Bakit ginagamit ang methylene blue bilang pantulong na pangkulay sa acid-fast staining

Sinusuri ng isang teknisyan ang pahid ng plema matapos ang buong proseso ng pagkulay. Lantad ang mga pulang bacillus sa asul na larangan, at inilalabas ang ulat na may nakitang acid-fast bacilli. Kinabukasan, nagpapakita ang ibang slide ng pantay na asul na larangan na walang pulang bacillus, at iniuulat itong negatibo sa tuberkulosis. Ang isa sa mga ulat na ito ay nagpapahayag ng higit sa kayang patunayan ng slide, at hindi iyon ang una.

Ang kalituhan ay nasa konsepto. Itinuring ng teknisyan ang asul na pangkulay bilang bahagi ng kemistriya ng pagtukoy, na para bang tumulong ang methylene blue sa paghahanap ng mycobacteria. Hindi ito tumulong. Sa oras na madikit ang methylene blue sa slide, tapos na ang pagsubok. Kinukulayan lamang nito ang likuran upang mabasa ang resulta. Ipinapaliwanag ng artikulong ito ang layunin ng methylene blue sa acid-fast staining, kung bakit asul ito sa halip na ibang kulay, at kung anong mga konklusyon ang maaari mong mabuo mula sa pula sa asul na likuran.

Ang maikling sagot

Ang acid-fast staining ay isang pagsubok na naghihiwalay ng mga uri batay sa tatlong ideya. Ang carbol fuchsin, ang pangunahing pangkulay, ay ipinapasok nang sapilitan sa bawat selula, kabilang ang mycobacteria na may mala-waks na balot. Inaalis ng acid-alcohol, ang pantanggal ng kulay, ang pulang pangkulay sa mga karaniwang selula ngunit hindi nito maalis iyon sa mga acid-fast na selula. Pagkatapos, kinukulayan ng methylene blue, ang pantulong na pangkulay, ang lahat ng inalisan ng kulay, kaya nagiging asul ang mga hindi acid-fast na selula, mga selula ng host, at mga labi, habang nananatiling pula ang acid-fast bacilli. Ang pantulong na pangkulay ang nagbibigay ng pagkakaiba ng kulay. Wala itong papel sa kemistriyang dahilan kung bakit acid-fast ang isang selula.

Ang ginagawa ng bawat hakbang

Ipinapakita ng dayagram sa ibaba ang paghahati ng mga tungkulin. Basahin ito mula kaliwa pakanan bilang isang pamamaraan, at basahin ang hanay sa ibaba bilang paalala na magkakaibang tanong ang sinasagot ng bawat pangkat ng mga pamamaraan ng pagkulay.

Pagpasok muna ang unang hakbang. Hindi madaling mapasukan ng karaniwang mga pangkulay na nakatunaw sa tubig ang mycobacteria dahil lubhang hindi naaakit sa tubig ang balot nito, kaya ipinapasok nang sapilitan ng protokol ang pangkulay. Sa pamamaraang Ziehl-Neelsen, itinutulak ng init na lumilikha ng singaw ang carbol fuchsin na may phenol sa pamamagitan ng mala-waks na pader. Sa malamig na pamamaraang Kinyoun, pinapalitan ang init ng mas matapang na pormulasyon ng pangunahing pangkulay, at may ilang binagong bersiyong walang init na nagdaragdag ng mga surfactant. Magkatabing inilalahad ng mga protokol ng American Society for Microbiology para sa acid-fast stain ang dalawang pormulasyon, at malaki ang pagkakaiba sa konsentrasyon: humigit-kumulang 0.3 g ng basic fuchsin bawat 100 mL para sa pamamaraang may init kumpara sa mga 4 g para sa malamig na pamamaraan.

Paghihiwalay ang ikalawang hakbang. Ang acid-alcohol, na karaniwang 3 mL ng puro na hydrochloric acid sa 97 mL ng 95 porsiyentong ethanol, ay naghuhugas ng pulang pangkulay mula sa bawat selulang walang natatanging kakayahang lumaban ang pader. Pinananatili ng mga selulang may buo pang lipid na balot ng mycobacteria ang pangkulay. Ito ang hakbang na pinagbabatayan ng buong pamamaraan, at ang pinakasensitibo sa paraan ng pagsasagawa, gaya ng tinatalakay sa ibaba.

