Methylene blue bilang pananda ng anaerobiosis at oxygen: ano ang pinatutunayan ng pagbabago ng kulay

Isinasara nang mahigpit ng isang teknisyan ang isang anaerobic jar, tinitingnan ang methylene blue indicator strip sa pamamagitan ng takip, at nakikita ang gusto niyang makita. Mula sa asul, naging puti ang strip. Itinatala niyang anaerobic ang proseso at nagpapatuloy sa susunod na gawain. Pagkalipas ng dalawang araw, walang tumutubo sa isang plate samantalang ang isang nakasarang tubo ng broth sa loob ng parehong jar ay nagpapakita ng mga palatandaan ng pagkakalantad sa oxygen. Totoo ang ipinakita ng strip. Mali ang itinanong niya rito.

Ang kalituhan ay nasa konsepto. Ang methylene blue na pananda ng anaerobiosis ay nakabatay sa konsepto ng redox, hindi sa sterilidad at hindi sa pagpapatunay ng buong sistema. Kapag malinaw na ang pagkakaibang iyon, nagiging tumpak at tapat na instrumento ang strip na may limitadong tungkulin.

Ang konsepto: isang nababaligtad na pares ng redox

May dalawang anyo ang natunaw na methylene blue. Ang anyong na-oxidize ay ang pamilyar na asul na kation. Walang kulay ang anyong na-reduce, na tinatawag na leucomethylene blue. Sa halos neutral na pH, ang pinasimpleng kalahating reaksiyon ay isang asul na kation kasama ang isang proton at dalawang electron, na bumubuo ng isang walang-kulay na molekulang leuco. Ang pormal na potensiyal nito ay malapit sa plus 11 millivolts kaugnay ng standard hydrogen electrode sa pH 7, kaya nasa saklaw ito na kayang abutin ng maraming sistemang nagdudulot ng reduksiyon at kayang baligtarin ng oxygen.

Nangangailangan ang reduksiyon ng mababang lokal na potensiyal na redox. Hindi palaging sapat ang pag-aalis lamang ng oxygen. Natuklasan sa mga unang pag-aaral tungkol sa anaerobiosis na nananatiling may kulay ang methylene blue sa purong tubig na walang oxygen maliban kung may sangkap na nagdudulot ng reduksiyon. Natuklasan din na madaling nawawalan ng kulay sa 37 C ang mga halo ng dextrose broth na may humigit-kumulang 0.01 percent na dye, samantalang nanatiling asul sa loob ng isang araw ang parehong halo sa 4 C, gaya ng iniulat sa mga eksperimento sa sariwang tisyu at mga kondisyon ng anaerobic culture. Ang temperatura, pH, glucose, ascorbate, thioglycollate, at aktibidad ng mga mikrobyo na nagdudulot ng reduksiyon ang nagtatakda kung may magagamit na mga electron.

Oxygen lamang ang kailangan para sa muling oksidasyon. Kapag naabot ng hangin ang anyong leuco, bumabalik ito sa asul. Eksaktong siklong ito ang ginagamit ng mga makabagong dinisenyong pananda: dye kasama ang sangkap na nagdudulot ng reduksiyon at isang matrix na nagpapanatili ng katatagan, walang kulay kapag mababa ang oxygen at muling nagiging asul kapag nalantad sa hangin, gaya ng ipinakita sa isang hybrid na methylene blue oxygen indicator na batay sa dye, sangkap na nagdudulot ng reduksiyon, surfactant, at clay. Gumamit ang prototipong iyon ng 0.01 millimolar na dye na may 2.0 millimolar na ascorbate o glucose sa pH 11, nawalan ng kulay malapit sa 0.5 volume percent na oxygen, at naipagkaiba ang mas mababa sa 0.1 percent at mas mataas sa 0.5 percent na oxygen sa test chamber nito.

