Мәкалә
Метилен зәңгәрлеге һәм азот оксиды: NOS, cGMP һәм кан тамырларында сигнал тапшыру
Сорау гади яңгырый: метилен зәңгәрлеге азот оксидын тоткарлыймы? Лабораториядә җавап дүрт аерым сорауга бүленә, һәм аларның һәрберсен төрле тәҗрибә белән тикшерәләр. Аларны бутату — метилен зәңгәрлеге һәм азот оксиды турындагы язмаларның ышанычлы яңгырап та, төгәл булмавының төп сәбәбе.
Азот оксиды сигналын дүрт буынлы чылбыр итеп күз алдына китерегез. Азот оксиды синтазасын ясау өчен ген транскрипцияләнә. Фермент аргининны азот оксидына әйләндерә. Газ, башка берәр нәрсә белән реакциягә кергәнче, диффузия аша үз мишененә барып җитә. Эри торган гуанилатциклаза аны сизә һәм цикллы GMP ясый. Метилен зәңгәрлегенең һәр буынга йогынтысы турында басылып чыккан мәгълүматлар бар, ләкин дәлилләр төрле тәҗрибә системаларыннан, төрле концентрацияләрдән һәм төрле изоформалардан алынган. Бер буындагы нәтиҗә икенче буынга йогынтыны расламый.
Төп чылбырны гади итеп аңлату
Кан тамыры стенасында гадәти эзлеклелек болай бара. Бер стимул эндотелий күзәнәгенә тәэсир итә. eNOS яки NOS3 дип аталган эндотелий азот оксиды синтазасы кыска вакытка аз күләмдә азот оксиды чыгара. Газ күрше шома мускул күзәнәгенә диффузияләнә, эри торган гуанилатциклазаның кайтарылган тимерле гемына бәйләнә һәм GTPның цикллы GMPга әверелүен тизләтә. Цикллы GMP G протеинкиназасын активлаштыра, кальций алмашы үзгәрә, һәм мускул йомшара.
Аерым карарга кирәкле икенче чылбыр да бар. Инфекция вакытында яки цитокиннар тәэсирендә күзәнәкләр башка ферментны — индукцияләнә торган азот оксиды синтазасын, ягъни iNOSны транскрипцияли; ул шулай ук NOS2 дип атала. Ул eNOSка караганда зуррак һәм озаграк дәвам итә торган азот оксиды агымнарын барлыкка китерә. Өченче изоформа — нейрональ NOS, ягъни nNOS — бөтенләй башка контекстка карый. Мәкаләдә изоформасы күрсәтелмичә азот оксиды синтазасы дип язылган булса, тукталып, кайсысы үлчәнгәнен тикшерегез. Метилен зәңгәрлегенең электроннарны ничек күчерүенә күзәтү дә, гомумән, редокс-мишеньнәр өчен шул ук фикерне ассызыклый: арадашчы үзеннән-үзе берни эшләми, нәтиҗәне аның һәр очындагы партнер билгели.
Үлчәнгән цикллы GMP да турыдан-туры фермент анализы түгел, ә берничә процессның уртак нәтиҗәсен чагылдырган күрсәткеч. Аның дәрәҗәсе циклаза башкарган синтез белән фосфодиэстеразалар, аеруча кан тамырларының шома мускулындагы PDE5, башкарган таркалу арасындагы аерманы чагылдыра. Шуңа күрә цикллы GMPның кимүе детекторга азрак сигнал килеп җитүен аңлата. Бу үзе генә кайсы буын эштән чыкканын күрсәтми.
1 нче буын: iNOS ферменты азрак ясала
Бактериаль липополисахарид, интерферон гамма яки икесе белән дә стимуллаштырылган тычкан макрофагларында метилен зәңгәрлеге iNOS аксымының көтелгән артуына юл куймаган һәм макрофагларда транскрипция тәҗрибәләрендә iNOSның матрица РНКсын нык киметкән. Монда нәрсәнең үзгәрмәве аеруча әһәмиятле. I каппа B альфа ингибиторының таркалуы, NF каппа B һәм STAT1нең фосфорлануы һәм бу факторларның төшкә күчүе нигездә үзгәрешсез калган. Аларның ДНКга бәйләнүе кимегән; моны iNOS промоторындагы бәйләнү кимүен күрсәткән хроматин иммунопреципитациясе раслаган.