Pagkakaiba ng kulay ang huling hakbang. Mayroon na ngayong mga pulang acid-fast na selula sa slide, sa halos walang kulay na likurang binubuo ng mga selulang inalisan ng pangkulay. Ibinabalik ng methylene blue na 0.3 porsiyento w/v ang pagkakakita sa likurang iyon gamit ang kulay na lubhang naiiba sa pula. Maikli lamang ang paglalagay ng pantulong na pangkulay, karaniwang 20 hanggang 30 segundo sa pamamaraang may init at hanggang ilang minuto sa ilang bersiyon ng malamig na pamamaraan. Nakadepende sa protokol ang tagal, sa halip na sa isang katangian mismo ng pangkulay.

Bakit ang pangkulay na ito, at bakit asul

Ang methylene blue ay isang kationikong basikong pangkulay, na nangangahulugang may positibong karga ang may-kulay nitong ion at kumakapit ito sa mga ibabaw na may negatibong karga ng mga bakterya, selula ng host, at mga labing inalisan ng kulay. Inilalarawan ng OpenStax Microbiology ang lohikang ito ng karga bilang pangkalahatang prinsipyo ng mga basikong pangkulay. Ngunit hindi natatangi rito ang kemistriya ng methylene blue. Mga basikong pangkulay din ang crystal violet at safranin. Batay sa nakikita ang pagpili, hindi sa kemistriya.

Kailangan ng mga pulang bacillus ng likurang may naiibang kulay, at ang asul ang pinakakapaki-pakinabang na katapat ng pula para sa mikroskopyang may maliwanag na larangan. Hindi angkop na pantulong na pangkulay ang safranin dahil masyadong malapit ang huling rosas-pulang kulay nito sa nanatiling carbol fuchsin, kaya nawawala ang mismong pagkakaibang nilikha ng pamamaraan. Magbibigay naman ang crystal violet ng madilim na lilang likuran na makikipag-agawan ng pansin sa maninipis na pulang bacillus. Ang pinakamatibay na ebidensiyang pagkakaiba ng kulay, sa halip na kemistriya, ang tungkulin nito ay ang pagpapalit: ginagamit sa ilang protokol sa beterinarya at mga binagong protokol ang mga berdeng pantulong na pangkulay gaya ng malachite green at brilliant green, at gumagana pa rin ang pagsubok dahil ginagampanan ng anumang malinaw na naiibang kulay ang parehong tungkulin.

May dalawang praktikal na implikasyon ito. Una, walang itinatakdang pagsasaayos ng pH sa karaniwang resipe; huwag ipagkamali ang simpleng 0.3 porsiyentong solusyong ito sa tubig sa mga alkalinong pormulasyon gaya ng methylene blue ni Loeffler, na kabilang sa ibang konsepto ng pagkulay. Ikalawa, nakasasama ang labis na pagkulay. Partikular na nagbababala ang literatura sa histolohiya na maaaring matakpan ng sobrang matingkad na asul na likuran ang kakaunting bacillus, kaya walang pakinabang ang pagbabad ng slide nang mas matagal kaysa sa pinapahintulutan ng protokol, at nababawasan lamang ang linaw ng pagbasa.

