Methylene blue at autophagy: AMPK, mTOR, at mga eksperimento sa neuron

Isipin na nagsasagawa ka ng eksperimento sa mga selula, nagdagdag ng methylene blue, at nakitang mas dumidilim sa iyong blot ang isang banda ng protina na tinatawag na LC3-II. Nakatutuksong ipahayag na ang compound ay "nagpapalakas ng autophagy" at magpatuloy na. Masyado pang maaga para sa interpretasyong iyon. Maaaring ang mas madilim na banda ng LC3-II ay nangangahulugang gumagawa ang selula ng mas maraming vesicle para sa paglilinis, o maaaring naiipon ang mga vesicle dahil barado ang hakbang ng pagtatapon. Magkasalungat ang direksiyong ipinahihiwatig ng dalawang interpretasyon, at may mga halimbawa ng bawat uri ng ebidensiya sa literatura tungkol sa methylene blue at mga neuron. Tatalakayin ng artikulong ito kung ano talaga ang sinukat, pagsusuri sa bawat pagsusuri.

Ang macroautophagy, ang anyong pinag-aralan dito, ay ang malawakang pagre-recycle ng selula. Lumalaki ang isang supot na lamad na tinatawag na phagophore sa paligid ng mga lumang protina at organelle, nagsasara upang maging autophagosome, sumasanib sa isang lysosome, at ang karga nito ay pinaghiwa-hiwalay at inilalabas upang magamit muli. Umaasa ang mga neuron sa prosesong ito dahil hindi sila naghahati at hindi nila mababawasan ang proporsiyon ng mga nasirang bahagi sa pamamagitan ng paghahati. Kapag huminto ang pagre-recycle, naiipon ang basura. Kapag gumagana ito, nakakabawi ang selula ng mga sangkap na magagamit sa pagbuo habang nasa ilalim ng stress.

Ano ang ipinakita ng isang eksperimento sa hippocampus

Gumamit ang pangunahing pag-aaral sa pagpapasimula ng mga HT22 na selula mula sa hippocampus ng daga na isinailalim sa stress sa pamamagitan ng pagkakait ng serum sa loob ng 24 oras, isang kondisyong nag-aalis ng mga salik sa paglaki at mga senyas na sumusuporta sa selula at nagpapasimula ng parehong apoptosis at autophagy. Iniulat ng mga mananaliksik na binawasan ng methylene blue ang pagkamatay ng mga selula nang nakadepende sa dosis, at kasabay ng proteksiyong ito ang mga palatandaan ng macroautophagy.

Tiyak ang sunod-sunod na pagbabago sa mga marker. Ang kalat-kalat na paglamlam ng LC3B ay muling naipamahagi bilang mga tuldok sa paligid ng nucleus simula sa humigit-kumulang 20 nM na methylene blue, at pinakamalakas ang tugon ng LC3-I at LC3-II malapit sa 1 μM. Parehong tumaas ang LC3B-I at LC3B-II nang nakadepende sa dosis at oras. Mahalagang hindi huminto ang pangkat sa isang nakapirming larawan mula sa LC3 blot. Nagdagdag sila ng 10 μM na chloroquine, na humaharang sa pag-aalis sa pamamagitan ng lysosome, at nakakita ng mas mataas na LC3-II at pagpapanatili ng p62 sa mga selulang ginamitan ng methylene blue. Sinusuportahan ng padron na iyon ang pagproseso at pagpapalit na nakadepende sa lysosome sa halip na simpleng pag-iipon lamang. Ipinakita rin nilang bahagyang binaligtad ng chloroquine ang epektong pumipigil sa apoptosis, na nag-uugnay sa proteksiyon sa landas ng autophagy at lysosome sa modelong ito.

Ang resulta sa pagsesenyas ang bahaging pinakamadalas maling sipiin. Ang pagsesenyas ng AMPK, na sinukat sa pamamagitan ng phosphorylated AMPK at ng kasunod nitong target na phosphorylated ACC, ay tumaas sa 12 at 24 oras nang nakadepende sa dosis. Ang Compound C na pumipigil sa AMPK, na inilapat sa 20 μM sa huling 4 na oras, ay nagpababa sa parehong phosphorylation ng ACC at pag-activate ng LC3. Sa kabaligtaran, walang natukoy na pagsugpo sa phosphorylated mTOR. Kaya sa mga selula ng hippocampus na nasa ilalim ng stress, ang natuklasan ay pagpapasimulang kaugnay ng AMPK sa isang landas na tila hindi nakadepende sa mTOR. Lumitaw ang parehong padron sa mga buhay na daga, kung saan ang paggamit ng methylene blue ay nagpasimula ng mga marker ng macroautophagy sa cortex at hippocampus.