Бу — инде булган ферментны кискен блоклау түгел, ә фермент күләменең үзгәрүенә кадәрге ген көйләү эффекты. Ул ялкынсыну сигналларын тапшыруга карый: анда аксым барлыкка килгәнче транскрипция факторлары промоторга бәйләнергә тиеш. Бу нәтиҗә тыныч халәттәге кан тамырындагы конститутив eNOS турында турыдан-туры берни әйтми, һәм аны нәкъ шул чикләр белән тасвирларга кирәк.
2 нче буын: булган NOS ферменты акрынрак эшли
Күселәрдәге бер тикшеренү башка дәрәҗәне сынаган. Аңлы халәттәге ата күселәргә липополисахарид вена эченә кертелгән, аннары өч сәгатьтән соң вена эченә я физиологик эремә, я тән массасының һәр kg исәбенә 3 mg метилен зәңгәрлеге кертелгән. Гипоталамуста NOS активлыгын тикшерүдә медиаль базаль гипоталамустагы азот оксиды синтазасы активлыгын тамгаланган аргининның цитруллинга әверелүе буенча үлчәгәннәр. Стресс һәм физиологик эремә генә кальцийга бәйсез активлыкның берникадәр артуын китереп чыгарган, ә липополисахарид аны контроль дәрәҗәгә караганда якынча ун тапкырга күтәргән. Метилен зәңгәрлеге ике индукцияләнгән компонентны да юкка чыгарган. Шул тукымада, шул дозада һәм шул вакыт ноктасында кальцийга бәйле конститутив активлык үзгәрмәгән.
Бу нәтиҗәне нәкъ язылганча укыгыз: әлеге шартларда үлчәнгән iNOS тибындагы активлык басылган. Бу ген экспрессиясен үлчәү түгел, һәм ул eNOS яки nNOS белән чагыштырганда iNOSка һәрвакыт сайлап тәэсир итүне расламый. Чистартылган фермент белән эшләр бу кисәтүне тагын да көчәйтә. Чистартылган азот оксиды синтазасының турыдан-туры анализларында метилен зәңгәрлеге 30 micromolar концентрациядә цитруллин барлыкка килүен тулысынча блоклаган. Чистартылган NOS белән гуанилатциклазаны чагыштыруда хәбәр ителгәнчә, яртылаш тоткарлау концентрациясе супероксиддисмутазасыз якынча 5.3 micromolar, ә аның белән 9.2 micromolar булган. Чистартылган nNOSны аерым тикшерү ферментка бәйләнгән гемның оксидлашуын күрсәткән. Гамәли нәтиҗә шундый: аерымланган системаларда NOSны турыдан-туры тоткарлау чыннан да күзәтелә, ләкин гипоталамус нәтиҗәсеннән метилен зәңгәрлеге бөтен җирдә барлык конститутив NOSны да саклап кала дигән гомуми нәтиҗә ясарга ярамый.
3 нче буын: азот оксиды барып җиткәнче югала
Цикллы GMPның кимүен ферментны блоклаудан башка нәрсә дә аңлата алуын иң ачык күрсәткән тәҗрибә культурада үстерелгән куян үпкә артериясенең шома мускул күзәнәкләрендә үткәрелгән. Азот оксиды донорларын турыдан-туры өстәп, тәҗрибәдә эндоген NOS тулысынча читләтеп үтелгән. Аннары кан тамырларының шома мускулында супероксидны тикшерүдә метилен зәңгәрлегенең барыбер цикллы GMP җавабын басу-басмавын ачыклаганнар.