Ang kemistriya ng pader na nagpapagana sa pagsubok

Nasa balot ng mycobacteria ang dahilan kung bakit nakapaghihiwalay ang acid-alcohol. Ang pangunahing balangkas nito ay ang mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan complex: peptidoglycan na nakakabit sa arabinogalactan, na ang mga panlabas na dulo ay may mga mycolic acid na napakahaba ng kadena. Bumubuo ang mga ito ng panlabas na mycomembrane na mayaman sa lipid at may lubhang mababang kakayahang magpadaan ng mga sangkap. Detalyadong inilalarawan ng pagsusuri sa panlabas na lamad ng mycobacteria ang estrukturang ito. Gumagana sa parehong direksiyon ang harang. Nilalabanan nito ang pagpasok ng pangkulay, kaya kailangan ng init o mas matapang na pangunahing pangkulay para makapasok. Nilalabanan din nito ang pagkuha ng pangkulay palabas, kaya hindi maalis ng acid-alcohol ang carbol fuchsin kapag nasa loob na ito. Walang ganitong balot ang mga karaniwang bakterya at nawawala sa mga ito ang pangkulay. Kaya mas angkop unawain ang pagiging acid-fast bilang epekto ng isang lipid na harang, hindi bilang kemikal na pagkapit ng fuchsin sa mycolic acid.

Ipinapaliwanag din ng kemistriyang ito ang isang karaniwang palaisipan: mahina at hindi mahulaan ang pagkulay ng mycobacteria gamit ang pamamaraang Gram, at kung minsan ay lumilitaw itong malalabong anyong parang magkakadugtong na butil o mga aninong walang kulay. Nililimitahan ng pader nitong hindi naaakit sa tubig ang pagpasok ng crystal violet. Hindi isang binagong Gram stain ang acid-fast staining. Ibang prinsipyo ito ng paghihiwalay na nakabatay sa ibang katangian ng pader, gaya ng ipinapakita ng paghahambing ng simpleng pagkulay at Gram stain para sa dalawa pang pamamaraan.

Tatlong pamamaraan, tatlong tanong

Para sa mas malawak na pangkat ng mga pamamaraang gumagamit ng iisang pangkulay sa bakterya, tingnan ang atlas ng pagkulay para sa mikroskopya.

Ang hindi mapatutunayan ng pula sa asul na likuran

Ang mga pulang bacillus ay nangangahulugang napanatili ng mga organismo ang carbol fuchsin sa kabila ng acid-alcohol. Tugma ang natuklasang iyon sa Mycobacterium tuberculosis, ngunit malinaw na sinasabi ng gabay ng CDC sa diyagnosis ng tuberkulosis na acid-fast din ang ibang mycobacteria. Kaya kailangan ang kultura at pagsusuri ng nucleic acid upang matukoy ang species, hindi ang kulay.

Karaniwang nagaganap ang mga pagkakamali sa paraan ng pagsasagawa sa dalawang hakbang ng paghuhugas. Kapag kulang ang pagtanggal ng kulay, nananatiling pula ang mga materyal sa likuran at maaaring humantong sa maling positibong pagbasa. Kapag sobra naman ang pagtanggal ng kulay, naaalis ang pangunahing pangkulay na mahina ang pagkakapanatili at maaari itong mag-ambag sa mga maling negatibo. Kapag labis ang pantulong na pangkulay, natatabunan sa asul ang kakaunting bacillus. Nagdaragdag din ng kani-kanilang artipakto ang makakapal na pahid, mga reagent na may namuo, at kontaminadong tubig na pangbanlaw.

Nalilimitahan ng dami ng organismo ang sensitibidad, gaano man kaayos ang paraan ng pagsasagawa. Kailangan ng karaniwang mikroskopya ng pahid ang humigit-kumulang 5,000 hanggang 10,000 bacilli bawat milliliter ng plema, at sa mga mas lumang pagsusuri ng ebidensiya ng CDC, nasa mga 45 hanggang 80 porsiyento ang sensitibidad ng pahid sa mga kasong tuberkulosis sa baga na nakumpirma sa kultura. Kaya hindi kailanman naaalis ng negatibong pahid ang posibilidad ng tuberkulosis. Sa kasalukuyang gabay ng CDC, isinasagawa ang kultura kasabay ng bawat pahid at inirerekomenda ang pagsusuring nagpaparami ng nucleic acid sa hindi bababa sa isang ispesimen mula sa sistemang panghinga kapag isinasaalang-alang ang tuberkulosis sa baga at mababago ng resulta ang pangangasiwa sa pasyente.

