Pagsukat sa mga epekto ng methylene blue sa mitokondriya: oxygen, ATP, at potensiyal ng lamad

Ipagpalagay na nagdagdag ang isang laboratoryo ng methylene blue sa mitokondriyang may kapansanan sa respirasyon at napansing tumaas ang pagkonsumo ng oxygen. Ang natural na isusulat ay naibalik ng pangkulay ang paggana ng mitokondriya. Maaaring mali ang pahayag na iyon. Tatlong magkakaibang konsepto ang daloy ng oxygen, sintesis ng ATP, at potensiyal ng lamad. Nasa iisang organelo ang mga ito, gaya ng backup, pag-sync, at pagbabahagi na gumagamit ng iisang folder sa cloud: magkakaugnay, ngunit pinamamahalaan ng magkakaibang tuntunin. Kapag napagkamalan ang isa bilang iba, magiging mali ang interpretasyon kahit tama sa teknikal na aspeto ang bawat sukat.

Mas madaling magkaroon ng ganitong kalituhan sa methylene blue dahil nakikilahok ito sa sistemang sinusukat nito. Paulit-ulit itong dumaraan sa redox cycle, tumatanggap ng mga electron sa naunang bahagi ng proseso at nagbibigay ng mga ito sa kasunod na bahagi. Isa rin itong katyong lipopiliko na naiipon sa mitokondriyang may enerhiya, at isang matingkad na asul na tambalang sumisipsip at naglalabas ng liwanag sa parehong mga banda na ginagamit ng karaniwang mga probe. Hindi kayang sagutin ng iisang pagbasa ang lahat ng iyon. Ang maaasahang pamamaraan, na ipinakita sa mga pag-aaral sa mitokondriya mula sa Budapest, ay sukatin ang daloy ng oxygen kasama ang bilis ng sintesis ng ATP, potensiyal ng lamad, at paglabas ng hydrogen peroxide, na may mga kontrol na partikular sa pangkulay sa bawat hakbang.

Sinusukat ng respirometry ang daloy ng oxygen, hindi ang nalilikhang enerhiya

Iisang bagay ang iniulat ng respirometry na may mataas na resolusyon, gamit man ang Oroboros Oxygraph o Seahorse extracellular flux analyzer: kung gaano kabilis nagaganap ang reduksiyon ng oxygen. Hindi nito iniulat kung ilang proton ang naipumpa sa bawat electron, gaano kalaking gradient ang napanatili, o kung nagamit ito ng ATP synthase.

Mahalaga ang mga terminong ginagamit. Sa nakahiwalay na mitokondriya, ang substrate na walang ADP ay nagbibigay ng respirasyong dulot ng pagtagas, ang substrate na may ADP sa antas ng saturasyon ay nagbibigay ng kapasidad sa oksidatibong posporilasyon, at ang titrasyon gamit ang uncoupler ay nagbibigay ng pinakamataas na kapasidad sa paglipat ng electron. Sa mga buo at hindi pinasok na selula, ang katumbas na mga sukat ng Seahorse ay batayang respirasyon, respirasyong kaugnay ng ATP at sensitibo sa oligomycin, pagtagas ng proton, pinakamataas na respirasyong itinakda gamit ang FCCP, at pagkonsumo ng oxygen na hindi mula sa mitokondriya at hindi nahaharang ng rotenone kasama ang antimycin. Ang pagtawag sa mga resulta ng Seahorse na State 3 at State 4 ay gumagamit ng antas ng katiyakang hindi sinusuportahan ng preparasyon, gaya ng nililinaw ng balangkas ng Agilent Mito Stress Test.

Sinisira ng methylene blue ang madaling ipagpalagay na ugnayan ng mas maraming oxygen at mas maraming enerhiya. Sa nakahiwalay na mitokondriya mula sa utak ng guinea pig, pinataas ng 100 nM hanggang 1 uM na pangkulay ang pagkonsumo ng oxygen sa pahingang kondisyon gamit ang mga substrate na glutamate kasama ang malate, succinate, at alpha-glycerophosphate. Umabot sa humigit-kumulang 64 porsiyento ang pagtaas sa alpha-glycerophosphate, ngunit halos hindi nagbago ang respirasyong pinasigla ng ADP sa malusog na mitokondriya, ayon sa pag-aaral sa nakahiwalay na mitokondriya ng utak. Dahil tumaas ang pagtagas habang nanatiling pareho ang daloy na pinasigla ng ADP, bumababa ang nakuwentang respiratory control ratio. Hindi ibig sabihin ng pagbaba na iyon na napinsala ng pangkulay ang mitokondriya. Ang ibig sabihin ay nagdagdag ang pangkulay ng isang redox cycle na kumokonsumo ng oxygen bukod sa normal na respirasyon. Ang assay ng pagkonsumo ng oxygen gamit ang methylene blue na nag-uulat lamang ng pagtaas ay nakasukat ng tunay na prosesong kemikal ngunit walang nasabi tungkol sa pagpapanatili ng enerhiya.

