Метилен зәңгәре белән гади буяу һәм Грам буенча буяу: һәр ысул нәрсәне раслый ала

Студент E. coli дип тамгаланган культурадан мазок әзерли, аны бер минутка метилен зәңгәре белән каплый, чайкый һәм майлы иммерсия объективы аша карый. Күрү кыры зәңгәр таякчыклар белән тулы. Лаборатория хисабында: «Грам-тискәре таякчыклар E. coli дип идентификацияләнде», — дип язылган. Күзәтү дөрес. Әмма бу препарат андый нәтиҗә ясарга нигез бирми.

Хата техникада түгел, төшенчәләрне аңлауда. Студент гади буяуны дифференциаль сынау итеп кабул иткән. Гади буяу һәм Грам буенча буяу төрле сорауларга җавап бирә, чөнки алар төрле буяу принципларына нигезләнә. Берсе: «Нинди форма бар?» — дип сорый. Икенчесе: «Сынау шартларында күзәнәк стенасы үзен ничек тота?» — дип сорый. Бу икесен бутасаң, дөрес буялган препарат нигезсез хисапка китерә.

Бу чагыштыру ике ысулны бер-берсеннән аера, һәр нәтиҗә нигезендә нәрсә әйтергә мөмкин булуын күрсәтә һәм студентлар иң еш бирә торган ике сорауга җавап бирә: метилен зәңгәрен Грам буенча буяуда кулланып буламы һәм E. coli күзәнәкләрен метилен зәңгәре белән буяу чынлыкта нәрсәне күрсәтә?

Кыска җавап

Метилен зәңгәре белән гади буяу буяла алган һәр күзәнәкне бер үк зәңгәр төскә кертә. Шуңа күрә ул морфологияне (таякчыклар, шарлар, спиральләр) һәм урнашуны (аерым, парлап, чылбыр булып) күрсәтә, әмма Грам категориясе турында берни дә белдерми. Грам буенча буяу йод, төссезләндерү этабы һәм өстәмә буяу кертә. Шулай итеп, ул бактерияләрне тышчаларының буягычны ничек саклап калуына карап грам-уңай (шәмәхә) һәм грам-тискәре (алсу яки кызыл) төркемнәргә аера. Метилен зәңгәреннән соң күренгән зәңгәр таякчыклар «таякчык формасындагы күзәнәкләр бар» дигәнне аңлата. Грам буенча тулы буяу эзлеклелегеннән соң күренгән алсу таякчыклар «грам-тискәре таякчыклар бар» дигәнне аңлата. Икенче раслау ныграк нигезләнгән, чөнки процедурада өстәмә сынау үткәрелгән.

Бу мәкалә караган, бер буягыч куллануга нигезләнгән бактерия буяу ысулларының киңрәк төркеме турында микроскопиядә буяу атласыннан укыгыз.

Гади буяу: бер буягыч, бер сорау

Метилен зәңгәре — нигезле (катионлы) буягыч. Аның төсле ионы уңай корылма йөртә һәм күзәнәктәге тискәре корылмалы структураларга, шул исәптән нуклеин кислоталарына һәм өслектәге кислоталы төркемнәргә бәйләнә. Шуңа күрә күзәнәкләр тонык фон өстендә зәңгәр булып күренә. OpenStax бу уңай буяу принцибын буяу турындагы бүлегендә тасвирлый. Буягыч катионы үзе — метилен зәңгәренең химиясе белешмәсендә җентекләп тасвирланган кечкенә яссы фенотиазин ионы; хлорид каршы ионы төс бирүдә катнашмый.

Стандарт уку протоколы махсус рәвештә гади төзелгән: юка мазок ясарга, һавада киптерергә, җылытып беркетергә, якынча 1% лы метилен зәңгәренең судагы эремәсе белән бер минут чамасына капларга, су белән сак кына чайкарга, сеңдергеч материал белән киптерергә һәм майлы иммерсия кулланып тикшерергә. LibreTexts уку протоколында нәкъ шушы 1% лы эремә һәм бер минутлык вакыт күрсәтелгән, шул ук вакытта кайбер лабораторияләрнең вакытны озайтуы да искәртелә. Беркеткеч тә, төссезләндергеч тә, икенче буягыч та юк. Моның асылы нәкъ шунда. Бер генә буягыч кулланылып, ул сайлап алынмаганда, буягычны бәйләгән һәр күзәнәк бер үк төскә керә.

