Methylene blue, Nrf2, at pagbuo ng bagong mitochondria: ano ang nasukat at ano ang panukala pa lamang

Madalas lumitaw ang isang pangungusap sa mga sulatin tungkol sa methylene blue: pinapagana nito ang Nrf2 at bumubuo ito ng bagong mitochondria. Tila iisang pahayag ito, ngunit naglalaman ito ng dalawang magkaibang konsepto na pinag-aralan sa magkaibang sistema, gamit ang magkakaibang uri ng ebidensiya. Ang una ay isang landas ng pagsesenyas, isang sensor na nagpapagana sa mga gene para sa depensa. Ang ikalawa ay isang programa ng pagbuo, kung saan gumagawa ang selula ng mas maraming makinaryang mitochondrial. Maaaring magpasimula ng pagbuo ang isang senyas, ngunit ang pagpapakitang gumana ang senyas ay hindi katumbas ng pagpapakitang naitayo ang gusali, at ang pagpapakitang mas marami ang materyales sa pagtatayo ay hindi katumbas ng pagpapakitang mas mahusay ang suplay ng enerhiya. Pinananatiling magkahiwalay ng artikulong ito ang tatlong bagay na iyon.

Ang konsepto ng Nrf2: isang sensor, hindi isang kalasag

Ang Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) ay isang salik ng transkripsiyon, isang protinang ang tungkulin ay paganahin ang mga gene. Sa karaniwang kalagayan na walang pagpapasigla, pinananatili ito sa cytoplasm ng isang sensor na protinang tinatawag na Keap1, na ipinapasa ito sa makinarya ng selula para sa pagtatapon upang patuloy itong masira. Kapag binago ng mga oxidant o electrophile ang mga reaktibong cysteine sa Keap1, humihinto ang pagtatapon. Naiipon ang bagong gawang Nrf2, lumilipat sa nucleus, nakikipares sa maliliit na protinang Maf, at kumakabit sa mga sekuwensiya ng DNA na tinatawag na antioxidant response elements. Pinapagana ng pagkakabit na iyon ang isang hanay ng mga gene para sa depensa.

May mga tiyak na karaniwang panukat para sa landas na ito. Ang NQO1 (NAD(P)H quinone dehydrogenase 1) at TrxR1 (thioredoxin reductase 1) ay kabilang sa mga pinakamaaasahang target na gene ng Nrf2. Madaling mapataas nang malaki ang HO-1 (heme oxygenase-1), ngunit tumutugon din ito sa ibang mga tagapagsaayos. Ang mga ensima tulad ng SOD at catalase ay bahagi ng makinaryang antioxidant, ngunit kinokontrol ang kanilang mga antas ng maraming salik ng transkripsiyon, kaya ang pagtaas ng SOD lamang ay hindi patunay na Nrf2 ang dahilan. Ang ebidensiyang pinakamalapit sa mismong pangyayari ng pagsesenyas ay ang pag-ipon ng Nrf2 sa nucleus, pag-activate ng isang ARE reporter, o pagpapataas ng mga kinikilalang target na nawawala kapag inalis ang Nrf2. Ang lahat ng iba pa—mas mababang antas ng oxidant, mas mahusay na pagkaligtas sa stress, mas mataas na glutathione—ay mga kasunod na epekto na maaaring likhain ng maraming landas.

Ang pinakamaagang resulta tungkol sa methylene blue sa kuwentong ito ay nasa bahaging malapit sa pangyayari ng pagsesenyas sa sukatan na iyon. Ang mga fibroblast na nalantad sa nanomolar na methylene blue ay nagpakita ng naantalang pagtanda ng selula, kasabay ng mas mataas na dami ng complex IV, mas mataas na pagkonsumo ng oxygen, at pagpapataas ng mga ensima ng phase-2 na TrxR1 at NQO1, gaya ng iniulat sa pag-aaral na unang nag-ugnay sa methylene blue sa pagpapahusay ng mitochondria at pagkaantala ng pagtanda ng selula. Ang TrxR1 at NQO1 mismo ang mga kinikilalang target ng Nrf2 na nais makita ng isang maingat na mambabasa. Ang hindi ipinakita ng pag-aaral ay ang mismong pangyayari ng pagsesenyas: walang pagsukat ng Nrf2 sa nucleus, walang ARE reporter, at walang kontrol na may Nrf2 knockout. Kaya ang tapat na pagbasa ay pinapataas ng methylene blue ang mga kilalang target na gene ng Nrf2 sa sistemang ito, na naaayon sa pag-activate ng Nrf2 ngunit hindi naihihiwalay ang Nrf2 bilang sanhi. Ang pagpapataas ng isang target na gene ay isang hakbang pagkatapos ng pag-on ng switch.

