Methylene blue at mga selulang sumusuporta sa utak: mga astrocyte, microglia, at pamamaga

Ipagpalagay na nagsagawa ka ng dalawang eksperimento gamit ang parehong asul na tina at nakakuha ng dalawang nakahihikayat na resulta. Sa isang lalagyan, nabubuhay ang mga hugis-bituing selulang tagasuporta sa kabila ng pagkawala ng oxygen at glucose. Sa isa naman, napapanatili ng mga selulang pang-imyunidad ng utak ang kanilang kalmado at nagsasangang hugis sa kabila ng isang lason mula sa bakterya. Nakatutuksong pagsamahin ang dalawa sa iisang pahayag: pinapakalma ng tina ang pamamaga sa utak at pinoprotektahan ang utak. Sa mismong pagsasamang iyon dapat maghinay-hinay ang maingat na mambabasa.

May dalawang populasyon ng mga selulang tagasuporta ang utak na magkaiba ang tungkulin, at sinusuri ang methylene blue sa bawat isa gamit ang magkaibang pampasimula ng eksperimento. Ang mga astrocyte ay mga selulang sumusuporta sa metabolismo. Nasa pagitan sila ng mga daluyan ng dugo at mga neuron, nag-aalis ng sobrang glutamate, nagpapanatiling balanse ng potassium, nag-iimbak ng glycogen, at naghahatid ng panggatong sa mga neuron kapag biglang tumataas ang pangangailangan. Ang microglia naman ay ang mga tagapagbantay ng imyunidad na naninirahan sa utak. Nagpapatrolya sa tisyu ang kanilang maninipis na nakausling bahagi, nakakakita ng mga senyales ng bakterya at pinsala, at kapag may alarma, umuurong ang mga ito upang maging bilugang anyong parang amoeba na angkop sa paggalaw at paglulon ng materyal, habang naglalabas ng mga molekulang pansenyas. Hindi awtomatikong naaangkop sa kabilang populasyon ang resulta sa isa, at ang pagsukat na ginamit sa bawat kaso ang nagtatakda kung ano talaga ang naipakita.

Mga astrocyte sa ilalim ng metabolic stress: ang tiyempo ang mahalagang resulta

Nagsisimula ang eksperimento sa mga astrocyte sa pagkakait ng mga kailangan nila. Nagpalago ang mga mananaliksik ng mga astrocyte mula sa cortex ng mga bagong silang na daga, inalis ang glucose at halos lahat ng oxygen sa loob ng anim na oras, at pagkatapos ay ibinalik ang dalawa sa loob ng dalawampu't apat na oras—isang modelo sa laboratoryo ng stroke na sinusundan ng muling pagdaloy ng dugo. Nang may methylene blue sa yugto ng pagkakait, bumaba ang kaligtasan ng mga selula. Nang idagdag lamang ito sa yugto ng muling pagbibigay ng oxygen, sa 0.1 at 1 micromolar, makabuluhang tumaas ang kaligtasan ayon sa isang calcein assay para sa kakayahang mabuhay ng mga selula. Iniulat sa pag-aaral sa mga astrocyte ng daga ang pagkakaibang ito ayon sa tiyempo, kasama ng datos sa respirasyon.

Ang pagkakaibang iyon ang pinakamahalagang natuklasan. Sa panahon ng pagkakait, halos walang oxygen na tatanggap ng mga electron, kaya walang mapaghatiran ang isang tagapaglipat ng electron. Sa muling pagbibigay ng oxygen, muling umaandar ang mga mekanismo at may magagawa na ang tina. Mas maraming oxygen ang ginamit ng mga astrocyte na nilagyan nito, mas maraming glucose ang kinuha nila, mas maraming ATP ang ginawa, at muling nabuo ang kanilang imbakan ng glycogen, kasabay ng mas mataas na aktibidad ng hexokinase at walang pagtaas ng mitochondrial superoxide. Ang iminungkahing paliwanag ay ang pamilyar na paliwanag mula sa paglalahad tungkol sa methylene blue bilang tagapagdala ng electron sa mitochondria: inililipat nito ang mga electron lampas sa mga baradong punto sa kadena ng respirasyon upang maayos na magsimulang muli ang respirasyon, sa halip na tumagas ang mga electron at makabuo ng mga reaktibong kemikal.

Pansinin kung anong uri ng ebidensiya ito. Resulta ito tungkol sa kaligtasan at metabolismo sa isang nakahiwalay na uri ng selula, na may tinukoy na panahong epektibo ito—pagbangon, hindi pagkakait—at tinukoy na saklaw ng konsentrasyon. Wala itong sinasabi tungkol sa pagsesenyas ng imyunidad, at wala rin tungkol sa asal.

