Simpleng paglamlam ng methylene blue kumpara sa paglamlam ng Gram: ano ang mapatutunayan ng bawat paraan

Naghahanda ang isang estudyante ng pahid mula sa kulturang may tatak na E. coli, binabaha ito ng methylene blue sa loob ng isang minuto, binabanlawan, at tinitingnan sa lenteng pang-oil immersion. Puno ng mga asul na selulang hugis-tungkod ang larangang nakikita. Nakasaad sa ulat ng laboratoryo: "Mga Gram-negatibong selulang hugis-tungkod na natukoy bilang E. coli." Tama ang obserbasyon. Ngunit hindi sapat ang ebidensya mula sa slide upang suportahan ang konklusyon.

Ang pagkakamali ay nasa konsepto, hindi sa pamamaraan. Itinuring ng estudyante ang simpleng paglamlam na para bang isa itong pagsusuring panlahat ng pagkakaiba. Magkaibang tanong ang sinasagot ng simpleng paglamlam at paglamlam ng Gram dahil nakabatay ang mga ito sa magkaibang konsepto ng paglamlam. Ang isa ay nagtatanong: anong hugis ang naroon. Ang isa naman ay nagtatanong: paano tumutugon ang pader ng selula kapag sinusubok. Kapag napaghalo ang dalawa, maaaring humantong sa ulat na walang sapat na batayan kahit tama ang pagkakalamlam sa slide.

Pinananatiling magkahiwalay ng paghahambing na ito ang dalawang paraan, ipinapakita kung anong pahayag ang sinusuportahan ng bawat resulta, at sinasagot ang dalawang pinakamadalas na tanong ng mga estudyante: maaari bang gamitin ang methylene blue sa paglamlam ng Gram, at ano talaga ang ipinapakita ng paglamlam ng methylene blue sa E. coli.

Ang maikling sagot

Sa simpleng paglamlam ng methylene blue, nagiging iisang asul ang lahat ng selulang kayang tumanggap ng tina, kaya ipinapakita nito ang morpolohiya (hugis-tungkod, hugis-bola, espiral) at pagkakaayos (isa-isa, magkapares, magkakadena), ngunit wala itong ipinapakita tungkol sa kategorya ng Gram. Nagdaragdag ang paglamlam ng Gram ng yodo, hakbang sa pag-aalis ng kulay, at kontra-panglamlam, kaya naihihiwalay nito ang bakterya sa Gram-positibo (lila) at Gram-negatibo (kulay-rosas o pula) batay sa kung paano pinananatili ng kanilang mga balot ang tina. Ang mga asul na selulang hugis-tungkod matapos gamitan ng methylene blue ay nangangahulugang "may mga selulang hugis-tungkod." Ang mga kulay-rosas na selulang hugis-tungkod matapos ang buong pagkakasunod-sunod ng paglamlam ng Gram ay nangangahulugang "may mga Gram-negatibong selulang hugis-tungkod." Mas matibay ang ikalawang pahayag dahil nagsagawa ang pamamaraan ng karagdagang pagsusuri.

Para sa mas malawak na pangkat ng mga paraan ng paglamlam ng bakterya na gumagamit ng iisang tina, na kinabibilangan ng artikulong ito, tingnan ang atlas ng paglamlam para sa mikroskopiya.

Simpleng paglamlam: isang tina, isang tanong

Ang methylene blue ay isang basikong (katyonikong) tina. May positibong karga ang ion nitong may kulay at kumakapit ito sa mga istrukturang may negatibong karga sa selula, kabilang ang mga nucleic acid at mga asidikong pangkat sa ibabaw, kaya lumilitaw na asul ang mga selula sa maputlang likuran. Inilalarawan ng OpenStax ang prinsipyong ito ng positibong paglamlam sa kabanata nito tungkol sa paglamlam. Ang katyon ng tina mismo ay ang maliit at patag na ion ng phenothiazine na detalyadong inilalarawan sa sanggunian sa kimika ng methylene blue; hindi ang katapat na ion ng chloride ang nagbibigay ng kulay.

Sadyang payak ang karaniwang protokol sa pagtuturo: gumawa ng manipis na pahid, patuyuin sa hangin, ikapit sa slide gamit ang init, bahain ng humigit-kumulang 1% na methylene blue na nakatunaw sa tubig sa loob ng halos isang minuto, banlawan nang marahan gamit ang tubig, patuyuin sa pamamagitan ng marahang pagdampi, at suriin gamit ang oil immersion. Eksaktong ganitong 1% at isang-minutong paraan ang ibinibigay ng isang protokol sa pagtuturo ng LibreTexts, habang binabanggit na pinahahaba ng ilang laboratoryo ang oras. Walang pangkapit ng tina, walang pang-alis ng kulay, walang ikalawang tina. Ang kawalang iyon ang mahalagang punto. Dahil iisa lamang ang tina at walang piling pag-aalis nito, nauuwi sa iisang kulay ang bawat selulang kumakapit sa tina.