Kaya simple ang prinsipyong ginagamit sa operasyon. Ang asul ay nangangahulugang na-oxidize ang sona ng pananda. Ang walang kulay ay nangangahulugang umabot ang sona ng pananda sa mga kondisyong pabor sa reduksiyon at mababa ang oxygen. Nababaligtad, lokal, at kemikal ang pagbabago. Sa sarili nito, wala itong sinasabi tungkol sa mga mikrobyo.

Paano gumagana ang methylene blue indicator strip sa isang anaerobic jar

Ang methylene blue indicator strip para sa isang anaerobic jar ay isang maliit na sona ng reaksiyon na inilalagay sa atmospera ng jar kung saan makikita ito nang hindi binubuksan ang sisidlan. Iba-iba ang mga komersiyal na anyo: mga strip na papel, mga tabletang tinutunaw o binabasa sa paghahanda, at mas bagong mga hybrid na papel. Nangangailangan ang ilan ng isang patak ng distilled water upang paganahin ang sona ng reaksiyon. Ang iba naman ay mga tuyong aparato na dapat manatiling tuyo. Ang tagubilin para sa partikular na produkto ang dapat sundin, dahil bahagi ng kimika ang paglalagay ng tubig, puwesto, at oras ng pagbasa.

Sa aktuwal na paggamit, dalawa ang nilalayong interpretasyon. Ang asul ay nangangahulugang may oxygen pa o hindi pa sapat ang mga kondisyong pabor sa reduksiyon sa strip. Ang puti o walang kulay ay nangangahulugang naitatag na ang mga anaerobic na kondisyong redox sa strip. May ilang komersiyal na papel na dinaragdagan ng pulang pigment sa likuran, kaya kulay rosas sa halip na puti ang kanilang huling kulay kapag na-reduce. Alamin muna kung anong huling kulay ang ipinapangako ng produkto bago ito hatulan.

Nag-iiba ang tagal ayon sa sistema. Sa isang setup na istilong GasPak, nagsimulang kumupas ang kulay sa loob ng humigit-kumulang isang oras at ganap na nawala sa loob ng ilang oras, samantalang sa isang kontroladong paghahambing sa temperatura ng silid, kinailangan ng methylene blue ang mahigit anim na oras. Sa pag-aaral na iyon, umabot ang potensiyal na redox ng media sa humigit-kumulang minus 100 millivolts sa loob ng 60 hanggang 100 minuto, bago pa matapos ang pagbabago ng kulay ng dye, at nasa mas mababa sa minus 200 millivolts na ito nang ganap na mawalan ng kulay ang strip. Nahuhuli ang tugon ng pananda sa pagbabago ng atmospera. Hindi nagpapatunay ng pagkabigo ang asul na strip sa unang oras, at inilalarawan ng puting strip sa ikaanim na oras ang kondisyon ng strip sa ikaanim na oras.

Mahalaga ang puwesto dahil sa parehong dahilan. Panatilihin ang strip sa headspace, o espasyo ng gas sa ibabaw ng laman, na nakikita sa pamamagitan ng takip at malayo sa mga ibabaw ng agar at culture media. Ang agarang kapaligiran nito ang ipinapakita nito. Idikit ito nang lapad sa isang malamig na dingding, ibaon sa ilalim ng mga plate, o hayaang mababad sa kondensasyon, at ang maliit na kapaligirang iyon ang ipapakita nito sa halip na ang kondisyon ng jar.

Ano ang ipinapakita ng strip at ano ang hindi nito ipinapakita

Isipin ang methylene blue na pananda sa anaerobic jar bilang isang sensor sa isang lokasyon. Ipinapakita nito ang lokal na mga kondisyon ng redox at oxygen sa sarili nitong sona ng reaksiyon, na karaniwang kumakatawan sa headspace kung sapat ang paghahalo at pag-abot sa ekwilibriyo. Ang anumang higit pa rito ay hinuha, at nangangailangan ng hiwalay na ebidensiya ang hinuha.