Ang konsepto ng biogenesis: isang programang may tatlong yugto ng pagsusuri

Ang mitochondrial biogenesis ay ang programang ginagamit ng selula upang dagdagan ang kapasidad ng mitochondria. Ang hirarkiyang inilalarawan sa mga aklat-aralin ay dumaraan sa tatlong yugto ng pagsusuri. Una, pinapagana ng coactivator na PGC-1alpha ang programa. Ikalawa, itinutulak ng mga salik ng transkripsiyon sa nucleus ang ekspresyon ng mga mitochondrial gene, kabilang ang TFAM, na nagpapanatili at nagpaparami ng mitochondrial DNA. Nakalilito na ang isa sa mga salik na ito ay pinangalanang NRF1, nuclear respiratory factor 1, na ibang protina kaysa Nrf2. Ikatlo, nagkakaroon ang selula ng mas maraming mitochondrial genome at mas maraming makinarya ng respirasyon, na nasusukat bilang bilang ng kopya ng mtDNA, aktibidad ng citrate synthase, o dami at aktibidad ng mga respiratory complex.

Magkakaiba ang lakas ng pahayag na sinusuportahan ng bawat yugto kumpara sa nauna. Ipinapakita ng mas mataas na messenger RNA ng PGC-1alpha o TFAM na hiniling ang programa, hindi na natapos ito. Ipinapakita ng mas maraming mtDNA o protina ng complex IV na mas marami ang materyal, ngunit maaari ring magmukhang ganoon ang mitochondria na muling inayos. Ipinapakita ng mas mahusay na respirasyon, mas mataas na pagkonsumo ng oxygen o aktibidad ng complex, na nagbago ang paggana, ngunit maaaring bumuti ang paggana nang walang anumang bagong mitochondria. Pinagsasama ng isang matibay na pahayag tungkol sa biogenesis ang tatlo: tagapagsaayos, dami ng materyal, at paggana.

Sinundan ng kasunod na pag-aaral sa fibroblast ang karamihan sa magkakaugnay na hakbang na iyon. Sa mga selulang IMR90 ng tao na nilagyan ng 100 nanomolar na methylene blue, pansamantalang tumaas ang ratio ng NAD sa NADH sa loob ng 15 minutes at bumalik sa paunang antas sa loob ng isang araw. Sinundan ang pansamantalang senyas ng enerhiya na iyon ng pansamantalang phosphorylation ng sensor ng enerhiya na AMPK, pagkatapos ay ng pagpapataas ng PGC-1alpha at SURF1, isang protinang kailangan upang buuin ang gumaganang complex IV. Humigit-kumulang dumoble ang aktibidad ng complex IV, bumaba nang mga 28 percent ang mga oxidant sa selula, at mas mabagal na umikli ang mga telomere. Inilalahad ang buong pagkakasunod-sunod sa papel na nag-uugnay sa aktibidad na redox ng methylene blue sa AMPK at mitochondrial biogenesis.

Dalawang detalye sa papel na iyon ang dapat pagtuunan ng pansin dahil karaniwang hindi naisasama ang ganitong mga detalye. Una, mas mahalaga ang padron kaysa sa pagkakaroon lamang ng pag-activate: pansamantalang pinagana ng methylene blue ang AMPK, samantalang matagal itong pinagana ng gamot na ginamit na pamantayan, ang AICAR, at humigit-kumulang walong beses na mas epektibo ang pansamantalang activator sa pag-antala ng pagtanda ng selula. Kaya hindi kumpleto ang pahayag na "pinapagana ng methylene blue ang AMPK"; ang mahalagang pahayag ay pansamantala nitong pinapagana ang AMPK, at ipinahihiwatig ng paghahambing na hindi pareho ang nagagawa ng pangmatagalang pag-activate. Ikalawa, hindi binago ng methylene blue ang siklo ng selula, kaya naaalis ang pinakasimpleng alternatibong paliwanag: na mas mabagal lamang nahati ang mga selula at dahil dito ay nagmukhang mas bata.