Sa E. coli, ang inaasahang makikita ay mga asul na selulang hugis-tungkod (bacilli), na magkakahiwalay, magkapares, o nasa maliliit na pangkat. Ang asul ay mula sa tina. Ang hugis-tungkod ay mula sa organismo. Ngunit hindi natutukoy ng kombinasyong ito ang organismo, dahil maraming species ang hugis-tungkod at maraming selulang hugis-tungkod ang nagiging asul sa simpleng paglamlam. Malinaw na inilalahad ng ATCC ang hangganang ito—morpolohiya lamang—sa gabay nito sa pagkultura ng mga mikroorganismo. Ganito ang tamang ulat: "may naobserbahang asul na bacilli." Anumang pahayag na lampas sa hugis at pagkakaayos ay nangangailangan ng higit pang ebidensya.

Paglamlam ng Gram: apat na reahente, isang pagsusuri sa tugon

Ang paglamlam ng Gram ay isang paglamlam na nagpapakita ng pagkakaiba. Isinasailalim nito ang lahat ng selula sa iisang pagkakasunod-sunod ng mga hakbang at tinitingnan kung aling mga selula ang nagpapanatili ng unang tina at alin ang nawawalan nito. Itinatakda ng mga protokol sa paglamlam ng Gram ng American Society for Microbiology ang karaniwang pagkakasunod-sunod ng apat na hakbang: crystal violet (pangunahing panglamlam), Gram iodine (pangkapit ng tina), alkohol o acetone-alcohol (pang-alis ng kulay), at pagkatapos ay safranin (kontra-panglamlam).

Ipinapaliwanag ng karaniwang modelo sa pagtuturo ang paghihiwalay batay sa istruktura ng balot ng selula. Ang mga Gram-positibong selula ay may makapal na pader ng peptidoglycan na nawawalan ng tubig at nagpapanatili ng kompleks ng crystal violet at yodo habang hinuhugasan ng alkohol. Ang mga Gram-negatibong selula ay may manipis na sapin ng peptidoglycan at panlabas na lamad na mayaman sa lipid na sinisira ng pang-alis ng kulay, kaya nahuhugasan ang kompleks at pagkatapos ay tumatanggap ng safranin ang mga selula. Ibinibigay ng pagsusuri sa paglamlam ng Gram sa NCBI Bookshelf ang paliwanag na ito tungkol sa pader ng selula. Idinaragdag ng mga espesyalista na mas masalimuot ang buong pisikokimika kaysa sa kapal lamang ng pader, ngunit para sa interpretasyon sa laboratoryo, nananatiling wasto ang tuntunin sa tugon: ang lila ay nangangahulugang napanatili ang tina; ang kulay-rosas ay nangangahulugang nawala ito at pagkatapos ay nalagyan ng kontra-panglamlam.

Mga panel na naglalarawan. Mga estilisadong guhit para sa paghahambing ng mga paraan, hindi mga larawang kuha gamit ang kamera sa mikroskopyo. Pinasimple ang mga kulay upang ituro ang lohika: isang kulay sa simpleng paglamlam, dalawang kulay matapos ang pag-aalis ng kulay sa paglamlam ng Gram.

Maaari bang gamitin ang methylene blue sa paglamlam ng Gram

May dalawang pakahulugan ang tanong na ito, at nangangailangan ang mga iyon ng magkaibang sagot.

Unang pakahulugan: maaari bang palitan ng isang pagbaha ng methylene blue ang buong pagkakasunod-sunod ng paglamlam ng Gram. Hindi. Kung walang yodo, pang-alis ng kulay, at kontra-panglamlam, walang hakbang na sumusuri sa pagkakaiba, kaya walang kategorya ng Gram na nasusuri. Ang asul na larangan matapos gamitan lamang ng methylene blue ay resulta ng simpleng paglamlam kahit nakatabi ang bote sa mga reahente para sa Gram. Huwag itong itala bilang resulta ng Gram.

Ikalawang pakahulugan: maaari bang palitan ng methylene blue ang safranin bilang kontra-panglamlam sa hakbang 4. Sa gampanin nito, kaya nitong bigyan ng kulay ang mga selulang naalisan ng kulay, at sa isang pagsasanay sa aklat-aralin, inaasahang magiging lila ang mga Gram-positibong selula at asul ang mga Gram-negatibong selula matapos ang ganitong pagpapalit. Tama ang lohika dahil halos walang kulay ang mga Gram-negatibong selula na wastong naalisan ng kulay at tatanggap ang mga ito ng ibang katyonikong tina. Ngunit hindi ito ang karaniwang protokol. Safranin ang itinatakda ng mga protokol ng ASM, kasama ang mga kinikilalang alternatibo gaya ng basic fuchsin sa ilang bersyon, hindi methylene blue. May praktikal ding kapalit: mas mahirap makilala ang asul laban sa lila kaysa sa kulay-rosas laban sa lila, lalo na para sa mga baguhan at lalo na kapag mahina na ang mga ilaw ng mikroskopyo. Para sa mga gawain sa klase at anumang mahalagang resulta, gamitin ang kontra-panglamlam na nakasaad sa iyong protokol, na karaniwang safranin, at ituring ang paggamit ng methylene blue bilang kontra-panglamlam na isang bersyon para sa demonstrasyon sa halip na katumbas na pamantayan.