Ipinapakita ng mga eksperimento sa pagpapanumbalik ang parehong agwat sa mas malaking antas. Nang maharang ang Complex I, bumalik ang daloy ng oxygen sa humigit-kumulang tatlong ulit habang ang sintesis ng ATP ay bumalik lamang sa humigit-kumulang 1.5 beses. Mas maraming oxygen ang umabot sa electrode. Mas maliit na bahagi nito ang nagamit para sa ATP. Anumang pahayag na bumuti ang oksidatibong posporilasyon ay nangangailangan ng sukat ng ATP, na pinakamainam ipahayag bilang ratio ng ATP sa bawat oxygen, kasama ang paglilinaw kung paano itinakda ang denominator.

Sinusukat ng mga assay ng ATP ang bilis ng sintesis, na hindi mapapalitan ng dami ng ATP

Ibang tanong ang sinasagot ng assay ng ATP: gaano karaming ATP ang nalilikha sa bawat yunit ng oras. Nagbibigay ng bilis ang isang kinetikong pagbasa, maging ito man ay luminescence ng firefly luciferase na sinusubaybayan sa loob ng ilang minuto o isang pinagsamang assay ng hexokinase at glucose-6-phosphate dehydrogenase na binabasa sa 340 nm. Ang iisang pagsukat ng kabuuang ATP sa dulo ay nagbibigay ng dami ng ATP, na sumasalamin sa sintesis na binawasan ng pagkonsumo at kaunti lamang ang sinasabi tungkol sa oksidatibong posporilasyon kung mag-isa.

Ginamit ng pangkat mula sa Budapest ang pinagsamang pamamaraang ensimatiko habang pinipigil ang adenylate kinase. Natuklasan nilang bahagya ngunit makabuluhang pinataas ng methylene blue sa 1 hanggang 2 uM ang produksiyon ng ATP sa mitokondriyang nilagyan ng rotenone at antimycin. Tunay itong pagpapanumbalik, ngunit bahagya lamang. Ganoon din ang naging pangkalahatang resulta ng pag-aaral sa toksisidad ng TEGDMA sa ibang modelo: pinabagsak ng 5 mM na dental monomer na TEGDMA ang respirasyong kaugnay ng Complex I mula humigit-kumulang 286 tungo sa 28 yunit ng daloy, at ibinalik ito ng 2 uM na pangkulay sa humigit-kumulang 86.

Hindi maaaring alisin ang dalawang kontrol kapag gumagamit ng may-kulay na tambalang redox. Una, gumamit ng oligomycin upang matukoy kung gaano kalaki sa nasukat na sintesis ng ATP ang nakasalalay sa ATP synthase. Ikalawa, magsagawa ng pagsusuri sa pagbawi ng idinagdag na kilalang dami ng ATP sa sistemang walang selula, kasama ang kumpletong reagent at ang eksaktong mga konsentrasyon ng pangkulay na ginamit—sa pinakamababa, 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, at 2 uM. Maaaring sipsipin ng pangkulay ang inilalabas na liwanag, pigilan ang ensimang nagbibigay ng signal, o baguhin ang kimikang redox ng reagent. Inirerekomenda ng pangkalahatang gabay sa assay ng luciferase ang mga karagdagang pagsusuring biyokemikal upang matukoy ang ganitong uri mismo ng panghihimasok. Huwag ipagpalagay na walang artipakto sa 1 uM dahil lamang karaniwang mas matindi ang paghina ng signal sa mas mataas na konsentrasyon.

Sinusukat ng mga probe ng potensiyal ng lamad ang distribusyon ng pangkulay, hindi ang daloy

Ang Safranine O, TMRM at TMRE, rhodamine 123, at JC-1 ay pawang mga katyong nakakaraan sa lamad. Naiipon ang mga ito sa matrix na may negatibong karga ayon sa ekilibriyong elektrokemikal, kaya hindi direktang ipinapakita ng kabuuang fluorescence ang potensiyal sa pamamagitan ng lokasyon ng probe. Wala sa mga ito ang sumusukat sa ATP o sa daloy ng electron.