Ang sangay ng pag-aaral sa daga: pag-uugali, mga genome, at isang sadyang kabalintunaang pampasimula

Pinalawak sa mga hayop ang gawain sa mga kulturang selula ng isang pangkat na nag-aaral ng mga dagang nasa gitnang edad. Pagkatapos ng 60 days ng methylene blue na ibinigay sa bibig, mas napanatili ng mga dagang nakatanggap nito ang kanilang pisikal na tibay at pag-uugaling mapaggalugad, at nagpakita sila ng mas kaunting pag-uugaling kahawig ng pagkabalisa kaysa sa matatandang dagang hindi nakatanggap nito. Sa tisyu ng utak, ang mga gene na pinahina ng pagtanda—NRF1, TFAM, SOD2, at ang subunit na COX1 ng complex IV—ay naibalik patungo sa mga antas ng mga ganap na hustong-gulang na daga, at tumaas ang bilang ng kopya ng mtDNA. Ang mga resultang iyon—pag-uugali, kasama ang tagapagsaayos at dami ng genome—ay iniulat sa pag-aaral sa mga dagang nasa gitnang edad tungkol sa methylene blue at mitochondrial biogenesis sa utak.

Ang iminungkahing pampasimula ang kawili-wiling bahagi, dahil salungat ito sa simpleng paliwanag na antioxidant ang methylene blue. Nagpakita ang mga dagang nakatanggap nito ng mas mataas na paglikha ng reactive oxygen species sa mitochondria ng utak, partikular ng hydrogen peroxide. Ang panukala ng mga may-akda: isang banayad na senyas ng peroxide ang nagpapagana sa landas ng Nrf2, na siya namang nagtutulak sa programa ng biogenesis. Sa modelong ito, pro-oxidant ang methylene blue sa hakbang na nagpapasimula at antioxidant sa hakbang ng kinalabasan. Tinatawag ng mga pharmacologist ang padrong ito na hormesis, kung saan ang maliit na stress ay nag-uudyok ng depensang mas malaki kaysa sa mismong stress. Hindi direktang sinubok kung ang pagtaas na iyon ng peroxide ang talagang sanhi ng pag-activate ng Nrf2; iyon ang iminungkahing ugnayan, hindi isang nasukat na koneksiyon.

Sinubok ng isang kaugnay na pag-aaral mula sa parehong pangkat ang aspeto ng kaligtasan ng panukalang iyon sa ilalim ng mga hamon. Sa mga inihiwalay na mitochondria ng utak, pinataas ng methylene blue ang produksiyon ng hydrogen peroxide sa mga konsentrasyong kasingbaba ng 50 nanomolar, ngunit walang natukoy na pinsala sa mitochondrial DNA sa mga konsentrasyong ginagamit sa paggamot. Sa 100 micromolar lamang, na lubhang mas mataas kaysa sa mga antas na ginagamit sa paggamot, nagpakita ng pinsala ang mga piling fragment ng mtDNA. Ang kombinasyon ng 20 micromolar na tina at pulang liwanag ay lumikha ng singlet oxygen na malawakang puminsala sa mtDNA, na siyang kilalang pagkilos ng tina bilang photosensitizer, sa halip na ang pagkilos nito bilang gamot kapag walang liwanag. Naprotektahan pa nga ng paunang paglalagay nito ang mitochondria sa ventral na bahagi ng midbrain laban sa mga pinsala sa mtDNA na dulot ng rotenone. Nakadetalye ang tugon ayon sa dosis at ang mga kontrol para sa genotoxicity sa pag-aaral tungkol sa produksiyon ng peroxide ng methylene blue na hindi nakapipinsala sa materyal na henetiko.

