New methylene blue at paglamlam ng reticulocyte: isang hiwalay na pangkulay at pamamaraan para sa buhay na selula

Naghahanda ang isang estudyante para sa pagbilang ng reticulocyte, umoorder ng methylene blue, hinahalo ito sa dugo, at halos walang nakikita. Gumagamit ang isang kaklase ng boteng may label na new methylene blue at nakakakita ng malinaw na mga asul na hibla sa ilan sa mga pulang selula. Ipinapalagay ng unang estudyante na mas sariwa o mas puro ang laman ng ikalawang bote. Hindi ito alinman sa dalawa. Ibang molekula ang laman nito.

Ito ang maling konsepto sa likod ng karamihan ng kalituhan sa paksang ito. Ipinahihiwatig ng pangalan na ang new methylene blue ay isang pinahusay na batch ng methylene blue. Iba ang sinasabi ng kimika. Ang new methylene blue N ay isang hiwalay na phenothiazine na pangkulay na may sarili nitong Colour Index number, sariling pattern ng mga substituent, at sariling pamantayang gamit sa hematolohiya. Kapag malinaw na ang pagkakaibang iyon, madaling maunawaan ang natitirang bahagi ng pamamaraan: kung bakit kailangang buhay ang mga selula habang nilalamlam, ano ang maituturing na reticulocyte, paano nauugnay ang mga Heinz body, at kailan ginagamit ang brilliant cresyl blue.

Ang maikling sagot

Ang new methylene blue N, ang reagent sa hematolohiya, ay karaniwang tinutukoy bilang Basic Blue 24 sa tala ng PubChem para sa new methylene blue, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, na may formula na C18H22ClN3S. Ang karaniwang methylene blue ay methylthioninium chloride, Basic Blue 9, sa tala nito sa PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, na may formula na C16H18ClN3S. Sa estruktura nito, may dalawang methyl group sa singsing at mga ethylamino side chain ang new methylene blue, samantalang may mga dimethylamino group ang methylene blue. Binabago ng pagkakaibang iyon ang katangian ng paglamlam. Inilalarawan ng mga aklat sa hematolohiya ang karaniwang methylene blue bilang hindi gaanong mahusay na panglamlam ng reticulocyte, at ang new methylene blue bilang nagbibigay ng mas matindi at mas pantay na kulay. Binubuod ang paghahambing na ito sa paksa ng ScienceDirect tungkol sa new methylene blue.

Oo, ang new methylene blue ay isang supravital na panglamlam. Ang supravital na paglamlam ay nangangahulugang paglamlam sa mga buhay na selula matapos alisin sa katawan at bago ang fixation, ayon sa kahulugan sa pagsusuri ng NCBI tungkol sa mga prinsipyo ng supravital na paglamlam. Kabilang sa kategoryang ito ang new methylene blue at brilliant cresyl blue, at tahasang tinatalakay ng pamantayan ng CLSI para sa reticulocyte ang new methylene blue bilang supravital na pangkulay. Kung minsan, itinuturing ito ng mga estudyante na katulad ng Romanowsky na paglamlam sa mga smear na sumailalim sa fixation. Hindi angkop dito ang ganoong pag-unawa. Kapag inuna ang fixation, hindi na gagana ang pamamaraan.

Para sa mga mambabasang sumusubaybay sa magkakahawig na pangalan ng pangkulay, tinatalakay ng methyl blue kumpara sa methylene blue ang ibang mas malawak na kalituhan sa pagitan ng isang anionic na triarylmethane na pangkulay at ng cationic na pamilyang phenothiazine. Inilalagay ng pangkalahatang gabay sa paglamlam sa laboratoryo ang supravital na pamamaraan sa konteksto ng mga pamamaraan para sa mga smear na sumailalim sa fixation, at ipinapakita ng gabay sa morpolohiya ng mga selula ng dugo kung saan kabilang ang pagsusuri ng reticulocyte sa mas malawak na differential count.

Isang paalala tungkol sa mga katalogo: may hiwalay na anyong zinc chloride double salt ng new methylene blue sa ilalim ng CAS 6586-05-6. Kaya dapat tukuyin sa seksiyon ng mga pamamaraan ang anyo ng asin at ang supplier, hindi lamang ang karaniwang pangalan.

