Paliwanag sa alkalino at polikromong mga pangkulay na methylene blue ni Loeffler

Maaaring magkakatabi ang tatlong bote sa isang mesa para sa pagkukulay, na bawat isa ay may etiketa ng isang uri ng methylene blue. Ang isa ay may nakasulat na methylene blue sa tubig na 1%. Ang isa ay alkalinong methylene blue ni Loeffler. Ang isa ay polikromong methylene blue. Kinukuha ng isang abalang manggagawa ang alinmang pinakamalapit. Pagkatapos, masyadong maputla ang kulay ng pahid, o masyadong pantay ang pagkakaasul nito, o nagkakaroon ito ng hindi inaasahang mga kulay lila, at ang sampol ang sinisisi sa resulta.

Problema ito sa pormulasyon, hindi sa sampol. May magkakaugnay na tina ang tatlong solusyon ngunit kumakatawan ang mga ito sa magkakaibang konsepto ng pagkukulay. Ang isa ay isang karaniwang kationikong tina sa halos neutral na pH. Ang isa ay ang parehong tina na pinatindi ng alkali. Ang isa ay hindi na iisang tina, kundi isang halo na sadyang pinadaan sa oksidasyon. Kapag mali ang ginamit, nagbabago ang prinsipyo ng pagkukulay habang ginagawa mo ito.

Ang maikling sagot

Ang karaniwang methylene blue sa tubig ang batayan: humigit-kumulang 1% na tina sa tubig, isang simpleng kationikong pangkulay para sa morpolohiya ng bakterya at pangkalahatang mikroskopiya. Sa alkalinong methylene blue ni Loeffler, nagdadagdag ng kaunti at sinukat na dami ng malabnaw na alkali sa isang nakaimbak na solusyong may alkohol na nilabnawan sa tubig. Pinapataas nito ang pH at mas pinatitindi ang pagkapit ng kationikong tina sa mga asidikong istruktura ng bakterya. Ang polikromong methylene blue ay methylene blue na sadyang pinahinog sa pamamagitan ng oksidasyon sa alkali, kaya ang bote ay may halong mga homologong natanggalan ng methyl (azure A, azure B, azure C), thionin, at methylene violet kasama ng natitirang methylene blue. Kinukulayan ng halong iyon ang iba't ibang istruktura sa magkakaibang kulay.

Kung isang pangungusap lang ang maaalala mo: binabago ng pagpapataas ng alkalinidad ang tindi ng pagkukulay, samantalang binabago ng polikromisasyon ang mga kulay na nalilikha.

Karaniwang methylene blue sa tubig: ang batayan ng paghahambing

Ang pinakasimpleng pormulasyon ay methylene blue na tinunaw sa tubig, karaniwang nasa 1% w/v, na walang alkali at walang oksidasyon. Ang may-kulay na uri ng molekula ay ang methylthioninium cation na may kasamang chloride counterion, isang maliit at patag na tinang phenothiazine na inilalarawan sa tala ng PubChem tungkol sa methylene blue bilang methylthioninium chloride. Bilang isang kation, kumakapit ito sa mga gulugod na pospeyt ng mga nucleic acid at sa mga asidikong grupo sa dingding ng selula ng bakterya, kaya nagiging asul ang mga selula sa isang mapusyaw na likuran.

Ang bentahe nito ay mahuhulaan ang resulta. Nagmumukhang asul ang mga nukleo at bakterya. Katamtaman ang kontrast. Maaaring mahina ang pagkakakulay ng mga organismong mahirap makita, at ito mismo ang limitasyong hinangad ni Loeffler na malutas. Para sa mas malawak na pamilya ng mga simpleng pangkulay ng bakterya na kinabibilangan ng solusyong ito, tingnan ang isang pangkalahatang paliwanag sa simpleng pagkukulay ng bakterya. Mahalaga pa rin dito ang maingat na pagtukoy sa identidad: ganap na ibang molekula ang methyl blue, gaya ng ipinapaliwanag sa methyl blue kumpara sa methylene blue, kaya ang paghahanap sa katalogo batay lamang sa pangalan ng kulay ay maaaring magbigay ng maling klase ng tina.