Ang pagpapasimula ay hindi katumbas ng nakumpletong flux

Dito pinakamahalaga ang pagkakaiba ng mga konsepto. Ang pagpapasimula ay nangangahulugang gumagawa ng mas maraming autophagosome ang mekanismong nasa unahang bahagi ng proseso. Ang flux ay nangangahulugang dumaraan ang karga sa buong landas: pagkulong, paghinog, pagsanib sa lysosome, pagkakawatak-watak, at pagre-recycle. Ang bawat pagtaas ng LC3-II ay ebidensiya lamang para sa pagpapasimula hangga't hindi kinukumpirma ng isang pagsusuri sa flux ang natitirang bahagi ng paglalakbay.

Sinusukat ng karaniwang pagsusuri sa flux ang LC3-II nang mayroon at walang panandaliang pagharang sa lysosome, gaya ng bafilomycin A1 o chloroquine. Kung talagang pinabibilis ng paggamot ang produksiyon, dapat lalo pang pataasin ng pagharang sa pagkasira ang LC3-II. Nagdaragdag ng ikalawang paraan ng pagsuri ang isang tandem mCherry-GFP-LC3 reporter: dilaw ang liwanag ng mga estruktura bago sumanib sa lysosome at pula lamang matapos patayin ng asido ang senyas ng GFP, kaya ang mas maraming tuldok na pula lamang ay sumusuporta sa pag-usad patungo sa mga maasidong autolysosome. Maaaring patibayin ng pagbaba ng protinang p62 ang pagproseso at pagpapalit ng karga, ngunit dapat tandaan na tumutugon din sa stress ang mismong transkripsiyon ng p62 at dapat itong suriin sa antas ng mRNA.

Iniuugnay ng talaan sa ibaba ang bawat pagsusuring ginamit sa literaturang ito sa kung ano ang sinusukat nito at kung ano ang hindi nito kayang patunayan nang mag-isa. Maaari itong gamitin muli ng mga mambabasa sa anumang susunod na pahayag tungkol sa macroautophagy, kabilang ang mga argumento tungkol sa pag-aayuno at mahabang buhay na gumagamit ng mga marker na ito.

Tandaan ang isang patibong sa pananalita na nililinaw ng talahanayan. Ang phosphorylated ACC ang anyong may napigil na aktibidad bilang enzyme. Ang pagtaas nito ay nagpapakita ng inilalabas na senyas ng AMPK, hindi ng pag-activate ng ACC.

Kailangan din ng parehong katumpakan ang pariralang "inalis ng pagpigil sa macroautophagy ang proteksiyon sa mga neuron." Sa modelong HT22, nangangahulugan itong ang paghadlang sa landas ng autophagy at lysosome ay nag-alis sa bentaha ng methylene blue sa pananatiling buhay habang pinagkakaitan ng serum. Sinusuportahan nito ang autophagy bilang kinakailangan o nakatutulong sa naturang kulturang pang-eksperimento. Hindi nito pinatutunayang autophagy lamang ang mekanismong nagbibigay ng proteksiyon mula sa compound, hindi nito pinatutunayang sa autophagy lamang kumikilos ang chloroquine, at kakailanganin ang pagbabagong henetiko sa ATG5, ATG7, o ULK1 upang mapatibay ang pahayag ng sanhi at bunga.

Dalawang landas patungo sa parehong mekanismo

Makakatulong ang isang pinasimpleng mapa. Pinapataas ng stress sa enerhiya ang AMPK, ina-activate ng AMPK ang ULK1 complex, at nagsisimula ang autophagy. Pinapataas ng mga salik sa paglaki at sustansiya ang mTORC1, pinipigilan ng mTORC1 ang ULK1, at nananatiling hindi aktibo ang autophagy. Sa kasunod na bahagi ng ULK1, sinisimulan ng Beclin-1 at VPS34 complex ang pagbuo ng phagophore, nilalagyan ng lipid ang LC3-I upang maging LC3-II, nagsasara ang autophagosome, sumasanib sa lysosome, at pinaghiwa-hiwalay ang karga habang pinoproseso at pinapalitan ang p62.

Inilalagay ng diyagram ang bawat natuklasan tungkol sa methylene blue sa mapang ito: ang resulta sa hippocampus sa tabi ng sangay ng AMPK, at ang resulta sa progenitor sa tabi ng sangay ng mTOR.