Өч донор 1дән 100 micromolarга кадәр концентрацияләрдә сынап каралган: S-нитрозо-L-цистеин, натрий нитропруссиды һәм MPANO дип аталган тотрыклы деаминлаштырылган аналог. Аларның барысы да цикллы GMPны якынча 1.5 тапкырдан 12 тапкырга кадәр арттырган. 10 micromolar концентрациядәге метилен зәңгәрлеге беренче икесенең җавабын 51дән 100 процентка кадәр баскан, ә MPANO җавабын үзгәртмәгән. Әгәр метилен зәңгәрлеге циклазаның каталитик үзәген генә блоклаган булса, донорга бәйле мондый аерманы аңлату кыен булыр иде, чөнки өчесе дә чылбырның алдагы өлешендәге бер үк ферментка йогынты ясый.
Аннары өч контроль механизмның супероксидка бәйле булуын ачыклаган. Беренчедән, ксантин һәм ксантиноксидаза ярдәмендә күзәнәктән тыш супероксид барлыкка китерү шул ук күренешне кабатлаган: CYSNO һәм нитропруссид җаваплары блокланган, MPANO җавабы сакланган. Икенчедән, метилен зәңгәрлеге шома мускул күзәнәкләрендә дозага һәм вакытка бәйле супероксид барлыкка килүен китереп чыгарган; моны цитохром cның кайтарылуы буенча үлчәгәннәр. Өченчедән, супероксиддисмутаза тоткарлануны тулысынча булдырмый калган, ә каталаза моны эшләмәгән. Бу әлеге тәҗрибә системасында турыдан-туры йогынты ясаучы кисәкчә водород пероксиды түгел, ә супероксид булуын күрсәтә.
Тәҗрибәнең уртак культура вариантына тукталу мөһим, чөнки ул эффектның кайда барлыкка килүен күрсәтә. Каплагыч пыялалардагы эндотелий күзәнәкләрен кыска вакытка шома мускул күзәнәкләре белән бергә үстергәннәр. Нәтиҗәдә, базаль рәвештә бүленеп чыккан эндотелий факторы шома мускулдагы цикллы GMPны өчтән сигез тапкырга кадәр арттырган. Ике бүлекнең кайсысын гына булса да алдан метилен зәңгәрлеге белән эшкәртү бу сигналны киметкән, ә супероксиддисмутаза эндотелийны алдан эшкәртү нәтиҗәсендә кимегән җавапны өлешчә торгызган. Башкача әйткәндә, метилен зәңгәрлеге шома мускулдагы детектор күзәнәк эчендә бөтенләй тәэсир итмәскә дә мөмкин. Ул, хәбәрче молекуланы юлда юкка чыгарып, сигналны киметә ала. Метилен зәңгәрлеге тикшеренүләрен уку буенча кулланма моны гомуми кагыйдә итеп карый: молекуляр мишеньне атаганчы, тәэсир кайсы бүлектә башкарылганын әйтегез.
Моны NOSны тоткарлау дип атау дөрес булмас иде. Донорлар эшләсен өчен синтаза этабы кирәк булмаган, әмма сигнал барыбер кимегән.
4 нче буын: детекторның үз җавабы кими
Эри торган гуанилатциклазага турыдан-туры йогынты бар, ләкин концентрацияләр мөһим. Югарыда китерелгән чистартылган ферментларны чагыштыруда азот оксиды белән стимуллаштырылган циклазаны яртылаш тоткарлау өчен якынча 60 micromolar метилен зәңгәрлеге кирәк булган. NOS өчен яртылаш тоткарлау якынча 5тән 9 micromolarга кадәр булган, ә хәтта 1 millimolar да максималь блоклауны өлешчә генә тәэмин иткән. Бу — якынча алтыдан унбер тапкырга кадәр аерма. Шуңа күрә күзәнәкләрдә түбән микромоляр концентрациядә цикллы GMPны киметкән тәҗрибәне, цикллы GMP күрсәткеченә генә таянып, циклазаны сайлап тоткарлау дип атап булмый.