Ano talaga ang ginagawa ng supravital na paglamlam

Ang reticulocyte ay isang batang pulang selula na nawalan na ng nucleus ngunit may natitira pang ribosomal RNA. Hindi nakikita ang RNA na iyon sa isang hindi nilamlam na basang preparasyon. Pumapasok ang supravital na pangkulay sa buhay na selula at pinapamuo o pinagsasama-sama ang RNA na iyon upang maging mga asul na butil at hibla, ang reticulofilamentous na materyal na nakikita sa ilalim ng oil immersion. Samakatuwid, ang mala-lambat na anyo ay produkto ng paglamlam, hindi isang dati nang balangkas na naghihintay lamang ng kulay. Ito ang dahilan kung bakit kasinghalaga ng pangalan ng pangkulay ang mga salik sa protokol: konsentrasyon ng pangkulay, buffer, proporsiyon ng dugo sa pangkulay, temperatura, at oras.

Ang praktikal na bunga nito ay isang mahigpit na pagkakasunod-sunod ng mga hakbang: ihalo muna ang dugong may anticoagulant sa pangkulay, i-incubate, saka gumawa ng mga smear at suriin ang mga ito nang walang fixation at walang counterstain. Sinisira ng fixation bago ang paglamlam, o ng counterstain na tumatakip sa mapupusyaw na hibla, ang impormasyong pinagbabatayan ng pagbilang.

Isang magagamit na protokol para sa reticulocyte gamit ang new methylene blue

Walang iisang pormulasyong ginagamit sa lahat ng pagkakataon, kaya iulat kung alin ang ginamit. Ipinapakita ng tatlong dokumentadong baryante ang saklaw ng mga pagpipilian.

Gumagamit ang klasikong pamamaraang Brecher ng humigit-kumulang 0.5 percent na new methylene blue na may potassium oxalate, na inihahalo sa kapantay na dami ng dugong may EDTA na nahalo nang mabuti, at ini-incubate nang mga 10 hanggang 15 minutes sa temperatura ng silid. Pagkatapos ng banayad na muling paghahalo, gumagawa ng maninipis na smear na hugis-kalso, pinatutuyo sa hangin, at sinusuri nang walang fixation gamit ang 100x oil objective. Inilalarawan ng pamamaraan ng NCBI para sa pagbilang ng reticulocyte ang daloy ng gawaing ito at ang balangkas sa pagbilang na ginagamit kasama nito.

Gumagamit ang baryanteng Dacie at Lewis ng 1.0 percent na new methylene blue sa citrate saline, na inihahalo sa 2 hanggang 4 na bahagi ng dugo para sa bawat bahagi ng pangkulay at pinananatili sa 37 C nang 15 hanggang 20 minutes bago gumawa ng smear. Isang kamakailang pagpapatupad ng pagsasama-sama ng mga pamamaraan para sa protokol na CLSI H44 ang gumamit ng mas mababang konsentrasyong 0.1 percent na solusyon sa phosphate buffered saline sa pH 7.4, na may incubation sa 20 C nang 10 minutes at walang fixation, gaya ng iniulat sa pag-aaral noong 2026 tungkol sa pagkakatugma ng mga pamamaraan ng NMB.

Pare-pareho ang mga tuntunin sa pagbilang sa lahat ng baryante. Bilangin ang isang selula bilang reticulocyte kapag mayroon itong hindi bababa sa dalawang magkahiwalay na butil o bahagi ng hibla na nalalamlam ng asul; sa gayon, hindi isinasama ang nag-iisang deposito ng panglamlam. Magbilang ng hindi bababa sa 1,000 pulang selula sa karaniwang pagsusuri at iulat ang reticulocyte bilang porsiyento. Kapag mababa ang porsiyento, mas maraming selula ang kailangan ayon sa estadistika. Binabanggit sa isang pagsusuri ng metodolohiyang CLSI H44 na kapag malapit sa 1 percent ang reticulocyte, humigit-kumulang 4,400 selula ang kailangan upang mapababa sa 5 percent ang pagkakaiba-iba sa pagbilang, ayon sa pagsusuri ng CLSI H44 sa De Gruyter. Ginagawang praktikal ng Miller ocular disc ang pagbilang ng maraming selula. Salain o maghanda ng bagong pangkulay, dahil ginagaya ng namuong pangkulay ang mga butil-butil na inklusyon.

Mga Heinz body sa parehong preparasyon

Maaari ring makita sa parehong supravital na smear ang mga Heinz body, na mga kumpol ng hemoglobin na na-oxidize at na-denature, sa halip na natitirang RNA. Sa mga preparasyong gumagamit ng new methylene blue, lumilitaw ang mga ito bilang mga bilog na katawan, madalas ay nag-iisa at malapit sa lamad, na mas mapusyaw ang asul kaysa sa reticulofilamentous na materyal. Hindi sila gaanong napapanatili sa fixation at counterstaining, kaya suriin ang smear nang walang fixation. Isang kamakailang protokol na gumamit ng 20 microliters ng dugong may EDTA kasama ang 20 microliters ng 1 percent na new methylene blue at 15 minutes na incubation ang nagbilang ng mga selulang positibo sa Heinz body sa 250 erythrocyte, ayon sa pag-aaral sa PMC na nag-ulat ng pamamaraang iyon.

