Methylene blue at nitric oxide: NOS, cGMP, at pagsesenyas sa mga daluyan ng dugo

Mukhang simple ang tanong: pinipigil ba ng methylene blue ang nitric oxide? Sa laboratoryo, nahahati ang sagot sa apat na magkakahiwalay na tanong, at bawat isa ay may ibang eksperimental na pagsusuri. Ang pagkalito sa mga ito ang pangunahing dahilan kung bakit ang mga sulatin tungkol sa methylene blue at nitric oxide ay tila tiyak ngunit malabo.

Isipin ang signal ng nitric oxide bilang isang kadena na may apat na kawing. Isinasagawa ang transkripsyon ng isang gene upang makagawa ng nitric oxide synthase. Ginagawang nitric oxide ng enzyme ang arginine. Kumakalat ang gas patungo sa target nito bago ito makipagreaksiyon sa ibang bagay. Natutukoy ito ng soluble guanylate cyclase at gumagawa ito ng cyclic GMP. May mga nailathalang epekto ang methylene blue sa bawat kawing, ngunit nagmumula ang ebidensiya sa iba't ibang preparasyon, iba't ibang konsentrasyon, at iba't ibang isoform. Ang resulta sa isang kawing ay hindi patunay ng pagkilos sa isa pa.

Ang karaniwang kadena, ipinaliwanag nang simple

Sa pader ng daluyan ng dugo, ganito ang karaniwang pagkakasunod-sunod. Kumikilos ang isang pampasigla sa isang endothelial cell. Ang endothelial nitric oxide synthase, na tinatawag na eNOS o NOS3, ay gumagawa ng maikling bugso ng nitric oxide. Kumakalat ang gas papunta sa katabing selula ng makinis na kalamnan, kumakabit sa heme na may bakal sa reduced na estado ng soluble guanylate cyclase, at pinabibilis ang pagpapalit ng GTP tungo sa cyclic GMP. Inaaktiba ng cyclic GMP ang protein kinase G, nagbabago ang paghawak sa calcium, at lumuluwag ang kalamnan.

May ikalawang kadena na mahalagang panatilihing hiwalay. Sa panahon ng impeksiyon o pagkakalantad sa cytokine, nagsasagawa ang mga selula ng transkripsyon para sa ibang enzyme, ang inducible nitric oxide synthase o iNOS, na tinatawag ding NOS2. Gumagawa ito ng mas malaki at mas matagal na daloy ng nitric oxide kaysa sa eNOS. Ang ikatlong isoform, neuronal NOS o nNOS, ay kabilang naman sa ibang konteksto. Kapag binanggit ng isang papel ang nitric oxide synthase nang hindi tinutukoy ang isoform, huminto at suriin kung alin ang sinukat. Ganito rin ang punto ng pangkalahatang paliwanag kung paano nagpapalipat ng mga electron ang methylene blue pagdating sa mga redox target: walang nagagawa ang tagapaglipat nang mag-isa, at ang katuwang sa bawat dulo ang nagtatakda ng resulta.

Ang sinusukat na cyclic GMP ay isa ring pinagsamang panukat ng kinalabasan, hindi direktang pagsusuri ng enzyme. Ipinapakita ng antas nito ang sintesis ng cyclase na binawasan ng pagkasira dulot ng mga phosphodiesterase, lalo na ng PDE5 sa makinis na kalamnan ng mga daluyan ng dugo. Kaya ang pagbaba ng cyclic GMP ay nangangahulugang mas kaunting signal ang nakarating sa tagatukoy. Hindi nito, sa sarili lamang, tinutukoy kung aling kawing ang pumalya.

Kawing 1: mas kaunting iNOS enzyme ang nagagawa

Sa mga macrophage ng daga na pinasigla gamit ang bacterial lipopolysaccharide, interferon gamma, o pareho, napigilan ng methylene blue ang inaasahang pagtaas ng iNOS protein at matinding pinababa ang iNOS messenger RNA sa mga eksperimento sa transkripsyon ng macrophage. Ang mahalagang bahagi ay kung ano ang hindi nagbago. Halos nanatiling buo ang pagkasira ng inhibitor na I kappa B alpha, ang phosphorylation ng NF kappa B at STAT1, at ang paglipat ng mga salik na iyon papunta sa nucleus. Ang nabawasan ay ang pagkakabit nila sa DNA, na kinumpirma ng chromatin immunoprecipitation na nagpakita ng mas kaunting pagkakabit sa promoter ng iNOS.