Alkalinong methylene blue ni Loeffler: parehong tina, mas pinatindi ang pagkapit

Pinagsasama ng klasikong timpla ni Loeffler ang isang nakaimbak na solusyon ng methylene blue sa alkohol at malabnaw na alkali sa tubig. Ayon sa mga bersiyon sa aklat-aralin, kailangan ang 0.3 g ng tina sa 30 mL ng 95% ethanol kasama ang 100 mL ng 0.01% potassium hydroxide sa tubig (o ang katumbas na 30 mL ng puspos na solusyon ng methylene blue sa alkohol, 100 mL ng distilled water, at 1 mL ng 1% KOH). Nagbibigay ito ng solusyong handang gamitin na may halos 0.3% na tina sa malinaw na alkalinong pH. Parehong prinsipyo ang sinusunod ng mga komersiyal na bersiyon, at inililista ng katalogo ng Thermo Fisher para sa mga pangkulay sa mikrobiyolohiya ang alkalinong methylene blue ni Loeffler kasama ng mga polikromo at nasa-tubig na uri bilang magkakahiwalay na produkto sa katalogo na may magkakaibang nilalayong gamit.

Ang alkali ang pangunahing salik. Ang pagtaas ng pH ay nag-aalis ng proton sa mga grupong carboxyl at pospeyt sa ispesimen, kaya dumarami ang mga lugar na may negatibong karga. Samantala, pinananatili ng nakaimbak na solusyon sa ethanol na lubos na tunaw ang tina upang makarating ito sa mga lugar na iyon sa anyong monomero. Ang resulta ay mas mabilis at mas matinding pagkukulay ng bakterya kaysa sa ibinibigay ng neutral na tina sa tubig, na may pamilyar na madilim na asul na mga hugis-tungkod at kokus sa isang karaniwang bakteryolohikal na pahid. Karaniwang isa hanggang tatlong minuto ang pagkukulay, na sinusundan ng pagbabanlaw sa tubig.

Ang klasikong gamit nito ay para sa Corynebacterium diphtheriae na pinalago sa midyum na serum ni Loeffler: maninipis na hugis-tungkod, na madalas ay may dulong hugis-pamalo, na may matitingkad na metakromatikong butil na Babes-Ernst ng nakaimbak na polyphosphate. Makasaysayan ang pagpapares ng midyum at pangkulay, na parehong kinikilala bilang ambag ng iisang bakteryologo, at ang kontrast ng mga butil ang pakinabang nito sa pagsusuri. Bukod sa gawain sa dipterya, ginagamit ito bilang pangkalahatang pangkulay sa bakteryolohiya para sa mga pahid mula sa kultura, para sa morpolohiya ng Neisseria sa mga klinikal na pahid, at kung saan hindi kailangan ang Gram stain ngunit masyadong maputla ang karaniwang asul na pangkulay sa tubig. Isa itong pangkulay na iisa ang kulay. Nagkakaroon ng isang lilim ng asul ang lahat ng asidiko. Kapag hinihingi ng isang protokol ang magkakaibang kulay para mapag-iba ang mga istruktura, hindi iyon maibibigay ng alkali lamang.

Isang praktikal na pag-iingat: nasisira at nagkakaroon ng namuong latak ang mga alkalinong solusyon ng tina habang nakaimbak at sumisipsip ng carbon dioxide. Naghahanda ang mga laboratoryo ng katamtamang dami o bumibili ng solusyon mula sa katalogo at sumusunod sa itinakdang tagal ng pag-iimbak nito, sa halip na patuloy na gamitin ang isang lumang bote na nag-iiwan na ng latak sa bawat slide.

Polikromong methylene blue: isang pangalan, maraming tina

Nagsisimula ang polikromong methylene blue sa parehong tina ngunit ipinapadaan ito sa kontroladong oksidasyon sa alkali, na dating tinatawag na pagpapahinog o polikromisasyon. Ang pagpapatanda sa alkalinong kondisyon, pagpapainit kasama ng carbonate, o oksidasyon gamit ang mga ahenteng tulad ng dichromate ay unti-unting nag-aalis ng mga grupong methyl mula sa mga substituent na dimethylamino. Halo ang produkto: natitirang methylene blue kasama ng azure B (isang methyl ang nawala), azure A at azure C (karagdagang pag-aalis ng methyl), thionin (lubos na natanggalan ng methyl), at mga sekundaryang produkto ng oksidasyon mula sa pamilya ng methylene violet. May sariling kulay at hilig na kumapit sa tisyu ang bawat sangkap, kaya metakromatiko ang pagkukulay ng halo: nagkakaroon ang mga nukleo, butil, mucin, at kartilago ng magkakaibang tono mula asul hanggang mapulang-lila.