E. coli өчен көтелгән күренеш — аерым, парлап яки кечкенә төркемнәрдә урнашкан зәңгәр таякчыклар (бациллалар). Зәңгәр төс буягычтан килә. Таякчык формасы организмга хас. Әмма бу икесе бергә организмны идентификацияләми, чөнки күп төрләр таякчык формасында була һәм күп кенә таякчыклар гади буяуда зәңгәр төскә керә. ATCC үзенең микробиологик культуралар белешмәсендә нәтиҗәнең морфология белән генә чикләнүен ачык күрсәтә. Дөрес хисапта: «Зәңгәр бациллалар күзәтелде», — дип языла. Форма һәм урнашудан тыш теләсә нинди нәтиҗә өчен өстәмә дәлил кирәк.

Грам буенча буяу: дүрт реагент, бер үз-үзен тотыш сынавы

Грам буенча буяу — дифференциаль буяу. Барлык күзәнәкләр бер үк эзлеклелектә эшкәртелә, һәм кайсы күзәнәкләрнең беренче буягычны саклап калуы, кайсыларының аны югалтуы күзәтелә. Америка микробиология җәмгыятенең Грам буенча буяу протоколлары стандарт дүрт этаплы тәртипне билгели: кристаллвиолет (төп буягыч), Грам йоды (беркеткеч), спирт яки ацетонлы спирт (төссезләндергеч), аннары сафранин (өстәмә буягыч).

Стандарт уку моделе бу аерылуны тышча төзелеше аша аңлата. Грам-уңай күзәнәкләрнең калын пептидогликан стенасы спирт белән юганда сусызлана һәм кристаллвиолет-йод комплексын саклап кала. Грам-тискәре күзәнәкләрнең юка пептидогликан катламы һәм липидларга бай тышкы мембранасы бар. Төссезләндергеч бу мембрананы боза, шуңа күрә комплекс юылып чыга, ә күзәнәкләр аннары сафранинны сеңдерә. NCBI Bookshelf сәхифәсендәге Грам буенча буяуга күзәтүдә күзәнәк стенасына нигезләнгән шушы аңлатма бирелә. Белгечләр тулы физик-химик механизмның стена калынлыгына гына кайтып калмавын искәртә. Әмма лабораториядә нәтиҗәне аңлату өчен үз-үзен тотыш кагыйдәсе гамәлдә кала: шәмәхә төс — буягыч сакланып калган, алсу төс — башта югалган, аннары өстәмә буягыч белән буялган дигән сүз.

Иллюстратив панельләр. Болар — камера белән төшерелгән микрофотографияләр түгел, ә ысулларны чагыштыру өчен стильләштерелгән рәсемнәр. Буяу логикасын аңлату өчен төсләр гадиләштерелгән: гади буяуда бер төс, Грам буенча төссезләндерүдән соң ике төс.

Метилен зәңгәрен Грам буенча буяуда кулланып буламы

Бу сорауны ике төрле аңларга мөмкин, һәм аларга төрле җавап кирәк.

Беренче мәгънәсе: метилен зәңгәре белән бер тапкыр каплау Грам буенча буяуның бөтен эзлеклелеген алыштыра аламы? Юк. Йод, төссезләндергеч һәм өстәмә буягыч булмаса, дифференциаль этап та юк, димәк, Грам категориясе тикшерелми. Метилен зәңгәрен генә кулланганнан соң күренгән зәңгәр кыр — гади буяу нәтиҗәсе, хәтта шешә Грам реагентлары янында торса да. Аны Грам буенча буяу нәтиҗәсе итеп теркәмәгез.

Икенче мәгънәсе: метилен зәңгәре 4 нче этапта өстәмә буягыч буларак сафранинны алыштыра аламы? Функциональ яктан ул төссезләнгән күзәнәкләрне буяп ала, һәм дәреслектәге күнегү мондый алыштырудан соң грам-уңай күзәнәкләрнең шәмәхә, грам-тискәре күзәнәкләрнең зәңгәр булуын фаразлый. Моның логикасы дөрес: тиешенчә төссезләндерелгән грам-тискәре күзәнәкләр төссез диярлек була һәм башка катионлы буягычны сеңдерә ала. Әмма бу стандарт протокол түгел. ASM протоколларында сафранин күрсәтелгән; кайбер вариантларда нигезле фуксин кебек танылган альтернативалар бар, ләкин метилен зәңгәре түгел. Практик кыенлык та бар: зәңгәр төсне шәмәхәдән аеру алсуны шәмәхәдән аеруга караганда авыррак, бигрәк тә башлап өйрәнүчеләр өчен һәм микроскоп лампаларының яктылыгы зәгыйфьләнгәндә. Уку эшләрендә һәм нәтиҗәсе әһәмиятле булган һәр очракта протоколыгызда аталган өстәмә буягычны, гадәттә сафранинны, кулланыгыз. Метилен зәңгәрен өстәмә буягыч итеп куллануны стандартка тиң ысул түгел, ә күрсәтмә вариант дип карагыз.

