Метилен зәңгәре һәм аутофагия: AMPK, mTOR һәм нейроннар белән тәҗрибәләр

Күз алдына китерегез: сез күзәнәкләр белән тәҗрибә үткәрәсез, метилен зәңгәре өстисез һәм блотта LC3-II дип аталган аксым полосасының караңгырак булуын күрәсез. Матдә «аутофагияне көчәйтә» дип игълан итеп, алга күчү кызыктыргыч тоела. Ләкин мондый нәтиҗә ясарга иртәрәк. LC3-II полосасының караңгырак булуы күзәнәкнең чистарту өчен күбрәк везикулалар төзүен дә, утильләштерү этабы тоткарланганга везикулаларның туплануын да аңлатырга мөмкин. Бу ике аңлатма капма-каршы юнәлешләргә ишарә итә, һәм метилен зәңгәренең нейроннарга тәэсире турындагы әдәбиятта ике төр дәлилнең дә мисаллары бар. Бу мәкаләдә һәр анализда чынлыкта нәрсә үлчәнгәне берәм-берәм карала.

Биредә өйрәнелгән форма — макроаутофагия — күзәнәк эчендәге материалларны күләмле рәвештә эшкәртеп, яңадан файдалану процессы. Фагофор дип аталган мембрана капчыгы тузган аксымнар һәм органеллалар тирәли үсә, ябылып аутофагосома хасил итә, лизосома белән кушыла; аның эчтәлеге таркала һәм яңадан файдалану өчен чыгарыла. Нейроннар бу даими процесска бәйле, чөнки алар бүленми һәм бүленү аша зарарланган өлешләрнең чагыштырмача күләмен киметә алмый. Эшкәртү тукталганда, калдыклар туплана. Ул эшләгәндә, күзәнәк стресс шартларында төзелеш материалларын кире ала.

Гиппокамп күзәнәкләре белән бер тәҗрибә нәрсә күрсәтте

Индукцияне өйрәнгән төп тикшеренүдә тычкан гиппокампының HT22 күзәнәкләре кулланылган. Аларны 24 сәгать буе сүленсез тотып стресска дучар иткәннәр: мондый шартта үсеш факторлары һәм трофик сигналлар юкка чыга, апоптоз да, аутофагия дә башлана. Тикшеренүчеләр хәбәр иткәнчә, метилен зәңгәре күзәнәкләрнең үлемен дозага бәйле рәвештә киметкән, һәм бу саклау эффекты макроаутофагия билгеләре белән бергә күзәтелгән.

Маркерларның үзгәрүе төгәл тасвирланган. Метилен зәңгәренең концентрациясе якынча 20 nM булудан башлап, таралып урнашкан LC3B буялуы төш тирәсендәге ноктасыман тупланмаларга күчкән; LC3-I һәм LC3-II өчен иң көчле җавап якынча 1 μM тирәсендә булган. LC3B-I дә, LC3B-II дә дозага һәм вакытка бәйле рәвештә арткан. Иң мөһиме — төркем статик LC3 блоты белән генә чикләнмәгән. Алар лизосомалар аша чистартуны блоклаучы 10 μM хлорохин өстәгәннәр һәм метилен зәңгәре белән эшкәртелгән күзәнәкләрдә LC3-II дәрәҗәсенең югарырак, ә p62 дәрәҗәсенең тотрыклы булуын ачыклаганнар. Бу күренеш гади туплануны түгел, ә лизосомаларга бәйле әйләнешне хуплый. Алар шулай ук хлорохинның апоптозга каршы эффектны өлешчә кире кайтаруын күрсәткәннәр; бу әлеге модельдә саклауны аутофагия һәм лизосома юлы белән бәйли.

Сигналлашу нәтиҗәсе — иң еш дөрес булмаганча китерелә торган өлеш. Фосфорланган AMPK һәм аның түбәнге агымдагы мишене — фосфорланган ACC аша бәяләнгән AMPK сигналлашуы 12 һәм 24 сәгатьтә дозага бәйле рәвештә арткан. Соңгы 4 сәгатьтә 20 μM концентрациядә кулланылган AMPK ингибиторы Compound C ACC фосфорлануын да, LC3 активлашуын да киметкән. Ә фосфорланган mTOR өчен ачыкланырлык басылу күзәтелмәгән. Димәк, стресстагы гиппокамп күзәнәкләрендә нәтиҗә AMPK белән бәйле, күрәсең, mTOR дан бәйсез юл аша индукция булган. Шул ук күренеш тере тычканнарда да күзәтелгән: метилен зәңгәре белән эшкәртү баш мие кабыгында һәм гиппокампта макроаутофагия маркерларын арттырган.