Hindi pinatutunayan ng walang-kulay na strip ang sterilidad. Ang sterilidad ay ang kawalan ng mga organismong may kakayahang mabuhay, na pinatutunayan sa pamamagitan ng balidadong isterilisasyon at mga kontrol sa pagpapatunay ng culture. Maaaring ganap na anaerobic ang isang jar ngunit kontaminado pa rin, o ganap na sterile ngunit aerobic pa rin.

Hindi nito pinatutunayan ang bawat bahagi ng sistema ng culture. Hindi nasasaklaw ng isang strip ang natunaw na oxygen sa loob ng nakasarang tubo, oxygen na nakulong sa malalim na agar, mga gradient sa isang siksik na jar, at pagtagas na nagsisimula pagkatapos ng pagbasa. Nagpakita ang mga eksperimentong sumusuri sa iba't ibang lokasyon ng magkatabing asul at walang-kulay na sona sa parehong sisidlan, kung saan magkaiba ang balanse ng pagpasok ng oxygen at aktibidad na nagdudulot ng reduksiyon. Hindi mapapatunayan ng isang punto ang kondisyon ng buong bolyum.

Hindi nito pinatutunayan ang tuluy-tuloy na anaerobiosis. Walang sinasabi tungkol sa ikadalawampung oras ang isang strip na binasa lamang nang isang beses sa paghahanda. Nagbabala ang mga kamakailang pag-aaral sa kalidad ng anaerobic na mga kondisyon na inilalarawan ng mga kemikal na pananda ang atmospera sa sandaling binabasa ang mga ito at maaaring magmukhang katanggap-tanggap kahit may mababang antas ng natitirang oxygen. Ang tuluy-tuloy na dokumentasyon o dokumentasyon sa mga itinakdang oras ng pagsusuri, hindi isang sulyap lamang sa huling kulay, ang nag-uugnay sa strip at sa inkubasyon.

Para sa kaugnay na kimika sa likod ng pagbabago ng kulay, tingnan ang kung paano nagpapalipat-lipat ang methylene blue sa mga anyong na-oxidize at na-reduce. Para sa mas malawak na epekto ng oxygen sa paghawak ng sample, tingnan ang pagkontrol ng oxygen sa mikroskopiya at gawaing culture.

Isang diagram na itatabi sa jar

Binubuod ng larawan sa ibaba ang artikulo bilang isang sanggunian sa mesa ng laboratoryo. Ipinapakita nito ang tatlong kondisyon ng parehong strip, ang dalawang direksiyon ng reaksiyon, at ang hangganan sa pagitan ng ebidensiya mula sa pananda at pagpapatunay ng sistema.

Mga uri ng pagkabigong nagpapanatiling asul sa strip, o nagbibigay ng maling katiyakan

Karamihan sa mga pagkabigo ay kabilang sa limang pangkat. May natatanging palatandaan ang bawat isa.

Patuloy na naghahatid ng oxygen sa sona ng reaksiyon ang isang jar o pouch na may tagas. Nananatiling asul ang strip o muling nagiging asul matapos kumupas. Suriin ang takip, gasket, mga clamp, at mga ibabaw na nagseselyo bago sisihin ang kimika.

Hindi naaalis ng ubos na o maling na-activate na gas generator ang oxygen. Sa mga lumang sistemang pinapagana ng tubig, ang kawalan ng kondensasyon sa humigit-kumulang 10 hanggang 15 minuto at hindi pag-init ng takip sa humigit-kumulang 20 hanggang 40 minuto ay mga maagang babala para sa sistemang iyon. Ganoon din ang pagkabigo ng isang sachet na kulang ang kapasidad sa isang sobrang punong jar.

Ang pagkalason ng katalista ay naaangkop lamang sa mga lumang sistemang gumagamit ng hydrogen at palladium, kung saan pinagsasama ng palladium ang hydrogen at oxygen upang bumuo ng tubig. Pinapahina ito ng halumigmig at hydrogen sulfide. Maraming kasalukuyang sachet ang hindi gumagamit ng palladium, kaya huwag ilapat ang solusyong ito kung hindi ito naaangkop.

