Pagsukat ng reaktibong mga uri ng oksiheno sa mga eksperimento sa methylene blue

Dalawang laboratoryo ang nagsasagawa ng tinatawag ng bawat isa na eksperimento sa katangiang antioxidant ng methylene blue. Iniulat ng isa na pinipigil ng pangkulay ang reaktibong mga uri ng oksiheno. Iniulat naman ng isa na lumilikha ito ng mga iyon. Parehong nagpapakita ng malinaw na mga kurba ng tugon sa dosis. Pareho silang tapat. Hindi pandaraya o kawalan ng kakayahan ang dahilan ng pagkakaiba. Magkaibang bagay ang sinukat ng dalawang grupo sa magkaibang kondisyon ng liwanag, gamit ang mga probe na sumasagot sa magkaibang tanong, at pagkatapos ay inilarawan ang dalawang sagot gamit ang iisang salita: ROS.

Mahirap sukatin nang tumpak ang molekulang methylene blue dahil nakikilahok ito sa kemikang dapat sana nitong obserbahan. Sa dilim, inililipat nito ang mga electron sa pagitan ng mga donor at acceptor at bumabalik sa panimulang anyo nito, handang umikot muli. Sa ilalim ng liwanag, nagiging photosensitiser ito at umaabot sa isang excited triplet state kung saan maaari itong maglipat ng enerhiya sa oksiheno upang bumuo ng singlet oxygen, o maglipat ng mga electron upang bumuo ng mga radical at hydrogen peroxide. Anumang probe na ilagay sa sistemang iyon ay maaaring ma-oxidise, ma-reduce, mawalan ng kulay, o matakpan ang optikal na signal nito ng mismong pangkulay. Kaya ang unang tanong sa anumang pagbasa ng ROS ay hindi kung ano ang numero. Ang tanong ay kung ano talaga ang natutukoy ng pagsusuri, at kung ano ang ginagawa ng pangkulay sa pagsusuri.

Amplex Red: isang naka-kalibrang pagsusuri ng hydrogen peroxide

Ang kombinasyong methylene blue at Amplex Red ang pinakamatibay na maipagtatanggol na pagpapares sa literaturang ito, kapag tama ang pagkakagawa ng pagsusuri. Tiyak ang kimikang sangkot: ginagamit ng horseradish peroxidase ang hydrogen peroxide upang ma-oxidise ang Amplex substrate at maging fluorescent na produktong resorufin, sa humigit-kumulang isa-sa-isang stoichiometry. Ang peroxide mula sa sample ay nagiging fluorescence sa detektor. Wala nang ibang kabilang sa karaniwang pangkat ng ROS ang direktang nagpapagana sa reaksiyong iyon.

Ang mapagpasyang bentahe ay kalibrasyon. Sinusuri ng isang maingat na mananaliksik ang mga pamantayang solusyon na may alam na dami ng peroxide sa parehong buffer, gamit ang parehong konsentrasyon ng peroxidase at substrate, parehong tagal ng inkubasyon, at parehong optikal na mga setting, saka ikinukumpara ang mga pagbasa ng sample sa kurbang iyon. Sa pag-aaral ng mga mitochondria na inihiwalay mula sa utak na nagsisilbing batayan ng paraang ito, iyon mismo ang ginawa ng mga may-akda: nagdagdag sila ng alam na dami ng peroxide sa dulo ng bawat pagsusuri, at iniulat ang mga numero bilang mga rate sa picomoles bawat minuto bawat milligram ng protina, sa halip na arbitraryong mga yunit ng fluorescence. Iyon ang nagpapabago sa isang pagliwanag tungo sa isang pagsukat.

Tatlong detalye mula sa pag-aaral na iyon ang dapat tularan. Una, tiniyak ng mga may-akda ang signal gamit ang catalase, na sumisira sa peroxide. Huminto ang pagtaas ng fluorescence na dulot ng methylene blue nang idagdag ang catalase, na nagpapatunay na peroxide ang pinagmulan ng signal at hindi isang optikal na artepakto. Ikalawa, direktang sinubok nila ang epekto ng pag-iilaw sa pamamagitan ng pagharang sa sinag na pang-excitation gamit ang shutter upang makatanggap ang mga sample ng isang ikawalo ng karaniwang dosis ng liwanag, at bumaba ang signal nang siyam na porsiyento lamang. Mahigit siyamnapung porsiyento ng peroxide na iniulat nila ay hindi nakadepende sa liwanag na ginamit sa pagsukat. Ikatlo, hiwalay nilang sinukat ang pag-aalis ng peroxide gamit ang isang elektrod at natuklasang parehong pinataas ng pangkulay ang produksiyon at pinabagal ang pag-aalis nito. Mapagsasama bilang iisang epekto ng isang probe na netong fluorescence lamang ang iniuulat ang dalawang epektong iyon.