Ang praktikal na gawain ay dapat sumunod sa mga awtorisadong protokol

Ang mga paglalarawang para sa pagtuturo, kabilang ang artikulong ito, ay hindi nagbibigay ng pahintulot para sa klinikal na gawain. Para sa praktikal na gawain sa laboratoryo, sundin ang napatunayang wastong pamantayang pamamaraan ng laboratoryo na nakaayon sa kasalukuyang mga dokumento ng CDC, APHL, o CLSI; ipinapakita ng sanggunian ng CDC sa acid-fast staining na nasa arkibong Stacks nito kung paano itinatakda ng mga ganitong pamamaraan ang mga reagent at pagbasa ng resulta. Nangangailangan ng mga hakbang upang pigilan ang pagkalat ng materyal ang paghawak ng mga ispesimen para sa tuberkulosis: inihahanda ang mga pahid sa isang kabinet para sa biyolohikal na kaligtasan dahil lumilikha ng mga aerosol at talsik ang paghahanda. Sinasabi rin ng gabay ng CDC sa kaligtasan sa laboratoryo na kahit ang mga pahid na pinirmi gamit ang init ay maaaring may buhay na bacilli ng tuberkulosis at dapat pa ring hawakan bilang kontaminado. Ang tala sa CDC Public Health Image Library tungkol sa pahid na may carbol-fuchsin at methylene blue na sinuri para sa M. leprae ay isang kapaki-pakinabang na paalala na ginagamit ang pamamaraan hindi lamang para sa tuberkulosis: nagsisilbi ang parehong pagkakaiba ng pula sa asul saanman hinahanap ang mga acid-fast na organismo, at ang maingat na negatibong pagbasa ay isa ring resultang nararapat itala.

Pagbasa sa natapos na slide

Nagiging mahalaga ang pantulong na pangkulay sa paunang pagsusuri. Unang ginagamit ng tagasuri sa mikroskopyo, habang nag-i-scan sa mababang pagpapalaki, ang asul na likuran upang suriin ang kalidad ng pahid: pantay na pagkakakalat ng mga selula, buo ang mga selula ng host na magagamit sa pagtutok, at walang makapal na namuong materyal. Pagkatapos, nakaaakit ng pansin ang mga pulang posibleng bacillus dahil walang ibang pula sa slide. Ginagawa ang pagkumpirma sa ilalim ng oil immersion, kung saan ipinapakita ng mga tunay na bacillus ang inaasahang maninipis na hugis-patpat, na kung minsan ay bahagyang kurbado o parang magkakadugtong na butil, sa halip na magkakaparehong labi ng pangkulay.

Itinatakda rin ng pagkulay sa likuran ang pananalita sa ulat. Ang slide na may pulang bacilli ay iniuulat bilang may nakitang acid-fast bacilli, kadalasang may bahagyang kuwantitatibong antas ayon sa sukatan ng laboratoryo. Ang slide na walang pulang organismo ay iniuulat bilang walang nakitang acid-fast bacilli, hindi kailanman bilang negatibo sa tuberkulosis. Mahalaga ang pagkakaibang ito dahil pinatutunayan ng asul na larangan na gumana ang pagkulay, tumanggap ng pantulong na pangkulay ang mga selula, at sapat ang mga optika, ngunit wala itong sinasabi tungkol sa mga organismong mas kaunti kaysa sa limitasyon ng pagtukoy. Ang asul na larangang walang nakikitang bacillus ay isang wastong resulta tungkol sa slide, hindi isang hatol tungkol sa pasyente.

Tandaan ang paghahati ng mga tungkulin at magiging malinaw ang pagsulat ng mga ulat. Tinutukoy ng carbol fuchsin ang mga posibleng acid-fast na organismo. Isinasagawa ng acid-alcohol ang pagsubok. Ginagawa lamang ng methylene blue na malinaw ang sagot: napanatili ng pula ang pangkulay sa kabila ng asido, nawala naman ito sa asul. Ang lahat ng iba pa—species, dami ng organismo, at klinikal na kahulugan—ay nagmumula sa gawaing lampas sa slide.