Ни өчен метилен зәңгәре кислотага чыдам буяуда өстәмә буягыч буларак кулланыла

Лаборант буяу эзлеклелеге тулысынча башкарылганнан соң какрык мазогын карый. Зәңгәр фонда кызыл таякчыклар ачык күренә, һәм нәтиҗәдә кислотага чыдам бациллалар күренүе теркәлә. Икенче көнне башка предмет пыяласында кызыл таякчыкларсыз тоташ зәңгәр фон күренә, һәм нәтиҗә туберкулезга тискәре дип языла. Бу нәтиҗәләрнең берсе предмет пыяласы раслаганнан күбрәкне белдерә, һәм ул — беренчесе түгел.

Буталыш төшенчәләрне аңлаудан башлана. Лаборант зәңгәр буягычны ачыклау химиясенең бер өлеше итеп кабул иткән, гүя метилен зәңгәре микобактерияләрне табарга ярдәм итә. Ул ярдәм итмәгән. Метилен зәңгәре предмет пыяласына тигәндә, сынау инде тәмамланган була. Буягыч нәтиҗәне укып булсын өчен фонны гына буйый. Бу мәкалә кислотага чыдам буяуда метилен зәңгәренең максатын, ни өчен башка төс түгел, ә зәңгәр кулланылуын һәм зәңгәр фонда кызыл төс күренгәндә нинди нәтиҗә ясарга мөмкин булуын аңлата.

Кыска җавап

Кислотага чыдам буяу — өч идеягә нигезләнгән дифференциаль сынау. Төп буягыч булган карбол фуксин һәр күзәнәккә, шул исәптән балавызсыман тышчалы микобактерияләргә дә, мәҗбүри кертелә. Төссезләндергеч булган кислота-спирт гадәти күзәнәкләрдән кызыл буягычны чыгара, ләкин кислотага чыдам күзәнәкләрдән аны чыгара алмый. Аннары өстәмә буягыч булган метилен зәңгәре төссезләндергеч бушаткан бар нәрсәне буйый: кислотага чыдам булмаган күзәнәкләр, хуҗа организм күзәнәкләре һәм калдыклар зәңгәр булып күренә, ә кислотага чыдам бациллалар кызыл булып кала. Өстәмә буяу контраст тудыра. Ул күзәнәкне кислотага чыдам иткән химиядә катнашмый.

Һәр адым нәрсә эшли

Түбәндәге схема вазифалар бүленешен күрсәтә. Аны процедура буларак сулдан уңга укыгыз, ә аскы тасманы һәр буяу төркеменең үз соравына җавап эзләвен искәртү итеп карагыз.

Башта буягыч эчкә үтеп керә. Микобактерияләр гадәти су нигезендәге буягычларга каршы тора, чөнки аларның тышчасы гадәттән тыш гидрофоб; шуңа күрә протокол буягычны мәҗбүри кертә. Циль–Нильсен ысулында пар чыкканчы җылыту феноллы карбол фуксинны балавызсыман дивар аша үткәрә. Киньонның салкын ысулында җылыту урынына төп буягычның күпкә көчлерәк составы кулланыла, ә җылытусыз кайбер үзгәртелгән вариантларга өслек-актив матдәләр өстәлә. Америка микробиология җәмгыятенең кислотага чыдам буяу протоколларында ике состав янәшә китерелгән, һәм концентрация аермасы шактый зур: җылытып буяу ысулы өчен 100 mL га якынча 0.3 g нигезле фуксин, ә салкын ысул өчен якынча 4 g.

Икенче адым — дифференциация. Гадәттә 97 mL 95 процентлы этанолга 3 mL концентрланган хлорид кислотасы кушып әзерләнгән кислота-спирт махсус каршылык күрсәтмәгән диварлы һәр күзәнәктән кызыл буягычны юып чыгара. Микобактерияләргә хас липидлы тышчасы бөтен булган күзәнәкләр буягычны саклап кала. Бөтен ысул нәкъ шушы адымга бәйле, һәм ул, түбәндә аңлатылганча, башкару техникасына иң сизгер адым.

Соңгы адым — контраст. Хәзер предмет пыяласында буягычы чыгарылган күзәнәкләрдән торган диярлек төссез фонда кызыл, кислотага чыдам күзәнәкләр бар. 0.3 процентлы w/v метилен зәңгәре бу фонны кызылдан мөмкин кадәр аерылып торган төс белән яңадан күренерлек итә. Өстәмә буяу кыска була: җылытып буяу ысулында гадәттә 20–30 секунд, ә салкын ысулның кайбер вариантларында берничә минутка кадәр. Бу вакыт буягычның үз үзлегенә түгел, ә протоколга бәйле.