May angkop na preparasyon para sa bawat probe. Ang Safranine O ay angkop sa nakahiwalay na mitokondriya at mga selulang ginawang permeable, karaniwang malapit sa 2 uM na may excitation na malapit sa 495 nm at emission na malapit sa 585 nm. Gumagana ito sa kondisyong may quenching, kung saan binabago ng pagpasok nito ang kabuuang fluorescence. Ang TMRM at TMRE ay angkop sa mga buo at hindi pinasok na selula gamit ang mababang nanomolar na dami sa modong walang quenching, kung saan inilalabas ng depolarisasyon ang pangkulay at bumababa ang fluorescence ng mitokondriya; sa mataas na dami, maaaring bumaligtad ang direksiyon ng signal dahil sa self-quenching. Nagbibigay ang JC-1 ng maginhawang ratio ng berde sa pula, ngunit nakasalalay ito sa dami ng inilagay na probe at sa masa ng mitokondriya. Dahil dito, hindi ito kasinghusay ng maingat na kinontrol na TMRM para sa kuwantitatibong pagsusuri. Ibinubuod ang mga kapalit na bentahe at limitasyong ito sa isang malawakang ginagamit na pagsusuri sa mga probe ng potensiyal ng lamad ng mitokondriya.

Nanghihimasok ang methylene blue sa mga optikal na sukat sa mismong mga konsentrasyong ginagamit. Nagsasapawan ang mga banda ng pagsipsip nito malapit sa 600 hanggang 665 nm at ang pulang emission ng mga probe, kaya posibleng magkaroon ng mga epekto ng panloob na pagsala, quenching, at pagsipsip ng liwanag na pang-excitation. Isa rin ang pangkulay sa mga katyong lipopiliko, at nagbabago ang sarili nitong distribusyon ayon sa potensiyal na sinusukat. Ang pananggalang ay paggamit ng magkahiwalay na pangkumpirmang sukat at mga blanko: probe lamang, pangkulay lamang, probe kasama ang bawat konsentrasyon ng pangkulay, ganap na depolarisasyon gamit ang FCCP bilang reperensiyang zero, at kung maaari, pangalawang probe na may naiibang katangiang optikal. Itinakda ng pag-aaral sa pagdaan sa alternatibong ruta sa halip na Complex III ang halimbawang ito sa pamamagitan ng pag-ulit ng pagpapanumbalik ng potensiyal ng lamad gamit kapwa ang safranine O at TMRM pagkatapos ng pagharang gamit ang antimycin at myxothiazol, at pagkamit ng parehong uri ng pagbalik. Pahiwatig lamang ang isang optikal na tagapag-ulat. Ebidensiya ang dalawang independiyenteng tagapag-ulat.

Tatlong preparasyon, tatlong magkakaibang tanong

Ang nakahiwalay na mitokondriya, mga selulang ginawang permeable, at mga buo at hindi pinasok na selula ay hindi mapagpapalit na mga antas ng sensitibidad ng iisang assay. Magkakaiba ang mga konsepto at prinsipyong pinagbabatayan ng mga ito.

Pinananatili ng nakahiwalay na mitokondriya ang kadena ng transportasyon ng electron, panloob na lamad, at mga mekanismo sa matrix habang inaalis ang lamad ng selula, cytosol, at estruktura ng network. Ang pag-aalis na iyon ang layunin: eksaktong naitatakda ang mga substrate, ADP, inhibitor, at konsentrasyon ng pangkulay, kaya matutukoy ang isang ruta. Ang kapalit ay pagkawala ng likas na suplay ng substrate, pagsesenyas, at pangangailangan.

Pinananatili ng mga selulang ginawang permeable ang mitokondriya sa loob ng malaking bahagi ng estruktura ng selula habang pinapapasok ang mga substrate mula sa labas at ADP sa binuksang lamad ng selula. Ang mga ito ang angkop na kasangkapan upang matukoy ang depekto sa ruta ng paggamit ng substrate sa konteksto ng selula. Napipinsala ng labis na pagpapataas ng permeability ang panlabas na lamad, at nawawala ang regulasyong nagmumula sa cytosol.

Pinananatili ng mga buo at hindi pinasok na selula ang lahat: ang hadlang na lamad ng selula, mga reductant sa cytosol, transportasyon ng mga likas na substrate, network ng mitokondriya, at pangangailangan sa ATP. Pinakamalapit ang mga ito sa pisyolohiya at pinakamalayo sa pagtukoy ng mekanismo, dahil magkakasamang humuhubog ang pagpasok, reduksiyon, at pagkakakulong ng pangkulay sa aktuwal na pagkakalantad ng mitokondriya rito.

Sadyang ginamit ng pag-aaral sa TEGDMA ang lahat ng tatlong antas: nakahiwalay na mitokondriya ng utak para sa pagpapanumbalik ng oksidasyon at potensiyal gamit ang pangkulay; mga stem cell ng sapal ng ngipin na ginawang permeable, pangunahin upang matukoy na nasa oksidasyon ng substrate na kaugnay ng Complex I ang depekto; at mga buo at hindi pinasok na stem cell para sa kabuuang epektong pisyolohiko ng 2 uM na pangkulay sa napigil na pagkonsumo ng oxygen. Para sa mga mambabasang naghahambing ng mga pagbasa sa mitokondriya sa iba't ibang preparasyon, nagbibigay ng paliwanag sa mga ruta ang kaugnay na artikulo tungkol sa kung paano inililipat ng methylene blue ang mga electron sa kadena ng respirasyon. Tinatalakay naman ng gabay sa pagbasa ng mga pag-aaral sa respirasyon gamit ang methylene blue ang pangangatwiran sa dami at mga inhibitor.