May mga paraan pa rin kung paano maaaring pumalya ang pagsusuri, at nagdudulot ang methylene blue ng ilan sa mga ito. Malawak ang pagsipsip ng pangkulay sa parehong pulang rehiyon ng spectrum kung saan naglalabas ng liwanag ang resorufin, kaya sa mataas na konsentrasyon ng pangkulay ay maaaring matakpan ng sample ang sarili nitong signal dahil sa mga epekto ng panloob na pagsala ng liwanag. Samakatuwid, dapat kapareho ng sa mga sample ang konsentrasyon ng pangkulay sa mga pamantayang solusyon. Maaari ring kusang ma-photooxidise ang Amplex Red, at ang produktong resorufin nito ay maaaring pumasok sa photoredox cycling na lumilikha ng superoxide at peroxide. Napakahalaga nito kapag iniilawan din sa eksperimento ang isang photosensitiser. Ang praktikal na solusyon ay ilantad muna sa liwanag ang mga sample ng methylene blue at pagkatapos ay suriin ang mga aliquot gamit ang mga reagent ng Amplex sa dilim, sa halip na sabay na ilawan ang pangkulay at probe. Panghuli, hindi basta pinipigil ng superoxide dismutase ang isang signal ng Amplex: maaari itong tumaas dahil sa pagpapalit ng superoxide tungo sa peroxide. Hindi pumalya ang isang kontrol na SOD na nagpapataas ng fluorescence. Natukoy nito na ang superoxide ay isang uri ng molekulang nasa mas naunang bahagi ng reaksiyon.

DCFDA: isang hindi espesipikong tagapagpahiwatig ng oksidasyon

Ang pagpapares ng methylene blue at DCFDA ang pinagmumulan ng karamihan sa kalituhan. Ang DCFH-DA ay isang precursor na ipinapasok sa selula. Inaalis ng mga esterase sa loob ng selula ang mga acetate group nito upang maiwan ang hindi fluorescent na DCFH, at nagbubunga ng fluorescent na DCF ang oksidasyon ng DCFH. Mahaba ang listahan ng mga nakapag-o-oxidise dito: mga hydroxyl radical, mga intermediate ng peroxidase at heme, nitrogen dioxide, hypochlorous acid, at mga radical na nagmumula sa peroxynitrite. Hindi ito direktang nao-oxidise ng hydrogen peroxide lamang sa anumang rate na kapaki-pakinabang; karaniwang kailangan ng fluorescence na nakadepende sa peroxide ang iron, mga protinang may heme, o kimika ng peroxidase sa proseso.

Ang kritikal na pagsusuring dapat sipiin ng bawat seksiyon ng mga pamamaraan ay mula sa pagsusuri nina Kalyanaraman at mga kasamahan sa DCFH bilang probe, gaya ng ibinuod sa pag-aaral ng mitochondria ng utak na tumanggi sa DCFDA dahil dito. Ipinakita nila na mabagal ang reaksiyon ng pangkulay, hindi nailalarawan ang stoichiometry nito, wala itong wastong kalibrasyon, at nakikipagreaksiyon ito sa mga compound na hindi ROS. Pinapalakas din ng probe ang sinusukat nito: ang oksidasyon ng DCFH sa pamamagitan ng pagkawala ng isang electron ay lumilikha ng DCF radical na nakikipagreaksiyon sa oksiheno upang bumuo ng superoxide, na sumasailalim sa dismutation upang makabuo ng karagdagang peroxide. Bahagyang nililikha ng mismong pagbasa ang kimikang iniuulat nito.