Iyon ay epekto sa regulasyon ng gene bago pa matukoy ang dami ng enzyme, hindi agarang pagharang sa isang umiiral nang enzyme. Bahagi ito ng pagsesenyas sa pamamaga, kung saan kailangang kumabit ang mga salik ng transkripsyon sa isang promoter bago lumitaw ang protina. Wala itong direktang sinasabi tungkol sa constitutive eNOS sa isang daluyan ng dugo na nasa pahingang kalagayan, at dapat itong ilarawan sa ganoong paraan.

Kawing 2: mas mabagal kumilos ang umiiral nang NOS enzyme

Ibang antas ang sinuri ng isang pag-aaral sa mga rat. Binigyan ng lipopolysaccharide sa ugat ang mga gising na lalaking rat, at pagkalipas ng tatlong oras ay binigyan ng saline o methylene blue na 3 mg per kg sa ugat. Sinukat ang aktibidad ng nitric oxide synthase sa medial basal hypothalamus sa pamamagitan ng pagpapalit ng may markang arginine tungo sa citrulline sa pag-aaral ng aktibidad ng NOS sa hypothalamus. Ang stress na sinamahan lamang ng saline ay nagdulot ng ilang aktibidad na hindi nakadepende sa calcium, at itinaas ito ng lipopolysaccharide sa humigit-kumulang sampung ulit ng antas ng kontrol. Inalis ng methylene blue ang parehong bahaging naudyok. Hindi nagbago ang constitutive na aktibidad na nakadepende sa calcium sa tisyu na iyon, sa dosis at oras na iyon.

Unawain ang resultang iyon nang eksakto sa pagkakasulat: bumaba ang sinusukat na aktibidad na uri ng iNOS sa mga kondisyong iyon. Hindi ito pagsukat ng ekspresyon ng gene, at hindi ito patunay na laging pinipili ang iNOS kaysa eNOS o nNOS. Lalong pinagtitibay ng mga pag-aaral sa purified enzyme ang pag-iingat na ito. Sa mga direktang pagsusuri ng purified nitric oxide synthase, lubusang hinarangan ng methylene blue ang pagbuo ng citrulline sa 30 micromolar, na may konsentrasyong kailangan para sa kalahating pagpigil na malapit sa 5.3 micromolar kapag walang superoxide dismutase at 9.2 micromolar kapag mayroon nito, ayon sa paghahambing ng purified NOS at guanylate cyclase. Itinuro naman ng hiwalay na pag-aaral sa purified nNOS ang oksidasyon ng heme na nakakabit sa enzyme bilang sangkot na mekanismo. Ang praktikal na aral ay totoong nangyayari ang direktang pagpigil sa NOS sa mga nakahiwalay na sistema, ngunit hindi maaaring palawakin ang resulta sa hypothalamus tungo sa pangkalahatang pahayag na hindi naaapektuhan ng methylene blue ang lahat ng constitutive NOS saanman.

Kawing 3: nawawala ang nitric oxide bago ito makarating

Ang pinakamalinaw na pagpapakita na may ibang bagay bukod sa pagharang sa enzyme na makapagpapaliwanag sa pagbaba ng cyclic GMP ay mula sa mga selula ng makinis na kalamnan ng pulmonary artery ng kuneho na pinalaki sa kultura. Lubusang nilampasan ng disenyo ang endogenous NOS sa pamamagitan ng direktang pagdaragdag ng mga donor ng nitric oxide, at pagkatapos ay sinuri kung pinahihina pa rin ng methylene blue ang tugon ng cyclic GMP sa pag-aaral sa superoxide sa makinis na kalamnan ng mga daluyan ng dugo.

