Paglamlam ng mga selula ng pisngi gamit ang methylene blue: ano ang dapat obserbahan

Naglalagay ang isang mag-aaral ng isang patak ng suspensiyon ng mga selula ng pisngi sa isang slide, tumitingin sa mikroskopyo, at halos walang nakikita. May ilang maputlang hugis na parang multo na lumulutang sa maliwanag na larangan. Inaayos niya ang pokus, saka dinaragdagan ang liwanag, at pagkatapos ay ipinapalagay na walang laman ang slide. Hindi walang laman ang slide. Naroon ang mga selula. Halos transparent ang mga ito, at ang pagiging transparent na iyon ang mismong problemang nilulutas ng pangkulay na ito.

Mahalagang ipaliwanag ang pagkakaiba ng inaasahan at ng nakikitang larawan bago simulan ang protokol. Inaasahan ng mga baguhan na ilalantad ng mikroskopyo ang mga detalye gaya ng pag-zoom ng kamera sa isang malayong karatula. Mas limitado ang ginagawa ng mikroskopyong may maliwanag na larangan: ipinapakita nito ang mga pagkakaiba sa pagsipsip ng liwanag. Halos walang liwanag na sinisipsip ang selula ng pisngi na hindi nilamlam, kaya halos wala itong naidaragdag na pagkakaiba. Idinaragdag ng methylene blue ang pagkakaibang iyon. Hindi pantay ang pagkakabigkis nito sa loob ng selula, kaya nagiging nakikitang contrast ang estruktura. Kapag naunawaan ito ng mga mag-aaral, bawat kasunod na hakbang ay makikita nilang bunga ng konsepto sa halip na basta mga tagubiling susundin.

Makatutulong dito ang kaalaman kung paano nagdaragdag ng contrast ang simpleng paglamlam sa laboratoryo ng paaralan, at ang pagbabalik-aral sa paghahanda ng mikroskopyong may maliwanag na larangan bago maglamlam ay makaiiwas sa kalahati ng mga hindi matagumpay na slide. Tinatalakay ang kimika sa likod ng kulay sa panimula sa methylene blue sa mikroskopiya, na nagpapaliwanag kung bakit palaging ginagamit ang partikular na pangkulay na ito sa laboratoryo.

Ang protokol sa klase

Ang bersiyong wet mount sa ibaba ang mas simpleng karaniwang pagpipilian para sa mga pangkalahatang klase. Hindi ito nangangailangan ng apoy o hakbang ng fiksasyon. Ang bersiyong fixed smear na ginagamit sa ilang manwal sa kolehiyo ay may karagdagang pagpapatuyo sa hangin at maikling fiksasyon gamit ang init, gaya ng gawain sa pahid ng selula ng pisngi ng North Central Texas College na inilathala sa Biology LibreTexts, ngunit ang fiksasyon gamit ang init ay isang nakagawiang pamamaraan sa mikrobiyolohiya, hindi isang pangangailangan para makita ang mga selulang epiteliyal.

Mga kailangan: malilinis na slide at coverslip, isteril na pamunas na minsanan lamang gagamitin (mas mainam) o mga bagong patag na toothpick, boteng may pampatak na naglalaman ng 0.5 hanggang 1 percent na methylene blue sa tubig, tubig na distilled o deionized, papel na pansipsip, guwantes, at compound microscope na may kabuuang pagpapalaki na 100x at 400x.