Tahimik na pumapalya ang isang strip na nasira o mali ang paghawak. Nawawala sa dye at sa sangkap na nagdudulot ng reduksiyon ang kakayahang baligtarin ang reaksiyon habang nakaimbak. Isa ito sa mga dahilan kung bakit binuo ang mga hybrid na pormulasyon upang labanan ang pagkupas dahil sa liwanag at pagkawala ng paggana habang nakaimbak. Huwag gamitin ang mga suplay na paso na, may hindi normal na panimulang kulay, at mga strip na binasa kahit dapat tuyo o iniwang tuyo kahit kailangang basain.

Ang gradient o pagkaantala ay nakalilinlang sa nagbabasa, hindi sa kimika. Ang headspace na hindi nahalong mabuti, mga nakasarang tubo na may natunaw na oxygen, at mga semisolid na media ay nagpapanatili ng kani-kanilang kondisyon nang mas matagal kaysa sa ipinahihiwatig ng strip. Dumaraan sa kulay rosas bago mawalan ng kulay ang mga resazurin strip at madalas na ibinebenta bilang mas mabilis, ngunit ang kanilang mga hangganan ng pagtugon ay nakabatay sa sarili nilang pormulasyon at hindi mailalapat sa methylene blue.

Mga kontrol at isang protokol sa pagbasa na dapat tularan

Natutukoy ng dalawang murang kontrol ang karamihan sa mga maling pagbasa. Maglagay ng bagong strip bilang kontrol sa hangin ng silid kasabay ng proseso. Nananatiling asul doon ang gumaganang methylene blue strip. Maputla sa simula ang ilang nakabalot na pananda at nagiging asul sa pagbukas, na isa na ring pagsusuri sa paggana. Paminsan-minsan ding maglagay ng bagong strip sa isang anaerobic na setup na dati nang napatunayan. Dapat nitong maabot ang napatunayang huling kulay kapag na-reduce sa loob ng oras na tinukoy para sa produkto. Kung hindi tama ang paggana ng alinmang kontrol, palitan ang lote bago pagkatiwalaan ang mga pagbasa sa jar.

Nakabatay sa mekanismo ang protokol sa pagbasa. Ilagay ang strip sa headspace kung saan makikita ito nang hindi binubuksan ang jar, at sundin ang tagubilin ng produkto para sa pagdikit sa dingding at pagbabasa. Itala ang panimulang kulay, oras ng pagsasara ng jar, at kulay sa oras ng pagsusuring tinukoy para sa produkto. Kung pinahihintulutan ng sisidlan, itala na nanatiling na-reduce ang pananda sa mga itinakdang oras ng pagsusuri habang nag-iinkuba. Itala ang huling kulay kaagad bago buksan. Ang kulay bago buksan ang huling resulta para sa prosesong iyon. Pagkatapos buksan, asahang babalik ito sa asul at huwag hayaang baguhin nito ang naunang tala.

Kung nananatiling asul ang strip lampas sa itinakdang oras, ituring na hindi pa napapatunayan ang anaerobiosis. Suriin ang mga bahagi nang sunod-sunod: pagsasara, sachet, katalista kung mayroon, paglalagay ng tubig sa pananda at petsa ng pag-expire, at pagkatapos ay ang paggana ng pananda kumpara sa kontrol sa hangin. Saka lamang dapat bigyang-kahulugan ang pagtubo o kawalan ng pagtubo kapag napatunayan na ang atmospera, gamit ang anaerobic culture setup at mga kontrol ng organismo na angkop sa aplikasyon.

Nararapat magkaroon ng huling salita ang strip sa sarili nitong saklaw. Asul man o walang kulay, sinasagot nito ang isang tanong tungkol sa isang lugar sa isang oras. Itanong iyon ayon sa iskedyul, na may mga kontrol sa tabi nito, at maaasahan ang sagot nito. Tanungin ito tungkol sa sterilidad, sa bawat tubo, o sa buong inkubasyon batay sa isang sulyap lamang, at walang kimika ng pananda ang makapagliligtas sa interpretasyon.