Ни өчен нәкъ бу буягыч һәм ни өчен зәңгәр

Метилен зәңгәре — катионлы нигезле буягыч. Димәк, аның төсле ионы уңай корылма йөртә һәм төссезләндерелгән бактерияләрнең, хуҗа организм күзәнәкләренең һәм калдыкларның тискәре корылмалы өслекләренә бәйләнә. OpenStax микробиология дәреслеге бу корылмалар логикасын нигезле буягычларның гомуми эш принцибы дип тасвирлый. Ләкин монда метилен зәңгәренең химик яктан уникальлеге юк. Кристаллвиолет һәм сафранин да нигезле буягычлар. Сайлау химик түгел, ә оптик сәбәпләргә нигезләнә.

Кызыл таякчыкларга контрастлы төсмердәге фон кирәк, һәм якты кырлы микроскопиядә зәңгәр кызылдан иң файдалы рәвештә аерылып тора. Сафранин өстәмә буягыч буларак начар сайлау булыр иде, чөнки аның соңгы алсу-кызыл төсе сакланып калган карбол фуксинга артык якын, нәтиҗәдә процедура булдырган аерма югала. Кристаллвиолет исә нечкә кызыл бациллалар белән игътибар өчен көндәшлек итәрлек куе шәмәхә фон тудырыр иде. Вазифаның химиядә түгел, ә контрастта булуын иң нык раслаган дәлил — буягычны алыштыру мөмкинлеге: малахит яшеле һәм бриллиант яшеле кебек яшел өстәмә буягычлар кайбер ветеринария һәм үзгәртелгән протоколларда кулланыла, һәм сынау барыбер эшли, чөнки ачык аерылып торган теләсә кайсы төсмер шул ук вазифаны башкара.

Моннан ике гамәли нәтиҗә чыга. Беренчедән, стандарт рецептта pH көйләү каралмаган; бу гади 0.3 процентлы су эремәсен Лёффлерның метилен зәңгәре кебек селтеле составлар белән бутамагыз: алар башка буяу концепциясенә карый. Икенчедән, артык буяу зыян китерә. Гистология әдәбияты артык куе зәңгәр фонның аз сандагы бациллаларны яшерә алуын махсус искәртә. Шуңа күрә буягычны предмет пыяласында протоколда күрсәтелгәннән озаграк тоту күренешнең аңлаешлылыгын киметә һәм бернинди өстенлек бирми.

Сынауны мөмкин иткән дивар химиясе

Кислота-спиртның күзәнәкләрне аеруы микобактерия тышчасына бәйле. Аның структур нигезе — миколил-арабиногалактан-пептидогликан комплексы: пептидогликан арабиногалактанга тоташкан, ә арабиногалактанның тышкы очларына бик озын чылбырлы микол кислоталары бәйләнгән. Алар липидларга бай, үткәрүчәнлеге гадәттән тыш түбән булган тышкы микомембрана барлыкка китерә. Микобактерияләрнең тышкы мембранасы турындагы күзәтү мәкаләсе бу төзелешне җентекләп аңлата. Барьер ике юнәлештә дә эшли. Ул буягычның керүенә каршы тора, шуңа күрә үтеп керү өчен җылыту яки көчәйтелгән төп буягыч кирәк; ул шулай ук буягычның чыгарылуына каршы тора, шуңа күрә карбол фуксин эчкә кергәннән соң кислота-спирт аны чыгара алмый. Гадәти бактерияләрдә мондый тышча юк, һәм алар буягычны югалта. Шуңа күрә кислотага чыдамлыкны фуксинның микол кислотасына химик бәйләнүе итеп түгел, ә липид барьеры күренеше итеп аңлау дөресрәк.

Бу химия киң таралган бер сорауны да аңлата: микобактерияләр Грам ысулы белән начар һәм тотрыксыз буяла, кайчак тонык, төймәле формалар яки буялмаган шәүләләр рәвешендә күренә. Аларның гидрофоб дивары кристаллвиолетның үтеп керүен чикли. Кислотага чыдам буяу — Грам буявының үзгәртелгән варианты түгел. Ул диварның башка үзлегенә нигезләнгән башка дифференциаль принцип. Гади буяу белән Грам буявын чагыштыру калган ике ысул өчен бу аерманы күрсәтә.

Өч ысул, өч сорау

Бактерияләрне бер буягыч белән буяу ысулларының киңрәк төркемен карау өчен микроскопиядә буяу атласына мөрәҗәгать итегез.

Зәңгәр фонда кызыл төс нәрсәне раслый алмый

Кызыл таякчыклар организмнарның кислота-спирт тәэсиреннән соң карбол фуксинны саклап калуын аңлата. Бу табыш Mycobacterium tuberculosis белән туры килә, ләкин CDCның туберкулез диагностикасы буенча күрсәтмәләре башка микобактерияләрнең дә кислотага чыдам булуын ачык искәртә. Шуңа күрә төрне билгеләү өчен төс түгел, ә культура үстерү һәм нуклеин кислоталарын тикшерү кирәк.

Техника хаталары ике юу этабы тирәсендә туплана. Җитәрлек төссезләндермәү фон материалын кызыл килеш калдыра һәм ялган уңай нәтиҗәгә китерергә мөмкин. Артык төссезләндерү зәгыйфь тотылып торган төп буягычны чыгара һәм ялган тискәре нәтиҗәләргә өлеш кертә. Өстәмә буягычны артык күп куллану аз сандагы бациллаларны зәңгәр фонда яшерә. Калын мазоклар, утырмага төшкән реагентлар һәм пычранган юу суы үз артефактларын өсти.