Ito rin ang kemistriyang nasa likod ng mga kilalang pangkulay ng dugo. Natuklasan ng mga naunang mananaliksik na kinukulayan ng methylene blue na ginawang alkalino ang mga nukleo ng parasitong sanhi ng malarya sa mga lilim ng lila, ngunit hindi matatag ang kanilang mga pinahinog na solusyon sa tubig at nagkakaroon ang mga ito ng namuong latak sa loob ng ilang araw. Sinusundan ng pagsusuri sa kung paano naimbento ang lilang pangkulay ng dugo kung paano magkahiwalay na ginamit nina Malachowski at Romanowsky ang epektong ito noong 1891, kung paano ipinakilala ang methanol upang patatagin ang namuong tina at ipirmi ang mga pahid nang walang init, at kung paano kalaunan ay ginawang pamantayan ni Giemsa ang halo batay sa sinukat na azure B kasama ng eosin, na pinatatatag gamit ang glycerol. Direktang nagmula ang mga makabagong pangkulay na uri ng Giemsa sa polikromong methylene blue kasama ng eosin, ang kombinasyong lumilikha ng epektong Romanowsky. Para sa detalyadong paliwanag tungkol sa pagpapares sa eosin at sa sangkap na azure B, tingnan ang mga pangkulay na uri ng Romanowsky at ang interaksiyon ng azure B at eosin.

Dahil isa itong halo, likas na ang polikromong methylene blue ang may pinakamababang antas ng istandardisasyon sa tatlo. Nakasalalay ang eksaktong balanse ng kulay nito sa pamamaraan at lawak ng oksidasyon. Kaya ibinebenta ito ng mga tagapagtustos sa histolohiya bilang hiwalay na produkto na may sarili nitong pagsusuri sa pagganap, sa halip na bilang pinatandang pangkulay ni Loeffler. Kabilang sa mga karaniwang gamit nito ang metakromatikong pagpapakita ng mga butil ng mast cell, mucin, at kartilago, mga detalye ng plasma cell, at Helicobacter pylori sa mga seksiyon ng tisyu sa pamamagitan ng mga polikromong pamamaraang uri ng Goodpasture. Ito ang tamang piliin kapag ang layunin ay pag-iiba batay sa kulay, at maling piliin kapag inaasahan ng protokol ang malinaw at iisang-kulay na hugis ng bakterya.

Paghahambing ng pormulasyon at layunin

Basahin ang talahanayan bilang gabay sa pagpapasya. Kung masyadong maputla ang pagkakakulay ng ispesimen, baguhin ang konsepto ng pH at gamitin ang pangkulay ni Loeffler. Kung nakukulayan ang lahat ngunit walang namumukod na pagkakaiba, baguhin ang konsepto ng tina at gamitin ang polikromo. Kung napakalinaw ng mga butil sa isang pahid na kinulayan gamit ang pangkulay ni Loeffler ngunit nagtatanong ang superbisor kung bakit parehong asul ang mga nukleo at sitoplasma, ang sagot ay walang alkalinong pangkulay na iisa ang kulay na makagagawa ng trabahong iyon. Saklaw iyon ng pamilyang polikromo at ng mga deribatibo nitong pangkulay ng dugo.

Pag-iwas sa mga karaniwang pagkalito

Dalawang pagkakamali ang sanhi ng karamihan sa pagkalito. Ang una ay ang pag-aakalang maaaring ipagpalit ang pangkulay ni Loeffler at karaniwang methylene blue dahil parehong asul ang hitsura ng mga ito sa bote. Magkaiba ang mga ito sa pH at tindi, at ang pagpapalit ng neutral na tina kapag pangkulay ni Loeffler ang tinukoy ay nag-aalis mismo sa kontrast ng mga butil na siyang batayan ng protokol. Ang ikalawa ay ang pagturing sa anumang luma o hindi sinasadyang napatandang alkalinong asul na pangkulay bilang polikromo. Lumilikha ang hindi kontroladong pagpapatanda ng halong hindi tiyak ang komposisyon at konsentrasyon, samantalang inihahanda ang tunay na mga polikromong solusyon sa pamamagitan ng mga itinakdang pamamaraan ng oksidasyon at, sa linya ng pag-unlad ng mga pangkulay ng dugo, pinagsasama sa sinukat na eosin. May mahalagang aral dito ang kasaysayan: napalitan ang hindi matatag na mga pinahinog na solusyon sa tubig noong dekada ng 1890 ng mga pinatatag na pormulasyon sa methanol dahil mismo sa hindi mauulit nang pareho ang mga hindi kontroladong halo. Mahalagang alalahanin ang aral na ito bago kulayan ang isang slide para sa pagsusuri gamit ang isang boteng hindi tiyak ang tagal ng pagkakaimbak.

Kinukumpleto ng maingat na pagtukoy sa pangalan ang proseso. Tiyakin sa etiketa ang produkto sa katalogo (nasa tubig kumpara sa Loeffler kumpara sa polikromo), ang nilalamang tina, at ang nilalayong gamit, sa halip na maghinuha batay sa kulay. Magkakapareho ang pinagmulan ng chromophore ng tatlong pormulasyon. Hindi magkakapareho ang kanilang layunin.