Microglia sa ilalim ng alarma mula sa bakterya: muling pagprograma ng metabolismo

Nagsisimula ang mga eksperimento sa microglia sa kabaligtarang pampasimula: hindi kakulangan sa sustansiya kundi isang huwad na impeksiyon. Ang lipopolysaccharide, isang piraso ng panlabas na lamad ng bakterya, ay kumakabit sa mga pandama ng likas na imyunidad at nagpapaniwala sa microglia na may dumating na mga pathogen, kahit walang buhay na bakterya. Sa mga dagang binigyan ng lipopolysaccharide at sa isang linya ng mga selulang microglia na pinalago sa laboratoryo, ang resulta ay isang pamilyar na programa ng pamamaga: tumataas ang mga salik na nagsusulong ng pamamaga, lumilipat ang microglia patungo sa agresibong estadong M1, namamatay ang mga kalapit na neuron, at mas mahina ang pagganap ng mga hayop sa mga gawain sa pagkatuto at memorya.

Iniuugnay ng pag-aaral sa mga daga ang tugong ito sa isang landas na nakadarama ng oxygen: pinasisigla ng lipopolysaccharide ang sobrang ekspresyon ng PHD3, isa sa tatlong enzyme na prolyl hydroxylase, sa pamamagitan ng isang naunang kadena ng Siah2/Morg1. Kasabay nito, muling pinoprograma ng mga selula ang paggamit nila ng enerhiya patungo sa aerobic glycolysis, na may mas mataas na antas ng mga reaktibong anyo ng oxygen sa mitochondria. Direktang sinukat ng mga may-akda ang pagbabagong ito gamit ang mga metabolic assay na Seahorse para sa pagkonsumo ng oxygen at pag-asim sa labas ng mga selula. Binaligtad ng methylene blue kapwa ang pagbabago sa metabolismo at ang sobrang ekspresyon ng PHD3, pinababa ang mga salik ng pamamaga, binawasan ang pagkamatay ng mga neuron, at pinahusay ang mga marka sa mga pagsusuri ng asal. Nagdagdag ang positron emission tomography ng ebidensiya mula sa pagkuha ng larawan: pinataas ng lipopolysaccharide ang pagkuha ng glucose sa hippocampus na nakita sa FDG-PET, at pinababa itong muli ng paggamot, na naaayon sa mas mahinahong metabolismo kaugnay ng pamamaga sa buhay na utak.

Mas malawak ang hanay ng mga pagsukat dito kaysa sa pag-aaral sa mga astrocyte—mga cytokine, metabolismo, pagkuha ng larawan, at asal ng mga hayop—ngunit ibang pampasimula at ibang selula ang pinag-aaralan nito. Dapat panatilihing magkahiwalay ng mga mambabasang naghahambing sa dalawa ang mga pampasimula: inililigtas ng isang pag-aaral ang mga selulang tagasuportang kulang sa sustansiya habang bumabangon, samantalang pinahihina ng isa ang huwad na alarma ng impeksiyon sa mga selulang pang-imyunidad.

Microglia sa ilalim ng mikroskopyo: hugis bilang sukatan

Sinusuri ng ikatlong eksperimento ang parehong alarma mula sa bakterya sa pamamagitan lamang ng hugis. Sa mga kulturang glial mula sa cortex ng daga, ang microglia sa pangkat na kontrol na kinulayan upang makita ang panandang IBA1 ay nagpapakita ng maraming maninipis na nakausling bahagi, ang nagsasangang anyong ginagamit sa pagbabantay. Pagkatapos ng dalawampu't apat na oras ng pagkalantad sa lipopolysaccharide sa 10 micrograms per milliliter, pumaplat ang mga selula tungo sa anyong parang amoeba, at lumalaki ang lawak ng katawan ng selula habang nananatiling halos pareho ang perimetro nito—ang heometrikong palatandaan ng pagbilog. Ang methylene blue sa 1 micromolar, na ibinigay kasabay ng lason, ay nagpapanatili sa mga nagsasangang nakausling bahagi at sa lawak at perimetro ng katawan na malapit sa mga halaga ng pangkat na kontrol. Sinukat ng pag-aaral sa mga kulturang mula sa daga ang pagpapanatiling ito ng hugis gamit ang lawak at perimetro ng katawan ng selula.

Dalawang detalye ang nagbibigay sa pag-aaral na ito ng higit na halaga kaysa sa isang simpleng larawan. Una, ang ginamit na panghambing na sangkap na menadione, isa pang molekulang aktibo sa redox sa parehong konsentrasyon, ay hindi nakapagpanatili ng hugis at, kahit mag-isa lamang, ay nagtulak sa mga selula patungo sa aktibong anyo. Kaya hindi pangkalahatang katangian ng lahat ng molekulang paulit-ulit na sumasailalim sa redox ang epektong ito. Ikalawa, iniuugnay ng mga may-akda ang epekto ng tina sa pag-activate ng Nrf2, isang programang pinamumunuan ng transcription factor na nasa likod ng mga gene na antioxidant at laban sa pamamaga, sa halip na sa direktang pagsalo lamang ng mga reaktibong kemikal. Inilalagay ng kaugnay na pagtalakay sa redox at pagsesenyas ng pamamaga ang ugnayang ito sa Nrf2 sa mas malawak na konteksto.