Hindi ibig sabihin ng alinman dito na walang silbi ang DCFDA. Nangangahulugan itong pangunang pagsusuri ito, hindi isang pagtukoy sa pagkakakilanlan. Ang pagtaas ng fluorescence ng DCF ay nangangahulugang tumaas ang oksidasyon ng probe na nakadepende sa mga oxidant. Hindi nito ibig sabihin na tumaas ang peroxide, at lalong hindi nito ibig sabihin na tumaas ang kabuuang ROS, isang dami na hindi kayang sukatin ng iisang probe. Ang naunang mga pag-aaral sa methylene blue na umasa sa oksidasyon ng DCF sa mahigit isang micromolar ay nag-ulat ng mga epektong prooxidant, samantalang ang ibang mga sistema sa parehong panahon ay nag-ulat ng proteksiyon laban sa pagkamatay ng selula na dulot ng peroxide. Maaaring parehong totoo ang dalawang obserbasyon para sa iisang pangkulay sa magkaibang kalagayang redox, at hindi masasabi ng resulta ng DCF lamang kung aling oxidant ang nagdala ng signal. Mahalaga ang naunang pag-aaral sa mitochondria ng utak dahil pinalitan nito ang pangunang pagsusuring ito ng isang naka-kalibrang pagsukat ng peroxide at direktang natukoy ang pasanin: kahit isang daang nanomolar na pangkulay ay nagpataas nang ilang ulit sa paglabas ng peroxide sa bawat substrate at kalagayan ng respirasyon na sinubok.

May isa pang bitag ang DCFDA na partikular sa methylene blue. Matindi ang kulay ng pangkulay at aktibo ito sa redox, kaya maaari nitong pahinain ang fluorescence, supilin ang paglabas ng liwanag, o ma-oxidise ang sistemang kemikal ng probe nang hiwalay sa ROS ng selula. Hindi opsiyonal na dagdag lamang ang isang kontrol na walang selula ngunit may pangkulay at probe. Ito ang eksperimentong nagsasabi kung nakikipag-ugnayan ang pangkulay sa probe.

Spin trapping at pagkonsumo ng oksiheno: pagkakakilanlan at daloy

Kung iniuulat ng mga fluorescent probe na may lumitaw na bagay na maaaring ma-oxidise, ang electron spin resonance na may mga spin trap ay nagbibigay ng ulat na mas malapit sa pagkakakilanlan ng bagay na iyon. Ginamit ng klasikong pag-aaral sa photochemistry ng methylene blue ang ESR upang matukoy ang ascorbate radical mula sa pangkulay, ascorbate at liwanag, at pagkatapos ay ipinakita ang pagbuo ng peroxide sa mga eksperimento ng pagkonsumo ng oksiheno at ang pagbuo ng hydroxyl radical na kinatalisa ng iron sa mga pagsusuring spin trapping. Sinagot ng bawat pamamaraan ang tanong na hindi masagot ng iba: ibinigay ng ESR ang pagkakakilanlan ng radical, ibinigay ng pagkonsumo ng oksiheno ang daloy ng reaksiyon nang hindi nakadepende sa anumang fluorescent probe, at ipinakita ng kombinasyon na parehong gumagana ang mga landas ng singlet oxygen at mga radical sa iisang sistemang naiilawan.

Ang resultang iyon noong 1984 ay nagsisilbi pa ring babala. Kapag may pag-iilaw at isang reducing agent, lumilikha ng peroxide ang pangkulay; kapag may iron, lumilikha ang sistema ng hydroxyl radical, ang pinakareaktibong uri sa pangkat. Iniugnay ito ng mga may-akda sa ascorbate sa mata at kinuwestiyon ang basta-bastang paggamit nito sa mata. Dapat tandaan ng mga mambabasa ngayon ang mga kondisyon: liwanag kasama ang reductant at iron. Alisin ang alinman sa mga iyon at humihina o nawawala ang landas.

Sa ibang paraan naman nagiging mahalaga ang mga elektrod para sa oksiheno. Sinusukat ng elektrod na uri ng Clark ang netong pagkonsumo ng oksiheno, na nagpapatunay na kumokonsumo ng molekular na oksiheno ang kimikang redox na pinapagana ng pangkulay at nagbibigay ng datos sa bilis ng reaksiyon na hindi magagaya ng anumang artepakto ng fluorescence. Hindi nito tinutukoy ang produkto. Ang pagbuo ng peroxide, superoxide, at tubig, pati ang pagkabulok ng singlet oxygen, ay pawang kumokonsumo ng oksiheno. Hindi kumpleto ang daloy na walang pagkakakilanlan, gaya ng pagkakakilanlang walang daloy. Kaya ipinapares ng matitibay na pag-aaral ang elektrod sa isang naka-kalibrang pagsusuri ng peroxide o sa isang trap.

Bakit nagkakasalungat ang mga resulta tungkol sa antioxidant

Kapag pinaghambing ang tatlong uri ng pagbasa, maipapaliwanag ang tila mga kontradiksiyon sa literatura tungkol sa methylene blue bilang mga pagkakaiba sa pamamaraan kasama ang tatlong katotohanang biyolohikal.