Метилен зәңгәренең бер буягычлы башка вариантлар белән ничек чагыштырылуы турындагы бәйле сорау бактерияләрне гади буяу ысулларын чагыштыруда карала.

E. coli күзәнәкләрен метилен зәңгәре белән буяу нәрсәне раслый һәм нәрсәне расламый

E. coli — грам-тискәре таякчык, әмма бу җөмлә берничә ысулдан алынган фактларны берләштерә: морфология — микроскопиядән, Грам реакциясе — Грам буенча буяудан, ә төрне идентификацияләү — культура үстерү һәм биохимик яки молекуляр тикшерүләрдән. Метилен зәңгәре белән буялган мазок беренче өлешне генә бирә. Ул буялган үрнәктә таякчык формасындагы күзәнәкләрнең булуын һәм аларның ничек урнашуын күрсәтә. Ул Грам реакциясен билгеләми, чөнки төссезләндерү сынавы үткәрелмәгән. Ул төрне идентификацияләми, чөнки мондый аеру сәләтендә күп төрләрнең таякчыклары бер-берсенә охшап күренә.

Хисапларда кабатлана торган хата нәкъ шунда килеп чыга. Язучы алдан белгән мәгълүматын («бу культура E. coli булырга тиеш, ә E. coli грам-тискәре») күзәтү юлына күчерә. Нәтиҗәдә препарат чынлыкта фараз ителгән нәрсәне раслаган кебек күренә. Төгәлрәк хисап мәгълүмат катламнарын аерып күрсәтә: «Метилен зәңгәре белән гади буяу: зәңгәр бациллалар күзәтелде; морфология генә, Грам категориясе тикшерелмәде». Аннары, Грам буенча буяу контроль үрнәкләр белән дөрес үткәрелгән булса: «Грам буенча буяу: алсу таякчыклар, грам-тискәре нәтиҗәгә туры килә». Төрнең кемлеге соңрак, төснең үзеннән түгел, ә идентификацияләү барышыннан ачыклана.

Нәтиҗәне аңлату өчен практик кулланма

Лабораториядә шушы карар кагыйдәсен кулланыгыз. Әгәр барлык күзәнәкләр бер төстә булса һәм протоколда төссезләндергечсез бер буягыч кына кулланылса, сез гади буяу үткәргәнсез. Форманы, якынча зурлыкны һәм урнашуны теркәгез. Шуның белән чикләнегез. Әгәр протоколда кристаллвиолет, йод, төссезләндергеч һәм өстәмә буягыч кулланылып, билгеле уңай һәм тискәре контроль үрнәкләр тикшерелгән булса, сез Грам буенча буяу үткәргәнсез. Төсне һәм морфологияне бергә теркәгез: чылбыр булып урнашкан шәмәхә кокклар, алсу таякчыклар һәм башкалар.

Буталуларның күбесе өч хатага бәйле. Беренчесе — зәңгәр таякчыкларны E. coli булуын раслау дип артык киң аңлату. Икенчесе — метилен зәңгәре белән буялган препаратны дәфтәрдә «Грам буенча буяу» башисеме астында теркәү: соңрак укучылар моны ялгыш аңлаячак. Өченчесе — өстәмә буягычларны уйламыйча алыштыру, аннары төрле лабораторияләрдәге төсләрне төс җыелмалары бер үк булгандай чагыштыру. Һәр хатаның төзәтү юлы бер үк: чынлыкта башкарылган ысулны атагыз һәм шул ысул тикшергән нәрсәне генә раслагыз.

Гади буяу нәкъ аз нәрсә турында нәтиҗә ясавы белән әһәмиятле. Ул тиз, кечкенә тайпылышларга чыдам һәм сорау морфология турында булганда җитәрлек: анда берәр нәрсә бармы һәм ул нинди формада? Сорау классификация турында булса, дифференциаль сынау үткәрегез. Зәңгәр препарат күзәнәкләрнең нинди күренештә булуын әйтә. Шәмәхә яки алсу препарат аларның стеналарының үзен ничек тотуын әйтә. Әмма бер генә препарат та, үзе генә, төрне билгеләми.