Ang kaugnay na tanong kung paano maihahambing ang methylene blue sa ibang pagpipiliang gumagamit ng iisang tina ay tinatalakay sa isang paghahambing ng mga simpleng paglamlam ng bakterya.

Ano ang napapatunayan ng paglamlam ng methylene blue sa E. coli, at ano ang hindi nito napapatunayan

Ang E. coli ay isang Gram-negatibong selulang hugis-tungkod, ngunit pinagsasama ng pangungusap na iyon ang mga katotohanan mula sa ilang paraan: morpolohiya mula sa mikroskopiya, reaksiyon sa Gram mula sa paglamlam ng Gram, at pagkakakilanlan mula sa pagkultura kasama ng biyokemikal o molekular na pagsusuri. Unang bahagi lamang ang naiaambag ng pahid na nilamlam ng methylene blue. Pinatutunayan nitong may mga selulang hugis-tungkod sa nilamlamang sample at ipinapakita kung paano sila nakaayos. Hindi nito napapatunayan ang reaksiyon sa Gram, dahil walang pagsubok sa pag-aalis ng kulay na isinagawa. Hindi nito natutukoy ang species, dahil magkakamukha ang mga selulang hugis-tungkod ng maraming species sa antas na ito ng resolusyon.

Dito nagkakamali ang mga ulat sa paraang mahuhulaan. Isinasama ng sumulat ang dati nang kaalaman ("ang kulturang ito ay inaasahang E. coli, at Gram-negatibo ang E. coli") sa linya ng obserbasyon, kaya tila kinukumpirma ng slide ang talagang ipinagpalagay lamang. Mas malinaw na pinaghihiwalay ng isang maayos na ulat ang mga antas: "Simpleng paglamlam ng methylene blue: may naobserbahang asul na bacilli; morpolohiya lamang, walang kategorya ng Gram na sinuri." Pagkatapos, kung wastong isinagawa ang paglamlam ng Gram gamit ang mga kontrol: "Paglamlam ng Gram: mga kulay-rosas na selulang hugis-tungkod, na tugma sa Gram-negatibo." Sa susunod na yugto pa manggagaling ang pagkakakilanlan ng species, mula sa proseso ng pagtukoy, hindi sa kulay lamang.

Isang praktikal na gabay sa interpretasyon

Gamitin ang tuntuning ito sa pagpapasya habang nagtatrabaho sa laboratoryo. Kung iisang kulay ang lahat ng selula at gumamit ang protokol ng isang tina na walang pang-alis ng kulay, simpleng paglamlam ang isinagawa mo. Iulat ang hugis, tinatayang laki, at pagkakaayos. Hanggang doon lamang. Kung gumamit ang protokol ng crystal violet, yodo, pang-alis ng kulay, at kontra-panglamlam kasama ng mga kilalang positibo at negatibong kontrol, paglamlam ng Gram ang isinagawa mo. Iulat ang kulay kasama ng morpolohiya: mga lilang cocci na magkakadena, mga kulay-rosas na selulang hugis-tungkod, at iba pa.

Tatlong pagkakamali ang sanhi ng karamihan sa kalituhan. Una, ang pagbibigay ng labis na kahulugan sa mga asul na selulang hugis-tungkod bilang kumpirmasyon ng E. coli. Ikalawa, ang pagtatala ng slide na nilamlam ng methylene blue sa ilalim ng pamagat na "Paglamlam ng Gram" sa kuwaderno, na maling mauunawaan ng mga susunod na mambabasa. Ikatlo, ang basta-bastang pagpapalit ng mga kontra-panglamlam at pagkatapos ay paghahambing ng mga kulay sa iba't ibang laboratoryo na para bang magkatugma ang mga kulay na ginamit. Iisa ang solusyon sa bawat pagkakamali: pangalanan ang paraang talagang isinagawa, at ipahayag lamang kung ano ang sinusuri ng paraang iyon.

Mahalaga ang simpleng paglamlam dahil mismo limitado ang pinatutunayan nito. Mabilis ito, hindi madaling maapektuhan ng maliliit na pagkakamali, at sapat kapag morpolohiya ang tanong: mayroon ba roon, at ano ang hugis nito. Kapag pag-uuri ang tanong, isagawa ang pagsusuring nagpapakita ng pagkakaiba. Sinasabi sa iyo ng asul na slide kung ano ang hitsura ng mga selula. Sinasabi sa iyo ng lila o kulay-rosas na slide kung paano tumutugon ang kanilang mga pader. Wala sa dalawang slide, nang mag-isa, ang makapagsasabi sa iyo ng species.