Gayunman, ang hugis ang may pinakamakitid na saklaw sa tatlong sukatan. Ang nagsasangang selula ay karaniwang isang selulang nagbabantay at ang bilugang selula ay karaniwang isang aktibong selula, ngunit ang morpolohiya ay isang di-tuwirang palatandaan, hindi isang tala ng ekspresyon ng gene. Walang mga selulang pang-imyunidad na mula sa dugo, walang mga sirkito ng neuron, at walang nasusukat na asal sa kulturang ito.

Magkatabing pagbasa sa tatlong resulta

Ang padron sa mga hanay ay may sariling pagsukat at sariling sagot ang bawat pampasimula. Sinasagot ng pagliligtas sa metabolismo ang isang tanong tungkol sa metabolismo. Sinasagot ng datos sa cytokine at asal ang isang tanong tungkol sa pamamaga. Sinasagot ng hugis ang isang tanong tungkol sa hugis. Wala sa tatlo ang kusang nagbibigay ng sagot sa ibang usapin.

Ano ang hindi pinatutunayan ng microgliang mukhang mas kalmado

Ito ang pangungusap na kailangan sa buong paksang ito: ang microgliang mukhang hindi gaanong aktibo, o ang nagbagong metabolismo ng microglia, ay hindi sa sarili nito patunay ng mas mahusay na paggana ng utak.

Maaaring magbago ang morpolohiya nang hindi sumusunod ang paggana. Maaaring mapanatili ng isang selula ang mga sanga nito habang naglalabas pa rin ng mga cytokine, o maging bilugan habang gumagawa ng kapaki-pakinabang na paglilinis ng mga labi. May kaparehong limitasyon ang mga sukat ng metabolismo: ipinapakita ng isang tala mula sa Seahorse o isang PET scan ang pagproseso ng enerhiya, hindi ang kakayahang mag-isip. Mas matibay ang pag-aaral sa daga na nagtambal ng mga sukat ng metabolismo at mga sukat na katulad ng sa hugis sa mga pagsusuri ng asal, dahil mismo sa pagsasama nito ng magkakaibang antas ng ebidensiya sa halip na iasa sa isang pagsukat ang konklusyon. Kahit doon, umiiral pa rin ang karaniwang mga limitasyon, dahil ang lipopolysaccharide ay modelo ng isang alarmang walang buhay na mikrobyo sa halip na isang tunay na impeksiyon, hindi tao ang mga daga, at mismong mga may-akda ang nagbibigay-diin sa mga pagkakaiba ng species. Sinumang nagpaplano ng kasunod na pananaliksik ay dapat magtimbang kung paano mailalapat sa magkakaibang modelo ang mga natuklasan sa microglia bago ipagpalagay na pareho ang takbo ng landas sa tisyu ng tao.

May praktikal na implikasyon din ito sa tiyempo. Sa resulta sa mga astrocyte, nakasasama ang maagang pagbibigay at nakabubuti ang pagbibigay habang bumabangon. Ang mga resulta sa microglia naman ay mula sa pagbibigay malapit sa oras ng pampasimula ng pamamaga. Sa totoong buhay, sabay na naghahalo ang dalawang yugto sa pinsala sa utak: kakulangan sa enerhiya at alarma ng imyunidad, na nagbabago sa paglipas ng mga oras. Hindi maitatakda ng eksperimentong naghihiwalay sa isang yugto ang iskedyul para sa pinagsamang kaso. Kaya pinananatiling magkahiwalay sa mga talakayan tungkol sa mga angkop na panahon ng pagbibigay ang mga takdang panahon ng pagkakait at pamamaga.

Kasya sa isang talata ang tapat na buod. Sa mga nakahiwalay na astrocyte, ang methylene blue na ibinigay habang muling binibigyan ng oxygen ay nagpapasimulang muli ng respirasyon at nagliligtas ng mga selula. Sa microgliang inilantad sa isang piraso ng bakterya, binabaligtad nito ang isang programang metaboliko na kaugnay ng pamamaga sa pamamagitan ng isang tiyak na landas ng PHD3 at pinananatili ang hugis habang nagpapahinga. Totoo ang bawat resulta sa loob ng kani-kaniyang kaayusan ng eksperimento, at alinman sa dalawa ay hindi pangkalahatang hatol tungkol sa pamamaga sa utak. Kapaki-pakinabang ang paghahambing sa mga selulang glial dahil mismo sa pagpigil nito sa dalawang kuwento na maghalo bilang iisa.