Tatlong donor ang sinuri mula 1 hanggang 100 micromolar: S nitroso L cysteine, sodium nitroprusside, at isang matatag na analogue na inalisan ng amino group na tinatawag na MPANO. Lahat ay nagtaas ng cyclic GMP nang humigit-kumulang 1.5 hanggang 12 ulit. Pinahina ng methylene blue sa 10 micromolar ang unang dalawa nang 51 hanggang 100 porsiyento at hindi binago ang tugon sa MPANO. Kung hinaharangan lamang ng methylene blue ang catalytic site ng cyclase, mahirap ipaliwanag ang pagpiling iyon sa mga donor, dahil lahat ng tatlo ay humahantong sa iisang enzyme sa kasunod na hakbang.

Pagkatapos, tatlong kontrol ang nag-ugnay sa mekanismo sa superoxide. Una, ang pagbuo ng superoxide sa labas ng mga selula gamit ang xanthine at xanthine oxidase ay nagbunga ng parehong padron: naharangan ang CYSNO at nitroprusside, ngunit hindi naapektuhan ang MPANO. Ikalawa, nagdulot ang methylene blue ng pagbuo ng superoxide mula sa mga selula ng makinis na kalamnan na nakadepende sa dosis at oras, na sinukat sa pamamagitan ng reduction ng cytochrome c. Ikatlo, lubusang napigilan ng superoxide dismutase ang epekto ng pagpigil samantalang hindi ito nagawa ng catalase, na nagtuturo sa superoxide sa halip na hydrogen peroxide bilang sangkap na direktang sangkot sa preparasyong iyon.

Mahalagang ilahad ang bersiyon ng eksperimento na may magkasamang kultura dahil tinutukoy nito kung saan nangyayari ang epekto. Sandaling pinalaki nang magkasama ang mga endothelial cell sa mga coverslip at mga selula ng makinis na kalamnan, kaya ang salik na likas na inilalabas ng endothelium ay nagtaas ng cyclic GMP sa makinis na kalamnan nang tatlo hanggang walong ulit. Ang paunang paglalapat ng methylene blue sa alinman sa dalawang bahagi ay nagpahina sa signal na iyon, at bahagyang naibalik ng superoxide dismutase ang signal na nabawasan dahil sa paunang paglalapat sa endothelium. Sa madaling salita, hindi kailangang kumilos ang methylene blue sa loob mismo ng selula ng makinis na kalamnan na tumutukoy sa signal. Maaari nitong pahinain ang signal sa pamamagitan ng pag-aalis sa tagapagdala ng mensahe habang naglalakbay ito. Itinuturing ito ng gabay sa pagbasa ng pananaliksik sa methylene blue bilang pangkalahatang tuntunin: tukuyin muna ang bahagi kung saan ginawa ang interbensiyon bago pangalanan ang molekular na target.

Maling tawagin itong pagpigil sa NOS. Walang hakbang na kinasasangkutan ng synthase na kailangan para gumana ang mga donor, ngunit bumaba pa rin ang signal.

Kawing 4: mas mahina ang pagtugon ng mismong tagatukoy

May mga direktang epekto sa soluble guanylate cyclase, ngunit mahalaga ang mga konsentrasyon. Sa paghahambing ng mga purified enzyme na binanggit sa itaas, kinailangan ng cyclase na pinasigla ng nitric oxide ang humigit-kumulang 60 micromolar methylene blue para sa kalahating pagpigil, kumpara sa kalahating pagpigil sa NOS na malapit sa 5 hanggang 9 micromolar. Kahit 1 millimolar ay nagdulot lamang ng bahagyang pinakamataas na pagharang. Katumbas iyon ng humigit-kumulang anim hanggang labing-isang ulit na agwat. Kaya ang isang eksperimento sa selula sa mababang micromolar na konsentrasyon na nagpapababa ng cyclic GMP ay hindi maaaring tawaging piling pagpigil sa cyclase batay lamang sa halaga ng cyclic GMP.

Nagdagdag ng ikalawang babala ang isang sumunod na pag-aaral sa redox: pinahinto ng methylene blue ang aktibidad ng cyclase na inaktiba ng nitric oxide sa pamamagitan ng mekanismong naiiba sa simpleng oksidasyon ng bakal sa heme dahil sa hangin. Kaya maaaring humina ang tagatukoy, ngunit hindi pa tiyak ang kimika nito, at dahil sa agwat ng konsentrasyon, kailangang alisin muna bilang posibleng paliwanag ang mga epekto sa superoxide at NOS kapag mababa ang pagkakalantad na nasa antas na micromolar. Dito rin kabilang ang pagkontrol sa phosphodiesterase. Maliban kung sinukat o hinarangan ang pagkasira, ang mas mababang pag-ipon ng cyclic GMP ay maaaring tumugma sa mas kaunting sintesis, mas mabilis na pagkasira, o pareho.