Техника никадәр төгәл булса да, сизгерлек организмнар саны белән чикләнә. Гадәти мазок микроскопиясе өчен бер миллилитр какрыкта якынча 5,000–10,000 бацилла кирәк. CDCның элекке дәлилләр күзәтүләрендә культура белән расланган үпкә очраклары арасында мазок сизгерлеге якынча 45–80 процент дип күрсәтелгән. Шуңа күрә тискәре мазок туберкулезны беркайчан да кире какмый. CDCның хәзерге күрсәтмәләре һәр мазок белән бергә культура үстерүне дә саклый һәм, үпкә туберкулезы шикләнелгәндә һәм нәтиҗә пациентны алып бару тактикасын үзгәртәчәк булганда, кимендә бер сулыш юллары үрнәгендә нуклеин кислоталарын амплификацияләү сынавын үткәрергә киңәш итә.

Гамәли эш расланган протоколларга нигезләнергә тиеш

Укыту максатындагы тасвирламалар, шул исәптән бу мәкалә дә, клиник эш башкарырга рөхсәт бирми. Лабораториядә гамәли эш өчен хәзерге CDC, APHL яки CLSI документларына туры китерелгән, лаборатория тарафыннан валидлаштырылган стандарт эш процедурасын үтәгез; CDCның Stacks архивында сакланган кислотага чыдам буяу буенча белешмәсе мондый процедураларда реагентларның һәм нәтиҗәләрне бәяләүнең ничек күрсәтелүен тасвирлый. Туберкулез үрнәкләре белән эшләү биологик изоляция таләп итә: мазоклар биологик куркынычсызлык шкафында әзерләнә, чөнки әзерләү вакытында аэрозольләр һәм чәчрәүләр барлыкка килә. CDCның лаборатория куркынычсызлыгы күрсәтмәләре хәтта җылылык белән фиксацияләнгән мазокларда да яшәүгә сәләтле туберкулез бациллалары булырга мөмкинлеген һәм алар белән һаман да пычранган материал буларак эшләргә кирәклеген белдерә. CDCның җәмәгать сәламәтлеге рәсемнәр китапханәсендәге M. leprae эзләп тикшерелгән, карбол фуксин һәм метилен зәңгәре белән буялган мазок турындагы язма бу ысулның туберкулездан тыш та кулланылуын искәртә: кислотага чыдам организмнар эзләнгән һәр очракта шул ук зәңгәр фонда кызыл контраст хезмәт итә, ә җентекләп бәяләнгән тискәре күренеш үзе дә теркәргә лаеклы нәтиҗә.

Әзер предмет пыяласын бәяләү

Өстәмә буяуның әһәмияте башлангыч карау вакытында күренә. Микроскопист аз зурайтуда караганда башта зәңгәр фон ярдәмендә мазок сыйфатын бәяли: күзәнәкләр тигез таралганмы, фокуслау өчен хуҗа организмның бөтен күзәнәкләре бармы, күп утырма юкмы. Аннары кызыл кандидатлар күзгә ташлана, чөнки предмет пыяласында башка бернәрсә дә кызыл түгел. Раслау майлы иммерсия астында башкарыла: анда чын бациллалар бертөрле буягыч калдыклары булып түгел, ә көтелгән нечкә, кайчак бераз бөгелгән яки төймәле таякчыклар булып күренә.

Фонны буяу нәтиҗә язмасының сүзләрен дә билгели. Кызыл бациллалар булган предмет пыяласы турында кислотага чыдам бациллалар күренде дип хәбәр ителә; еш кына лаборатория шкаласы буенча ярыммикъдари дәрәҗә дә күрсәтелә. Кызыл организмнар булмаган предмет пыяласы турында кислотага чыдам бациллалар күренмәде дип языла, беркайчан да туберкулезга тискәре дип түгел. Бу аерма мөһим, чөнки зәңгәр фон буяуның эшләгәнен, күзәнәкләрнең өстәмә буягычны кабул иткәнен һәм оптика шартларының җитәрлек булганын раслый, ләкин ачыклау чигеннән түбән сандагы организмнар турында бернәрсә дә әйтми. Кызыл таякчыкларсыз зәңгәр фон — предмет пыяласы турында дөрес нәтиҗә, пациент турында хөкем түгел.

Вазифалар бүленешен истә тотсагыз, нәтиҗәне дөрес язу җиңел була. Карбол фуксин кандидатларны аерып күрсәтә. Кислота-спирт сынауны үткәрә. Метилен зәңгәре җавапны аңлаешлы гына итә: кызыл төс кислотаның тәэсиренә карамастан буягычны саклап калган, зәңгәр төс исә аны югалткан. Калган бар нәрсә — төр, организмнар саны һәм клиник мәгънә — предмет пыяласыннан тыш үткәрелгән эштән килә.