Mga kontrol na kailangan ng pangkulay na aktibo sa redox

Nangangailangan ng mas mahabang listahan ng kontrol ang isang tambalang paulit-ulit na dumaraan sa redox cycle kaysa sa ordinaryong inhibitor, dahil maaaring magmukhang prosesong biyolohiko ang kimikang nagmumula lamang sa pangkulay.

Para sa respirometry, gumamit ng silid na may buffer lamang upang suriin ang pag-anod ng sukat, silid na may buffer at pangkulay ngunit walang materyal na biyolohiko, pangkulay kasama ang anumang reductant sa labas ng selula na nasa assay, at rotenone kasama ang antimycin sa huling bahagi upang matukoy ang pagkonsumo ng oxygen na hindi mula sa mitokondriya sa mga buo at hindi pinasok na selula. Tandaan na muling naooxidize ang nareduksiyong pangkulay sa paglilipat ng mga electron sa oxygen upang bumuo ng hydrogen peroxide. Kaya minamaliit ng blankong may pangkulay lamang ngunit walang tagapagbigay ng electron ang pagkonsumo ng oxygen na walang kinalaman sa selula at lumilitaw kapag may NADH o NADPH.

Para sa hydrogen peroxide, piliin ang naka-calibrate na Amplex UltraRed kasama ang horseradish peroxidase sa halip na mga hindi selektibong pangkulay na DCFDA, kumpirmahin gamit ang catalase, at subukan kung nakasalalay ang resulta sa pag-iilaw dahil photosensitizer ang pangkulay. Natuklasan ng pag-aaral sa mitokondriya ng utak na tumaas nang mahigit apat na ulit ang pasanin ng peroxide sa 100 nM lamang na pangkulay habang bumagal ang pag-aalis nito. Direktang nabuo ang peroxide mula sa nareduksiyong pangkulay nang walang superoxide bilang tagapamagitan. Nasa kaugnay na artikulo tungkol sa pagsukat ng mga reaktibong uri ng oxygen sa mga eksperimento gamit ang pangkulay ang mga detalye sa pagpili ng probe at mga kontrol sa liwanag. Tinatalakay naman ang mas malawak na tanong kung kailan gumaganap ang peroxide bilang signal o bilang pasanin kasama ng balanse ng redox sa selula at mga pahayag tungkol sa antioxidant.

Para sa mga pahayag tungkol sa ruta, subukan ang parehong lugar ng pagharang sa Complex III: antimycin A sa lugar na Qi at myxothiazol sa lugar na Qo, kasama ang pagsusuri sa Complex IV sa huling bahagi gamit ang cyanide. Iniulat ng mas naunang pag-aaral sa utak ng daga na naibalik ng pangkulay ang respirasyong hinarang ng rotenone ngunit hindi ang hinarang ng antimycin. Natuklasan naman ng mas huling pag-aaral sa tatlong species ang bahagyang pagpapanumbalik sa parehong inhibitor at ebidensiya ng direktang reduksiyon ng cytochrome c. Ituring ang pagdaan sa alternatibong ruta bilang tugma sa mas bagong datos, hindi bilang ganap nang napatunayan, dahil binabago ng konsentrasyon ng pangkulay, lugar ng pagharang, kalagayan ng substrate, at distribusyon ng pangkulay ang naobserbahang ruta.

Talahanayan ng pagpili ng assay

Gamitin ang talahanayang ito upang pumili ng sukat batay sa tanong, hindi upang pumili ng tanong batay sa sukat.

Sa pinakamababa, upang maging kapani-paniwala ang isang pahayag, kailangang gamitin ang parehong mga konsentrasyon ng pangkulay—100 nM, 300 nM, 1 uM, at 2 uM—sa pagsukat ng daloy ng oxygen sa mga kondisyong may pagtagas, ADP, oligomycin, at uncoupler; bilis ng sintesis ng ATP; potensiyal ng lamad gamit, kung maaari, ang dalawang probe; at naka-calibrate na paglabas ng peroxide na may catalase at mga kontrol na walang selula. Iulat ang magkakaugnay na hanay: daloy ng oxygen kasama ang bilis ng ATP, ATP sa bawat oxygen, potensiyal, at peroxide. Alinman sa mga bilang na iyon, kapag nag-iisa, ay isang sukat na naghahanap pa ng kahulugan.