Индукция — тәмамланган агым түгел

Биредә төшенчәләр арасындагы аерма аеруча мөһим. Индукция процессның башлангыч механизмнары күбрәк аутофагосомалар ясауны аңлата. Агым исә эчтәлекнең бөтен юлны үтүен аңлата: аерып алу, өлгерү, лизосома белән кушылу, таркалу һәм яңадан файдалану. Агым тесты юлның калган өлешен раслаганчы, LC3-II дәрәҗәсенең һәр артуы индукция турындагы дәгъва гына булып кала.

Стандарт агым тестында LC3-II дәрәҗәсе лизосомаларны кыска вакытка блоклап һәм блокламыйча үлчәнә; моның өчен, мәсәлән, бафиломицин A1 яки хлорохин кулланыла. Әгәр эшкәртү чыннан да ясалуны тизләтә икән, таркалуны блоклау LC3-II дәрәҗәсен тагын да арттырырга тиеш. Тандемлы mCherry-GFP-LC3 репортеры икенче яктан бәяләргә мөмкинлек бирә: лизосома белән кушылганчы структуралар сары булып ялтырый, ә кислота GFP сигналын сүндергәннән соң кызыл гына булып күренә. Шуңа күрә кызыл гына булып күренгән ноктасыман тупланмаларның күбәюе кислоталы аутолизосомаларга күчүне хуплый. p62 аксымы дәрәҗәсенең кимүе эчтәлек әйләнешен өстәмә рәвештә раслый ала, ләкин p62 транскрипциясе үзе дә стресска җавап бирә, шуңа аны мРНК дәрәҗәсендә тикшерергә кирәк.

Түбәндәге тикшерү исемлеге бу әдәбиятта кулланылган һәр анализның нәрсә үлчәвен һәм үзе генә нәрсәне раслый алмавын күрсәтә. Укучылар аны киләчәктәге теләсә нинди макроаутофагия турындагы дәгъваны, шул исәптән бу маркерларга таянган ач тору һәм озын гомер турындагы дәлилләрне бәяләгәндә дә куллана ала.

Таблица сакланырга ярдәм иткән бер сүз куллану хатасына игътибар итегез. Фосфорланган ACC — ферментатив активлыгы басылган форма. Аның артуы ACC активлашуын түгел, ә AMPK тәэсире нәтиҗәсен күрсәтә.

«Макроаутофагияне ингибицияләү нейропротекцияне юкка чыгарды» дигән җөмлә дә шундый ук төгәллек таләп итә. HT22 моделендә бу аутофагия һәм лизосома юлына комачаулау сүленсез шартларда метилен зәңгәре биргән исән калу өстенлеген бетергәнен аңлата. Бу әлеге культурада аутофагиянең кирәкле булуын яки үз өлешен кертүен хуплый. Ләкин ул аутофагиянең матдәгә хас бердәнбер саклау механизмы булуын расламый, хлорохинның бары тик аутофагия аша гына тәэсир итүен исбатламый; сәбәп-нәтиҗә турындагы дәгъваны ныгыту өчен ATG5, ATG7 яки ULK1 эшчәнлеген генетик юл белән үзгәртү кирәк булыр иде.

Бер үк механизмга алып керүче ике юл

Гадиләштерелгән схема аңларга ярдәм итә. Энергетик стресс AMPK активлыгын арттыра, AMPK ULK1 комплексын активлаштыра, һәм аутофагия башлана. Үсеш факторлары һәм туклыклы матдәләр mTORC1 активлыгын арттыра, mTORC1 ULK1 не ингибицияли, һәм аутофагия башланмый. ULK1 дән соңгы этапларда Beclin-1 һәм VPS34 комплексы фагофорның барлыкка килүен башлый, LC3-I липидлашып LC3-II гә әйләнә, аутофагосома ябыла, лизосома белән кушыла, эчтәлек таркала һәм p62 әйләнеше бара.

Схема метилен зәңгәренә кагылышлы һәр нәтиҗәне бу картага урнаштыра: гиппокамп нәтиҗәсе AMPK тармагы янында, прекурсор күзәнәкләр нәтиҗәсе mTOR тармагы янында.