1. Banlawan ang bibig ng karaniwang tubig. Inaalis nito ang mga piraso ng pagkain na kalaunan ay matitingkad na malalamlam at makagagambala sa pagtingin sa mga selula.
2. Ang bawat mag-aaral ay kukuha lamang ng sampol mula sa sarili niyang pisngi. Marahang haplusin ang loob ng pisngi gamit ang bagong isteril na pamunas. Idiin, huwag kayurin. Tumigil bago pa magkaroon ng anumang kirot o pagdurugo.
3. Igulong ang pamunas sa gitna ng malinis na slide upang makagawa ng manipis na pahid. Ang manipis na sapin ang pinakamahalagang batayan kung magiging malinaw ang mga selula sa slide. Ang makapal na puting deposito ay magiging asul na kumpol na hindi maaninag ang detalye kapag nilamlam.
4. Maglagay ng isang patak ng methylene blue sa pahid. Iwan ito nang 1 hanggang 3 minuto. Sapat na ang isang minuto sa maraming protokol sa kolehiyo; gumagamit ang manwal sa laboratoryo ng agham ng NCERT Class IX ng humigit-kumulang 3 minuto para sa pansamantalang mount. Hindi mas mabuti ang mas matagal, at ang sobrang paglamlam ang pinakakaraniwang pagkakamali sa tiyempo.
5. Marahang banlawan ng distilled na tubig o sipsipin ang sobrang pangkulay gamit ang papel na pansipsip, alinsunod sa protokol ng inyong laboratoryo. Dapat maging mapusyaw na asul ang likuran, hindi madilim na navy blue.
6. Ibaba ang coverslip nang nakatagilid upang isang gilid muna ang dumampi, saka dahan-dahang ibaba ang natitira. Iniiwasan nito ang pagkulong ng mga bula ng hangin.
7. Magsimula sa mababang pagpapalaki upang mahanap ang mga selula, tiyaking nakapokus at nasa gitna ang mga ito, saka lumipat sa 100x at sa huli ay 400x. Sa 400x, ang pino lamang na pang-ayos ng pokus ang gamitin.

Kailangang linawin ang konsentrasyon ng pangkulay. Karamihan sa mga protokol ng paaralan ay gumagamit ng humigit-kumulang 1 percent na methylene blue sa tubig. Ang mas matapang na nakahandang solusyon o mas mahabang pagbabad ay mas mabilis na nagpapadilim sa likuran kaysa sa nukleo, kaya nababaligtad ang contrast na kailangan sa gawain.

Ligtas na paghawak sa materyal mula sa pisngi

May kasamang laway at karaniwang mga mikroorganismo ng bibig ang mga sampol mula sa pisngi, kaya ituring ang bawat bagong pahid bilang materyal na maaaring makapagdulot ng impeksiyon kahit malulusog na kaklase ang mga nagbigay ng sampol. Inilalahad ng mga gabay sa biosafety ng American Society for Microbiology para sa mga laboratoryong panturo ang mga pangkalahatang prinsipyo: tasahin ang panganib bago ang sesyon, magsuot ng guwantes, protektahan ang mga mata kung posibleng may tumalsik, maghugas ng kamay pagkatapos, disimpektahin ang mga mesa sa laboratoryo, at itapon ang mga kontaminadong gamit na minsanan lamang gamitin sa aprubadong sistema para sa biyolohikal na basura.

Saklaw ng apat na tuntunin sa klase ang karamihan sa mga panganib. Isang tagapagbigay ng sampol lamang sa bawat pamunas at bawat slide; huwag magbahagi ng mga ito. Kumuha lamang ng sariling sampol, hindi mula sa katabi. Diretso sa itinalagang lalagyan ng basura ang mga pamunas at toothpick na minsanan lamang gamitin, hindi ibabalik sa mesa. Ang methylene blue mismo ay nag-iiwan ng kulay sa balat at damit at nakaiirita sa mga mata, kaya kailangan ang guwantes at karaniwang pag-iingat sa paghawak ng pangkulay. Huwag palawakin ang gawaing ito upang magparami ng anumang mikroorganismo mula sa pahid, at huwag basta magsagawa ng fiksasyon gamit ang init sa sariwang materyal mula sa tao nang hindi alinsunod sa pamamaraang pangkaligtasan ng paaralan.