Bakit hindi ito maibubuod sa iisang pahayag tungkol sa presyon ng dugo

Naitatag ang bawat kawing sa magkaibang sistema. Ang transkripsyon sa macrophage ay hindi aktibidad ng enzyme sa hypothalamus. Ang aktibidad sa hypothalamus pagkatapos ng lipopolysaccharide ay hindi ang tono ng endothelium habang nagpapahinga. Ang salik na likas na inilalabas ng endothelium sa magkasamang kultura ay hindi pagluwang ng mga daluyan ng dugo na pinasigla ng agonist. Ang mga selula ng pulmonary artery na pinalaki sa kultura at nilagyan ng 10 micromolar methylene blue ay hindi ang sirkulasyon ng tao. Ang pagsasama-sama sa mga ito sa isang pahayag gaya ng itinataas ng methylene blue ang presyon ng dugo sa pamamagitan ng pagharang sa nitric oxide ay nagtatapon mismo sa mga pagkakaibang nilayon ng mga kontrol na mapanatili.

Tatlong pagsusuri ang nagpapanatiling tapat sa paliwanag. Una, tukuyin ang isoform: eNOS para sa tono ng mga daluyan ng dugo habang nagpapahinga, iNOS para sa daloy na naudyok ng pamamaga, at nNOS para sa mga kontekstong neuronal at ilang konteksto ng purified enzyme. Ikalawa, tukuyin kung paano naihahatid ang signal ng nitric oxide: endogenous na sintesis, likas na paglabas mula sa endothelium, o isang partikular na donor gaya ng CYSNO, nitroprusside, o MPANO, dahil hindi naapektuhan ng methylene blue ang matatag na donor samantalang naapektuhan ang mga madaling magbago. Ikatlo, tukuyin ang konsentrasyon at ang pagpapanumbalik: ang pagpapanumbalik ng superoxide dismutase ay nagpapahiwatig na sangkot ang superoxide, ang kabiguan ng catalase ay ebidensiyang laban sa pagkakasangkot ng hydrogen peroxide sa preparasyong iyon, ang paggaya ng xanthine oxidase ay nagpapakitang sapat ang mekanismo upang magdulot ng epekto, at ang mga pagsusuri sa purified enzyme ay naghihiwalay sa mga direktang epekto sa katalisis mula sa pagkawala habang naglalakbay.

Ito ang maikling buod. Mas angkop ituring ang methylene blue bilang sangkap na nakagagambala sa maraming bahagi ng pagsesenyas mula nitric oxide tungo sa cyclic GMP kaysa bilang piling tagaharang ng cyclase. Depende sa preparasyon at konsentrasyon, maaari nitong bawasan ang pagkakabit ng mga salik ng transkripsyon ng iNOS, direktang pigilan ang mga NOS enzyme, bawasan ang pagkakaroon ng nitric oxide sa pamamagitan ng pagbuo ng superoxide, at pahinain ang cyclase na inaktiba ng nitric oxide. Ang papel ng pagsesenyas ng cyclic GMP sa mga pag-aaral sa daluyan ng dugo at ang paghahambing ng mga donor ng nitric oxide na ginagamit sa mga pagsusuri sa selula ay kapwa tumatalakay nang mas detalyado sa isa sa mga sangay na iyon, at ipinapaliwanag ng mga pamamaraang ginagamit upang ihiwalay ang mga epekto ng redox mula sa mga epekto sa enzyme kung bakit napakadalas lumitaw sa mga pag-aaral na ito ang superoxide dismutase kasama ang catalase at isang kontrol na gumagamit ng matatag na donor.

Ang mababang halaga ng cyclic GMP pagkatapos ng methylene blue ay nagpapakita ng naputol na kadena. Tanging ang mga kontrol ang nagsasabi kung aling kawing ang naputol.