концентрациясе, нуль белешмәсе буларак FCCP белән тулы деполяризация һәм, иң яхшысы, оптик яктан аерылып торган икенче зонд. III комплексны әйләнеп узу тикшеренүе шундый үрнәк күрсәткән: антимицин һәм миксотиазол белән тоткарлаганнан соң, мембрана потенциалын торгызуны сафранин O һәм TMRM белән кабат тикшереп, сыйфат ягыннан бер үк торгызылу алганнар. Бер оптик сигнал — ишарә генә. Ике бәйсез сигнал — дәлил.

Өч препарат, өч төрле сорау

Аерып алынган митохондрияләр, мембранасы үткәрүчән ителгән күзәнәкләр һәм бөтен күзәнәкләр — бер анализның үзара алыштырыла торган сизгерлек көйләнмәләре түгел. Алар эш принциплары төрле булган аерым төшенчәләр.

Аерып алынган митохондрияләрдә электрон күчерү чылбыры, эчке мембрана һәм матриксның эш аппараты саклана, ә плазматик мембрана, цитозоль һәм челтәр төзелеше алып ташлана. Максат та шунда: субстратлар, ADP, ингибиторлар һәм буяу концентрацияләре төгәл билгеләнә, шуңа күрә процессны билгеле бер юлга бәйләргә мөмкин. Моның бәясе — табигый субстрат тәэминаты, сигнал тапшыру һәм энергиягә ихтыяҗ югалуы.

Мембранасы үткәрүчән ителгән күзәнәкләрдә митохондрияләр күзәнәк төзелешенең зур өлеше эчендә кала, ә ачыкланган плазматик мембрана аша тыштан бирелгән субстратлар һәм ADP үтә. Алар күзәнәк шартларында субстрат юлының бозылуын билгеләү өчен туры килгән корал булып тора. Мембрананы артык үткәрүчән итү тышкы мембрананы зарарлый, ә цитозольдәге көйләү компонентлары юылып чыга.

Бөтен күзәнәкләрдә барысы да саклана: плазматик мембрана киртәсе, цитозольдәге кайтаручылар, эндоген субстратларның күчерелүе, митохондрияләр челтәре һәм ATPга ихтыяҗ. Алар физиологиягә иң якын һәм механизмны турыдан-туры аңлатудан иң ерак тора, чөнки буяуның күзәнәккә керүе, кайтарылуы һәм аерым бүлекләрдә тотылып калуы митохондрияләргә нәтиҗәле тәэсирне бергә билгели.

TEGDMA тикшеренүендә өч дәрәҗә дә максатчан кулланылган: аерып алынган баш мие митохондрияләре — буяу ярдәмендә оксидлашуны һәм потенциалны торгызуны тикшерү өчен; мембранасы үткәрүчән ителгән теш пульпасының кәүсә күзәнәкләре — нигездә бозылуның I комплекс белән бәйле субстрат оксидлашуында булуын ачыклау өчен; бөтен кәүсә күзәнәкләре — 2 uM буяуның киметелгән кислород куллануга гомуми физиологик тәэсирен билгеләү өчен. Төрле препаратларда митохондриаль күрсәткечләрне чагыштыручы укучылар өчен метилен зәңгәрлегенең сулыш чылбыры аша электроннарны ничек күчерүе турындагы өстәмә аңлатма юлларның нигезен бирә, ә метилен зәңгәрлеге белән сулыш тикшеренүләрен уку кулланмасы концентрацияләр һәм ингибиторлар куллану логикасын аңлата.

Редокс-актив буяу таләп иткән контрольләр

Редокс-цикл катнашучысы өчен гадәти ингибиторга караганда озынрак контроль исемлеге кирәк, чөнки буяуның үз химиясе биологик процессны охшата ала.

Респирометрия өчен күрсәткечнең вакыт белән тайпылуын тикшерергә буфер гына булган камера, биологик материалсыз буфер белән буяу камерасы, буяу белән анализда булган теләсә нинди күзәнәктән тыш кайтаручы һәм, бөтен күзәнәкләрдә митохондрияләрдән тыш кислород куллануны билгеләү өчен, тәҗрибә ахырында ротенон белән антимицин кулланыгыз. Кайтарылган буяу электроннарны кислородка тапшырып һәм водород пероксиды барлыкка китереп яңадан оксидлаша. Шуңа күрә электрон доноры булмаган буяу гына контроль NADH яки NADPH барлыкка килгәч күзәнәксез мохиттә күзәтелә торган кислород куллануны киметеп бәяли.

Водород пероксиды өчен сайлап тәэсир итмәүче DCFDA буяулары урынына калибрланган Amplex UltraRed белән керән пероксидазасын куллану яхшырак; нәтиҗәне каталаза белән тикшерегез һәм яктыртуга бәйлелекне сынагыз, чөнки буяу — фотосенсибилизатор. Баш мие митохондрияләре тикшеренүендә нибары 100 nM буяу булганда пероксид йөкләнешенең дүрт тапкырдан күбрәк артуы, ә аның бетерелүе акрынаюы ачыкланган; пероксид супероксид арадаш продуктысыз, турыдан-туры кайтарылган буяудан барлыкка килгән. Зонд сайлау һәм яктылык контрольләре турындагы җентекләр буяу тәҗрибәләрендә кислородның реактив төрләрен үлчәү турындагы өстәмә мәкаләдә бирелгән. Пероксидның кайчан сигнал, ә кайчан йөкләнеш булып хезмәт итүе турындагы киңрәк сорау исә күзәнәкнең редокс-тигезләнеше һәм антиоксидант үзлекләр турындагы раслаулар белән бергә карала.

Юл турында нәтиҗәләр ясау өчен III комплекс ингибиторларының ике урынын да тикшерегез: Qi урынында антимицин A һәм Qo урынында миксотиазол; шулай ук цианид белән IV комплекс дәрәҗәсендәге соңгы контрольне өстәгез. Тычкан баш миенең элегрәк үткәрелгән тикшеренүендә буяуның ротенон белән блокланган сулышны торгызуы, әмма антимицин белән блокланганын торгызмавы хәбәр ителгән. Соңрак өч төрдә үткәрелгән тикшеренүдә исә ике ингибитор белән дә өлешчә торгызылу һәм цитохром cның турыдан-туры кайтарылуы дәлилләре табылган. Әйләнеп узуны тулысынча расланган факт дип түгел, ә яңарак мәгълүматларга туры килә торган аңлатма дип карагыз, чөнки буяу концентрациясе, ингибиторның тәэсир урыны, субстратның хәле һәм буяуның таралышы — барысы да күзәтелгән юлны үзгәртә.

Анализ сайлау матрицасы

Бу таблицаны сораудан чыгып үлчәүне сайлау өчен кулланыгыз, киресенчә түгел.

Минималь дәрәҗәдә ышандырырлык нәтиҗә ясау өчен бер үк буяу концентрацияләрен — 100 nM, 300 nM, 1 uM һәм 2 uM — кулланып, агып чыгу, ADP, олигомицин һәм аеру агенты шартларында кислород агымын, ATP синтезы тизлеген, мөмкин булса ике зонд белән мембрана потенциалын, шулай ук каталаза һәм күзәнәксез контрольләр белән калибрланган пероксид бүленеп чыгуын үлчәргә кирәк. Үзара бәйләнгән күрсәткечләр җыелмасын хәбәр итегез: кислород агымы, ATP синтезы тизлеге, ATPның кислородка нисбәте, потенциал һәм пероксид. Бу саннарның теләсә кайсы берсе аерым алганда — үз мәгънәсен эзләүче үлчәү генә.