Ano ang dapat obserbahan, at bakit ganoon ang hitsura nito

Sa 100x, hanapin ang malalapad at patag na selulang mapusyaw na asul, na may hindi regular na hugis obalo o poligono. Magkakahiwalay ang mga ito o nasa maluluwag na sapin na magkakapatong. Karaniwang may isang mas madilim na asul na batik ang bawat selula. Ang batik na iyon ang nukleo. Pansinin din ang pagkakaayos: ang mga selulang squamous epithelial ay parang maninipis na baldosa, hindi mga bola, kaya ang mga gilid nila ay mukhang bitak-bitak na glaze sa halip na mga bilog na lobo.

Sa 400x, tatlong katangian ang malinaw na makikita. Lumilitaw ang hangganan ng selula bilang manipis at mas madilim na guhit na nakapalibot dito. Pinupuno ng sitoplasma ang loob ng banayad at pantay na asul. Mas madilim at mas siksik ang nukleo, madalas na hugis obalo, at karaniwang malapit sa gitna ngunit hindi palagi. Ipatala sa mga mag-aaral ang tatlong ito kasama ang hugis at pagpapalaki, dahil iyon mismo ang hinihingi sa sagutang papel.

May isang mahalagang punto tungkol sa katumpakan dito na mali sa maraming sagutang papel. Ang nakikitang hangganan ay tumutugma sa rehiyon ng membrana ng plasma, ngunit ang mismong membrana, isang dobleng sapin ng lipid na humigit-kumulang 7 hanggang 10 nanometers ang kapal, ay napakaliit upang malinaw na makita ng mikroskopyo sa paaralan. Ang nakikita ng mga mag-aaral ay ang optikal na gilid ng selula kasama ang pangkulay na naipon doon. Ganoon din ang pag-iingat tungkol sa mga organel. Hindi makikita sa preparasyong ito ang mitochondria, endoplasmic reticulum, mga Golgi body, at ribosome. Kayang malinaw na maipakita ng karaniwang mikroskopyong gumagamit ng liwanag ang mga detalye hanggang humigit-kumulang 0.2 micrometers sa mabuting kondisyon, gaya ng paliwanag sa batayang talakayan ng NCBI sa biyolohiya ng selula tungkol sa mga kasangkapan sa mikroskopiya, at karamihan sa mga napakapinong estruktura ay mas maliit o malapit sa limitasyong iyon. Ang mas mataas na pagpapalaki na walang dagdag na resolusyon ay nagpapalaki lamang ng larawan nang walang idinaragdag na detalye.

Bakit pinakamadilim ang paglamlam sa nukleo? Ang methylene blue ay isang kationikong pangkulay, na may positibong karga sa solusyon, at kumakabit ito sa materyal na may negatibong karga sa selula, lalo na sa mga asidong nukleiko. Nakasentro ang DNA sa chromatin sa nukleo, kaya pinakamaraming pangkulay ang naiipon sa nukleo. May RNA at iba pang molekulang may karga ang sitoplasma, kaya nalalamlam din ito, ngunit mas kalat at mas mapusyaw. Ang mahalagang paglilinaw: hindi espesipiko sa DNA ang pangkulay na methylene blue. Inilalarawan sa pananaliksik tungkol sa distribusyon ng methylene blue sa pagkuha ng larawan ng nukleo ang pagkakaugnay ng kation sa mga rehiyong mayaman sa asidong nukleiko, at natuklasan sa mas naunang kwantitatibong pananaliksik tungkol sa pagkakabigkis ng methylene blue sa mga preparasyon ng selula na karamihan sa nakabigkis na pangkulay ay nauugnay sa mga asidong nukleiko. Kaya ang madilim na nukleo at mapusyaw na sitoplasma ay isang padron ng contrast, hindi isang pagsusuri sa mga molekula.

Mga pagkakamaling magagawa ng mga mag-aaral, at paano unawain ang mga ito

Halos bawat hindi matagumpay na slide ay nabibilang sa isa sa limang padron. Turuan ang mga mag-aaral na tukuyin ang problema sa slide sa halip na basta ulitin ang paggawa nito.