Nasukat laban sa iminungkahi: pagbasa sa dayagram

Iginuhit para sa artikulong ito ang dayagram ng landas sa ibaba upang malinaw na maipatupad ang pagkakaibang ipinapaliwanag ng teksto. Ang mga kahong may buo at tuloy-tuloy na hangganan ay mga hakbang na may direktang suporta mula sa eksperimento sa mga pag-aaral tungkol sa methylene blue: paulit-ulit na siklong redox na nagbabago sa NAD/NADH, pansamantalang phosphorylation ng AMPK, pagpapataas ng PGC-1alpha at SURF1, mas mataas na aktibidad ng complex IV, pagpapataas ng NQO1 at TrxR1, naibalik na ekspresyon ng mga gene ng biogenesis at bilang ng kopya ng mtDNA sa utak ng daga, at pagtaas ng peroxide nang walang pinsala sa mtDNA sa mga dosis na ginagamit sa paggamot. Ang mga kahong may putol-putol na hangganan ay ang mga iminungkahing koneksiyon: pagtukoy ng Keap1 sa senyas ng peroxide, pag-ipon ng Nrf2 sa nucleus na nagtutulak sa mga gene para sa depensa, at ang palasong nagsasaad ng sanhi mula sa pag-activate ng Nrf2 patungo sa programa ng biogenesis. Kapani-paniwala ang mga hakbang na may putol-putol na hangganan, naaayon sa datos, at bahagi ng karaniwang biyolohiya sa mga aklat-aralin, ngunit sa mga papel na ito ay hindi sila nasukat gamit ang mga kontrol—Nrf2 sa nucleus, mga ARE reporter, Nrf2 knockout—na magbibigay-daan upang gawin silang mga kahong may buong hangganan.

Nagiging malinaw ang tatlong kalituhan kapag nasa harap mo na ang dayagram. Una, magkaibang protina ang NRF1 at Nrf2 na halos magkapareho ang pangalan; sinukat ng pag-aaral sa daga ang nuclear respiratory factor 1, isang tagapagsaayos ng biogenesis, hindi ang salik ng transkripsiyon para sa depensang antioxidant, at kapag pinag-isa ang mga ito, nagiging iisang punto lamang ang buong dayagram. Ikalawa, ang ekspresyon ng gene ang simula ng kuwento, hindi ang katapusan; sinusuportahan ng naibalik na mga mensaheng TFAM o COX1 ang paghiling ng biogenesis, samantalang ang bilang ng kopya ng mtDNA at aktibidad ng complex IV ang ebidensiyang natupad ang hiling. Ikatlo, hindi pinatutunayan ng kinalabasang antioxidant ang pagdaan sa Nrf2; tunay na mga kasunod na epekto ang pagbaba ng oxidant nang 28 percent sa mga fibroblast at ang proteksiyon laban sa rotenone sa mga daga, ngunit maraming landas ang humahantong sa mga ito.

Ano ang magpapalit sa isang kahong may putol-putol na hangganan tungo sa buong hangganan

Karaniwang mga eksperimento ang mga kulang. Ang pagsukat sa protinang Nrf2 sa nucleus pagkatapos malantad sa methylene blue, sa mga oras na katugma ng pansamantalang senyas ng AMPK, ay susubok kung talagang sabay na gumagana ang dalawang sangay, gaya ng sinasabi ng haypotesis ng sabayang pag-activate. Kukumpirmahin ng isang reporter na pinapagana ng ARE ang aktibidad ng transkripsiyon sa halip na ipagpalagay lamang ito mula sa mga target na gene. Ang pag-ulit sa mga panukat ng biogenesis habang pinahihina o ganap na inaalis ang Nrf2 ay direktang susubok sa palasong nagsasaad ng sanhi: kung nagpapatuloy ang pagpapataas ng complex IV at pagdami ng mtDNA kahit walang Nrf2, mali ang iminungkahing ugnayan at ang sangay ng AMPK lamang ang nagdadala ng epekto. Sa mga hayop, susubok ang isang pag-aaral ng pangmatagalang pagbibigay ng dosis gamit ang parehong tatlong yugto ng pagsusuri—tagapagsaayos, dami ng materyal, at paggana—kung nananatiling aktibo ang programa o umaangkop ito. Hangga't wala ang mga iyon, nananatili ang sabayang pag-activate ng mga landas ng enerhiya at depensa sa tawag dito ng mga may-akda: isang posibleng mahalagang salik, hindi isang napatunayang mekanismo.

Maaaring naisin ng mga mambabasang nagmumula sa mas malawak na larangan ng pharmacology ang kaugnay na konteksto: kung paano inililipat ng methylene blue ang mga electron sa antas ng mitochondria, ano pa ang ginagawa nito sa mitochondria at enerhiya ng selula, saan nakapuwesto sa pananaliksik sa pagtanda ang mga natuklasan tungkol sa pagtanda ng selula, paano nauugnay ang mga pahayag tungkol sa biogenesis sa pagganang kognitibo, at ang tala ng kaligtasan na nagtatakda ng hangganan ng bawat talakayan tungkol sa dosis. Ang bawat isa ay hiwalay na konseptong may sariling ebidensiya, at bawat isa ay nararapat sa parehong paghiwalay ng nasukat at iminungkahi na inilapat ng artikulong ito sa Nrf2.