Соңрак үткәрелгән редокс-тикшеренү тагын бер кисәтү өстәгән: метилен зәңгәрлеге азот оксиды активлаштырган циклазаны гем тимеренең һава белән гади оксидлашуыннан аерылып торган механизм аша активсызландырган. Димәк, детекторның эшләве бозыла ала, ләкин химик механизм тулысынча ачыкланмаган. Концентрацияләр арасындагы аерма түбән микромоляр тәэсирләрдә башта супероксид һәм NOS эффектларын кире кагарга кирәклеген аңлата. Фосфодиэстеразаны контрольдә тоту да шушында урынлы. Таркалу үлчәнмәгән яки блокланмаган булса, цикллы GMP туплануының кимүе синтезның кимүе, таркалуның тизләнүе яки икесе белән дә аңлатыла ала.
Ни өчен моны кан басымы турында бер генә раслауга кайтарып калдырып булмый
Һәр буын төрле системада ачыкланган. Макрофаглардагы транскрипция — гипоталамустагы фермент активлыгы түгел. Липополисахаридтан соңгы гипоталамус активлыгы — тыныч халәттәге эндотелий тонусы түгел. Уртак культурада базаль рәвештә бүленеп чыккан эндотелий факторы — агонист белән стимуллаштырылган кан тамырлары киңәюе түгел. 10 micromolar метилен зәңгәрлеге тәэсирендәге культурада үстерелгән үпкә артериясе күзәнәкләре — кешенең кан әйләнеше түгел. Аларны метилен зәңгәрлеге азот оксидын блоклап кан басымын күтәрә кебек бер раслауга берләштерү контрольләр нәкъ саклап калу өчен төзелгән аермаларны юкка чыгара.
Өч тикшерү аңлатманы төгәл тота. Беренчедән, изоформаны атагыз: тыныч халәттәге кан тамырлары тонусы өчен eNOS, индукцияләнгән ялкынсыну агымы өчен iNOS, нейрональ һәм кайбер чистартылган фермент контекстлары өчен nNOS. Икенчедән, азот оксиды сигналының ничек җиткерелүен атагыз: эндоген синтез, эндотелийдан базаль бүленеп чыгу яки CYSNO, нитропруссид йә MPANO кебек билгеле бер донор. Чөнки тотрыклы донор метилен зәңгәрлегенә каршы торган, ә тотрыксызлары каршы тора алмаган. Өченчедән, концентрацияне һәм җавапны торгызучы контрольне атагыз: супероксиддисмутаза белән җавапны торгызу супероксид катнашуын күрсәтә; каталазаның ярдәм итмәве әлеге тәҗрибә системасында водород пероксидына каршы дәлил булып тора; ксантиноксидаза белән эффектны кабатлау бу механизмның җитәрлек булуын күрсәтә; ә чистартылган фермент анализлары катализга турыдан-туры йогынтыны хәбәрченең юлда югалуыннан аера.
Кыскача нәтиҗә шундый. Метилен зәңгәрлеген сайлап тәэсир итүче циклаза блокаторы итеп түгел, ә азот оксидыннан цикллы GMPга сигнал тапшыруның берничә ноктасын үзгәртүче матдә итеп карау дөресрәк. Тәҗрибә системасына һәм концентрациягә карап, ул iNOS транскрипция факторларының бәйләнүен киметә, NOS ферментларын турыдан-туры тоткарлый, супероксид барлыкка китереп азот оксидының җитәрлек булуын киметә һәм азот оксиды активлаштырган циклаза эшләвен боза ала. Кан тамырларын тикшерүдә цикллы GMP сигналларының роле һәм күзәнәк анализларында кулланыла торган азот оксиды донорларын чагыштыру бу тармакларның һәрберсен җентекләбрәк яктырта. Ә редокс-эффектларны фермент эффектларыннан аеру өчен кулланыла торган ысуллар супероксиддисмутаза, каталаза һәм тотрыклы донор белән контрольнең ни өчен бу әдәбиятта шулкадәр еш очравын аңлата.
Метилен зәңгәрлегеннән соң цикллы GMPның түбән булуы чылбырның өзелгәнен күрсәтә. Кайсы буынның өзелгәнен контрольләр генә әйтә.