Dahil sa sobrang paglamlam, nagiging pantay na madilim ang mga selula at likuran kaya hindi na maihiwalay ang nukleo sa nakikitang larangan. Ayusin ito sa pamamagitan ng mas maikling oras ng paglamlam o mas masusing pagbanlaw. Ang kulang na paglamlam ay nag-iiwan ng mga hugis na parang multo na nawawala kapag dinagdagan ang liwanag; dagdagan ang oras nang tig-tatlumpung segundo. Ang makakapal na pahid ay nagbubunga ng siksik at magkakapatong na kumpol na walang malinaw na balangkas; mekanikal ang pagwawasto—gawing mas manipis ang pahid sa susunod, dahil walang pagbanlaw ang makaaayos sa isang bunton ng mga selula. Lumilitaw ang mga bula ng hangin bilang perpektong bilog na may malinaw at madilim na gilid at nakagagambala sa mga baguhang napagkakamalan ang mga ito bilang mga estruktura; muling ilagay ang coverslip nang dahan-dahan at nakatagilid. Ang maliliit na madidilim na tuldok na nakakalat sa ibabaw o paligid ng mga selula ay karaniwang mga normal na bakterya ng bibig, gaya ng binabanggit sa mga protokol ng paaralan tulad ng pamamaraan ng Ingrid Science para sa mga selula ng pisngi. Pinatutunayan ng mga ito na may mga organismong naninirahan sa bibig, na maaaring tumatak sa isip ng mga mag-aaral, ngunit hindi matutukoy ang species ng mga ito sa gawaing ito at hindi dapat iguhit bilang mga bahagi ng selula. Hindi pantay at matindi ang paglamlam sa mga tira ng pagkain at hibla ng mucus; kaya may paunang pagbanlaw upang mabawasan ang mga ito.

Ano ang hindi kayang gawin ng gawaing ito

Isa itong obserbasyong pang-edukasyon, hindi isang pagsusuri para sa diyagnosis. Walang anumang aspeto ng hitsura ng selula sa paglamlam sa klase ang makapagbibigay ng diyagnosis ng impeksiyon, kanser, o anumang sakit, at hindi dapat basahin ang artikulo na para bang iba ang ipinahihiwatig nito. Ipinapakita ng preparasyon ang hugis, hangganan, sitoplasma, at nukleo sa dalawang antas ng pagpapalaki. Hindi nito ipinapakita ang napakapinong estruktura ng membrana, mga detalye ng organel, o identidad ng mga molekula. Ang tahasang pagsasabi ng limitasyon ay nagpoprotekta kapwa sa agham at sa mga mag-aaral: ang magandang resulta ay isang guhit na may tamang mga label at nakatalang pagpapalaki at pangkulay, hindi isang konklusyon tungkol sa kalusugan.

Sagutang papel ng mag-aaral at mga mikrograf na may mga label

Ang dalawang materyal ng proyekto para sa pahinang ito ay ang mikrograf na may mga label sa itaas at ang sagutang papel sa ibaba. Maglimbag ng tig-isang sagutang papel para sa bawat mag-aaral o ipakita ito gamit ang projector at ipakopya sa kanila ang mga kahon sa kanilang mga kuwaderno.

Paano ito gamitin sa sesyong apatnapu't limang minuto: sampung minuto para sa pagpapaliwanag ng kaligtasan at pagkuha ng sampol, sampung minuto para sa paglamlam at paghahanda ng mount, labinlimang minuto para sa obserbasyon at pagguhit sa parehong antas ng pagpapalaki, at sampung minuto para sa talaan ng mga dapat suriin at paghahambing sa mikrograf na may mga label. Sadyang nakatuon sa mga tiyak na hakbang ang mga bagay sa talaan. Manipis na pahid, tamang oras ng paglamlam, nukleong mas madilim kaysa sitoplasma, at nakatalang pagpapalaki. Ang mag-aaral na makapagmamarka sa lahat ng apat ay nakaunawa sa konseptong layong ituro ng aralin: ipinapakita ng mga mikroskopyo ang mga pagkakaiba, at lumilikha ang mga pangkulay ng mga pagkakaibang mahalagang makita.