Бу караш Xie ның икенче тикшеренүе белән күренеп торган каршылыкны аңлата. Үрчүче күсе нейраль прекурсор күзәнәкләрендә аерым тәҗрибә 5 μM метилен зәңгәренең пролиферацияне басуын һәм тынычлык халәтенә күчүне көчәйтүен ачыклаган: Ki67 уңай күзәнәкләр 1 һәм 3 нче көннәрдә кимегән, ә нейрон юнәлеше инде билгеләнгән дифференциация сакланган. Анда механизм mTOR сигналлашуы басылуы аша эшләгән: гомуми mTOR һәм фосфорланган mTOR кимегән, p70S6K һәм 4EBP1 экспрессиясе түбәнәйгән, шулай ук E1, B1, D1 һәм D2 циклиннарының экспрессиясе кимегән. Өстенлекле фенотип прекурсор күзәнәкләрнең тынычлык халәте булган; авторлар аны стресстагы гиппокамп күзәнәкләрен коткару белән түгел, ә күзәнәкләрнең картаюын кичектерү белән бәйләгәннәр.

Бу ике мәкалә арасында каршылык юк. AMPK һәм mTOR — үзгәрмәс ачкычлар түгел, ә шартларга сизгер интеграторлар. Стресстагы нейронга охшаш күзәнәк mTOR ның үлчәнерлек басылуыннан башка AMPK ны эшкә җигә ала, ә митоген тәэсирендә үсә торган прекурсор шул ук матдәгә mTOR га бәйле үсеш механизмын әкренәйтеп җавап бирә ала. Күзәнәк төре, стресс шартлары, концентрация һәм вакыт ноктасы кайсы тармакның өстенлек итәчәген билгели. Метилен зәңгәренең митохондрия энергетикасына һәм оксидлашу-кайтарылу процессларына тәэсирләре дә шул ук күренешнең бер өлеше булырга тиеш: нейропротекция механизмнарына күзәтүдә тасвирланганча, матдә альтернатив электрон ташучы булып эшли, антиоксидант һәм апоптозга каршы сигналлашуны җәлеп итә, MAO һәм NOS ны ингибицияли, биогенез һәм аутофагия аша митохондрияләрнең яңаруы белән бәйләнә. Аутофагия — күпьяклы тәэсирләр профиленең бер тармагы гына, бөтен күренеш түгел.

Тәҗрибәләр нәрсәне күрсәтми

Сүленнән мәхрүм итү культура савытында трофик һәм метаболик стрессны модельләштерә. Ул бөтен организмның ач торуын модельләштерми: глюкоза, аминокислоталар һәм тозлар төп туклыклы мохиттә кала, һәм туклану тәртибе дигән нәрсә юк. Культурадагы 20 nM дән 5 μM гә кадәрге концентрацияләрне арифметик юл белән кеше дозаларына әйләндереп булмый, чөнки сеңү, аксымнарга бәйләнү, оксидлашу-кайтарылу халәте, метаболизм, тукымаларда туплану һәм тәэсир вакыты — барысы да аерыла.

Пациентларда метилен зәңгәре китереп чыгарган аутофагик агымны күрсәтү өчен бер генә кеше катнашындагы сынау да планлаштырылмаган. Механизмнарга кагылышлы дәлилләр күзәнәкләрдәге, ex vivo һәм хайваннардагы эшләр белән чикләнә, ә күзәтүләр нәтиҗәләрне клиникага күчерү дәлилләрен һаман да башлангыч дип тасвирлый. Шуңа күрә бу тикшеренүләр метилен зәңгәренең ач торуны кабатлавын, аутофагия аша кеше гомерен озайтуын яки кеше миендә аутофагик агымны тәмамлавын күрсәтми. Ач торуны охшату һәм озын гомер турындагы дәгъвалар үз клиник дәлилләрен таләп итә; башка күрсәтмәләр буенча кешеләрдә үткәрелгән метилен зәңгәре сынаулары бәйләнеш булу аркасында гына аутофагия сынауларына әйләнми. Туклыклы матдәләр җитмәү стрессы һәм озын гомер модельләре турындагы тикшеренүләрне шушы чикне истә тотып укырга кирәк.

Киләсе мәкаләне укыганда, тикшерү исемлеген тәртип буенча кулланыгыз. Башта кайсы тармак үзгәргәнен сорагыз: AMPK, mTOR яки берсе дә түгелме. Аннары LC3 нәтиҗәсе агым тесты белән бергә бирелгәнме, әллә аерым гынамы икәнен тикшерегез. Шуннан соң юлны блоклау файдалы эффектны бетергәнме һәм моның нинди ысул белән эшләнгәнен карагыз. Өч сорауга да җавап биргән тикшеренү механизм турында көчле дәгъвага нигез бирә. Беренчесенә генә җавап биргәне исә процесс башланырга рөхсәт бирүче сигналны гына күрсәткән, ә юлның калган өлеше һаман өйрәнелмәгән булып кала.