Dalawang pagkakaiba ang nakatutulong upang maiwasan ang maling pagbasa. Una, mas matindi ang paglamlam ng methyl violet at crystal violet sa mga Heinz body kaysa sa new methylene blue, gaya ng binanggit sa paksa ng ScienceDirect tungkol sa Heinz body. Ang new methylene blue ang maginhawang pagpipilian kapag sabay na sinusuri ang mga reticulocyte at Heinz body, ngunit hindi ito ang pinakamalakas na pangkulay na nakalaan para sa Heinz body. Ikalawa, ang mga inklusyong HbH sa alpha thalassemia trait ay lumilikha ng maraming maliliit na tuldok sa buong selula pagkatapos ng supravital na paglamlam, samantalang ang mga karaniwang Heinz body ay mas kaunti, mas malaki, at madalas na kaugnay ng lamad. Ang deposito ng panglamlam ang ikatlong maaaring mapagkamalan: nasa labas ito ng focal plane ng mga selula at nag-iiba sa bawat larangan ng tanaw.

Brilliant cresyl blue kumpara sa new methylene blue

Parehong supravital na panglamlam ng reticulocyte ang dalawang pangkulay, ngunit mas pinapaboran ng standardisasyon ang isa. Ang pamamaraang CLSI H44-A2 para sa reticulocyte, na binuo kasama ang International Council for Standardization in Haematology at nakalista sa pahina ng pamantayang CLSI H44, ay nagtatalaga sa paglamlam ng dugong may EDTA gamit ang new methylene blue bilang manwal na pamamaraang batayan ng paghahambing. Sumasang-ayon ang klasikong pagtuturo sa hematolohiya tungkol sa hitsura: nagbibigay ang new methylene blue ng mas matindi at mas pantay na paglamlam ng mga hibla, samantalang mas nag-iiba ang brilliant cresyl blue sa bawat batch at sample.

Kailangang linawin ang limitasyon ng katayuang iyon. Tinatanggap ng gabay ng ICSH sa pagsusuri ng analyzer ang manwal na mikroskopiya gamit ang new methylene blue bilang batayang paraan ng paghahambing, ngunit inilalarawan ito bilang subhetibo at medyo kulang sa presisyon. Mas pinipili ang mga pamamaraang batayan na gumagamit ng flow cytometry kung mayroon. Isang paghahambing noong 2022 sa 100 specimen ang nakakita ng mas mababang bias kaugnay ng analyzer nito gamit ang brilliant cresyl blue kaysa sa new methylene blue, gaya ng iniulat sa paghahambing ng mga pamamaraan ng paglamlam sa PMC. Ang buod na may sapat na batayan para sa mga estudyante: gamitin ang new methylene blue bilang pamantayang manwal na batayan ng paghahambing, beripikahin ang anumang lokal na pamamaraan gamit ang brilliant cresyl blue laban dito o laban sa awtomatikong pagsusuri, at asahan ang mas malawak na pagkakaiba-iba ng resulta mula sa manwal na mikroskopiya alinman ang gamitin. Itinaguyod din ng mas lumang literatura tungkol sa standardisasyon ang puripikadong Azure B bilang alternatibong mas dalisay sa kimika dahil nag-iiba ang mga komersiyal na batch ng pangkulay, ayon sa pag-aaral ni Marshall tungkol sa Azure B. Ipinapaliwanag nito kung bakit tinatalakay pa rin ang grado ng reagent sa mga usapin tungkol sa pamamaraan.

Pag-iwas sa mga karaniwang pagkakamali

Apat na pagkakamali ang dahilan ng karamihan sa mga bigong preparasyon. Ang pag-order ng karaniwang methylene blue sa halip na new methylene blue N ay nagdudulot ng mahinang paglamlam dahil sa kimika, hindi sa teknik. Inaalis ng fixation o counterstaining bago ang pagbasa ang supravital na senyal. Ang pagbilang sa namuong panglamlam bilang mga butil ay nagpapataas nang mali sa resulta; naiiwasan ito ng tuntunin ng dalawang butil at ng sinalang pangkulay. Ang pagbilang ng napakakaunting selula kapag mababa ang porsiyento ng reticulocyte ay nagbibigay ng numerong mukhang may mataas na presisyon ngunit malawak ang mga limitasyon ng kumpiyansa. Iisa ang karaniwang palatandaan ng bawat pagkakamali: sinisisi ng tagasuri ang mikroskopyo sa resultang naitakda na ng hakbang na may kinalaman sa reagent.