Nililinaw ng ganitong pagtingin ang tila pagkakasalungat sa ikalawang pag-aaral ni Xie. Sa mga dumaraming neural progenitor na selula ng daga, natuklasan ng isang hiwalay na eksperimento na pinigilan ng 5 μM na methylene blue ang pagdami at itinaguyod ang kalagayang hindi aktibong naghahati, kung saan bumaba ang mga selulang positibo sa Ki67 sa mga araw na 1 at 3, habang nanatiling buo ang nakatakdang pagdiferensiya tungo sa mga neuron. Doon, dumaan ang mekanismo sa pagsugpo sa pagsesenyas ng mTOR: nabawasan ang kabuuang mTOR at phosphorylated mTOR kasabay ng mas mababang ekspresyon ng p70S6K at 4EBP1, pati ng pagbaba ng ekspresyon ng mga cyclin na E1, B1, D1, at D2. Ang nangingibabaw na katangian ay ang hindi aktibong paghahati ng mga progenitor, na iniugnay ng mga may-akda sa pagkaantala ng pagtanda ng selula, hindi sa pagsagip sa mga selula ng hippocampus na nasa ilalim ng stress.

Walang pagkakasalungat sa dalawang papel. Ang AMPK at mTOR ay mga tagapag-ugnay ng mga senyas na sensitibo sa konteksto, hindi mga nakapirming switch. Maaaring gamitin ng isang selulang kahawig ng neuron na nasa ilalim ng stress ang AMPK nang walang nasusukat na pagpigil sa mTOR, habang maaaring tumugon ang isang progenitor na pinasisigla ng mitogen sa parehong compound sa pamamagitan ng pagpapabagal sa mekanismo ng paglaki na nakadepende sa mTOR. Ang uri ng selula, konteksto ng stress, konsentrasyon, at oras ng pagsukat ang nagpapasiya kung aling sangay ang nangingibabaw. Ito rin ang dahilan kung bakit kabilang sa parehong larawan ang mga epekto ng methylene blue sa enerhiya ng mitochondria at redox: gaya ng inilalarawan sa isang pagsusuri sa mga mekanismo ng proteksiyon sa mga neuron, kumikilos ang compound bilang alternatibong tagapagdala ng electron, nakikilahok sa pagsesenyas na antioxidant at pumipigil sa apoptosis, pumipigil sa MAO at NOS, at may kaugnayan sa pagpapanibago ng mitochondria sa pamamagitan ng biogenesis at autophagy. Ang autophagy ay isang sangay ng katangiang may maraming epekto, hindi ang buong kuwento.

Ano ang hindi ipinapakita ng mga eksperimento

Ginagaya ng pagkakait ng serum ang stress na kaugnay ng suporta sa selula at metabolismo sa isang kulturang pang-eksperimento. Hindi nito ginagaya ang pag-aayuno ng buong organismo: nananatili ang glucose, mga amino acid, at mga asin sa batayang medium, at walang gawi ng pagkain. Hindi maaaring gawing dosis para sa tao ang mga konsentrasyong mula 20 nM hanggang 5 μM sa kultura sa pamamagitan lamang ng aritmetika, dahil magkakaiba ang pagsipsip, pagkakabigkis sa protina, kalagayang redox, metabolismo, pag-iipon sa mga tisyu, at tagal ng pagkakalantad.

Wala pang pagsubok sa tao na idinisenyo upang ipakita ang autophagic flux na pinasimulan ng methylene blue sa mga pasyente. Nananatili ang ebidensiya sa mekanismo sa mga pag-aaral sa selula, ex vivo, at hayop, at inilalarawan pa rin ng mga pagsusuri bilang paunang yugto ang ebidensiya para sa paglalapat nito sa klinika. Kaya hindi ipinapakita ng mga pag-aaral na ito na ginagaya ng methylene blue ang pag-aayuno, pinahahaba ang buhay ng tao sa pamamagitan ng autophagy, o kinukumpleto ang autophagic flux sa utak ng tao. Kailangan ng sariling klinikal na ebidensiya ang mga pahayag na gumagaya ito sa pag-aayuno at nagpapahaba ng buhay, at hindi nagiging mga pagsubok sa autophagy ang mga pagsubok ng methylene blue sa tao para sa ibang indikasyon dahil lamang sa pagkakaugnay. Dapat basahin ang pananaliksik sa mga modelo ng stress dahil sa sustansiya at mahabang buhay nang isinasaalang-alang ang hangganang iyon.

Sa susunod na papel na babasahin mo, gamitin ang talaan nang sunod-sunod. Una, itanong kung aling sangay ang nagbago: AMPK, mTOR, o wala sa dalawa. Pagkatapos, itanong kung may kasamang pagsusuri sa flux ang resulta ng LC3 o kung nag-iisa lamang ito. Pagkatapos, suriin kung nawala ang benepisyo nang harangin ang landas, at sa anong paraan. Ang isang pag-aaral na sumasagot sa lahat ng tatlo ay may matibay na batayan para sa pahayag tungkol sa mekanismo. Ang sumasagot lamang sa una ay nagpakita ng senyas na nagpapahintulot sa proseso, at hindi pa naimamapa ang natitirang bahagi ng paglalakbay.