Una, parehong tagapaglipat ng electron at pinagmumulan ng peroxide ang pangkulay. Sa paglihis ng mga electron palayo sa mga lugar ng respirasyon kung saan sana magiging superoxide ang oksiheno, maaari nitong pababain ang isang ROS habang ang reduced na anyo nito ay direktang nagre-reduce ng oksiheno tungo sa peroxide, kaya pinapataas ang isa pa. Samakatuwid, dapat asahan ng isang laboratoryong nagsusuri sa kimikang redox ng mitochondria at ang papel ng methylene blue bilang alternatibong daanan ang mga sagot na nakadepende sa probe: bumababa ang pagbasa na sensitibo sa superoxide habang tumataas ang pagbasa ng peroxide sa iisang cuvette.

Ikalawa, ang peroxide sa mababang dosis ay isang signal, hindi lamang pinsala. Natuklasan ng pag-aaral sa mitochondria ng utak ng daga na sumunod sa naunang pag-aaral ang paglikha ng peroxide mula sa kasingbaba ng limampung nanomolar na pangkulay nang walang mga pinsala sa mitochondrial DNA sa mga antas na panterapiya, na may proteksiyon laban sa mga pinsalang dulot ng rotenone pagkatapos ng paunang paggamot. Sa isang daang micromolar lamang, na napakataas kumpara sa saklaw na panterapiya, napinsala ng pangkulay ang mga piling fragment ng DNA; ang pulang liwanag kasama ang dalawampung micromolar na pangkulay ay lumikha ng singlet oxygen na puminsala sa lahat ng fragment na sinubok. Hormetic ang iminungkahing mekanismo: pinupukaw ng banayad na produksiyon ng peroxide ang mga depensang antioxidant na kaugnay ng Nrf2 at ang biogenesis ng mitochondria, kaya nauuna ang panandaliang pagbasang prooxidant sa mas pangmatagalang resultang antioxidant. Maaaring magkaiba ang resulta ng pagsusuring binasa sa isang oras at ng pagsusuring binasa sa isang araw dahil nagbago ang biyolohiya sa pagitan ng mga iyon.

Ikatlo, tinutukoy ng liwanag kung anong molekula ang naroroon. Inaalis ng pag-iilaw ang mga methyl group ng pangkulay upang mabuo ang Azure B at mga kaugnay na produkto, at sapat na ang ilaw ng mikroskopyo sa ibabaw ng isang dish upang maging photosensitiser ang pangkulay. Magkaibang eksperimento ang mga ginagawa sa dilim at ang mga ginagawa sa liwanag, at dapat silang ituring na ganoon sa seksiyon ng anumang protokol tungkol sa mga kontrol para sa pag-iilaw at paghawak sa pangkulay.

Isang minimum na hanay ng mga kontrol, at kung paano basahin ang anumang pahayag

Ang paghahambing sa ibaba ang orihinal na sangguniang ginawa para sa artikulong ito. Bago tanggapin ang anumang resulta ng ROS sa methylene blue, tingnan kung aling hanay ang isinagawa ng mga may-akda at alin ang nilaktawan nila.

Mula rito, may praktikal na tuntunin sa pagbasa. Ang Amplex na may peroxidase, naka-kalibra, at may pagsusuri gamit ang catalase ay ebidensiya tungkol sa peroxide. Ang DCFDA ay ebidensiya tungkol sa hindi espesipikong oksidasyon ng probe at wala nang iba. Ang spin trapping na may mga kontrol gamit ang mga scavenger ay ebidensiya tungkol sa pagkakakilanlan ng radical. Ang pagkonsumo ng oksiheno ay ebidensiya tungkol sa daloy. Ang pangungusap na nagsasaad ng higit sa kayang suportahan ng pagsusuri nito, gaano man katiyak ang pagkakasulat, ay isang pangungusap tungkol sa probe, hindi tungkol sa pangkulay. Pinalalawak ng mga kaugnay na talakayan tungkol sa pagdepende sa dosis at sa hormetic na saklaw, daloy ng electron sa mitochondria, panghihimasok sa pagsusuri sa mga sample na may pangkulay, at mga artepakto ng pag-iilaw sa mikroskopya ang bawat puntong ito, at nananatiling wasto ang bawat isa kapag napalitan na ang pansamantalang sanggunian nito.